哺乳細胞蛋白表達案例_第1頁
哺乳細胞蛋白表達案例_第2頁
哺乳細胞蛋白表達案例_第3頁
哺乳細胞蛋白表達案例_第4頁
免費預覽已結束，剩余1頁可下載查看

下載本文檔

版權說明：本文檔由用戶提供并上傳，收益歸屬內容提供方，若內容存在侵權，請進行舉報或認領

文檔簡介

1、哺乳細胞蛋白表達案例哺乳細胞蛋白表達案例1. 實驗目的以客戶提供的目的蛋白基因構建表達載體，通過哺乳表達體系獲得目的蛋白X。2. 實驗設計（1）分析客戶提供的目的蛋白序列，設計蛋白表達方案；（2）選擇鐘鼎特色載體pAZ-V5，構建表達質粒pAZ-V5-X；（3）轉染293F細胞進行蛋白表達，通過Western Blot檢測蛋白X是否表達；（4）通過Ni柱純化獲得目的蛋白X，SDS-PAGE檢測純化蛋白純度，BSA方法測定蛋白濃度。3. 蛋白分析（1）經EditSeq翻譯目的蛋白X序列：m.w.=39.27kd，pI=8.52（2）經UniProt匹配，蛋白X物種來源：草魚（3）目的基因稀有密碼

2、子分析及蛋白結構分析目的基因稀有密碼子分析蛋白親疏水分析 蛋白跨膜結構域分析 蛋白信號肽預測分析結果：目的基因不含哺乳表達體系稀有密碼子。目的蛋白整體呈親水性、無跨膜結構域、無信號肽序列。結論：將目的基因構建在鐘鼎特色載體pAZ-V5上，利用載體自帶信號肽分泌表達，并在目的蛋白C端添加His標簽便于純化。4. 表達載體構建4.1 pAZ-V5-X質粒酶切驗證：鐘鼎特色載體pAZ-V5酶切鑒定Marker: 250,500,750,1000,1500,2000,2500,3000,4000,5000,6000,8000,12000Line1:酶切前質粒Line2: 酶切后質粒基因名稱：X（OD2

3、60/OD280:1.82）酶切位點：EcoRI/BamHI4.2 pAZ-V5-X質粒測序驗證：部分序列比對結果圖5. 蛋白表達及純化純化蛋白Western Blot鑒定分析M: 蛋白質分子質量標準1: 純化蛋白蛋白表達 Western Blot鑒定分析M: 蛋白質分子質量標準1: 細胞裂解上清2: 細胞上清3: 細胞裂解上清（陰性）4: 細胞上清（陰性）純化蛋白X SDS-PAGE膠灰度值分析 純化蛋白X SDS-PAGE(reduced)分析M: 蛋白質分子質量標準1: 純化蛋白6. 蛋白內毒素檢測凝膠半定量試驗：平行管供試品稀釋倍數陰性對照陽性對照反應終點稀釋倍數Log10平均值Log10-11:21:41:81:161:321:641+-+1:2（0.5）-0.301-0.3010.5（1：2）2+-+1:2（0.5）-0.301純化蛋白內毒素濃度=鱟試劑靈敏度×反應終點稀釋倍數的幾何平均值 =0.03EU/ml×2=0.06EU/ml7. 實驗結論目的蛋白X在293F細胞中得到表

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明，都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等，如果需要附件，請聯系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙，網頁內容里面會有圖紙預覽，若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業或盈利用途。
  • 5. 人人文庫網僅提供信息存儲空間，僅對用戶上傳內容的表現方式做保護處理，對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯，并不能對任何下載內容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容，請與我們聯系，我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論