1、第五節(jié)第五節(jié) 乙肝五項指標(biāo)檢測乙肝五項指標(biāo)檢測 （ELISA雙抗體夾心法）雙抗體夾心法）一、目的和要求一、目的和要求掌握乙肝五項指標(biāo)檢測的掌握乙肝五項指標(biāo)檢測的ELISA方法。方法。二、內(nèi)容二、內(nèi)容（一）原理（一）原理 乙型肝炎的微生物學(xué)檢查中以抗原抗體檢測最常用，其中尤以酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）為主，采用雙抗體夾心法（一步法）。如乙肝表面抗原（HBsAg）檢測：包被馬抗-HBs的單克隆抗體于微孔板上，血清標(biāo)本中HBsAg與其結(jié)合后，再加入辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的抗-HBs，結(jié)果形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加入酶的底物后使底物顯色。（二）材料（二）材料1.疑似乙型肝炎患者待檢血清

2、。2.檢測HBV“兩對半”血清標(biāo)志（HBsAg）的ELISA試劑盒：包被有相應(yīng)抗體或抗原的反應(yīng)條，酶結(jié)合物，陽性與陰性對照，洗滌液，顯色劑A、B，終止液。（三（三）操作方法）操作方法參照所購試劑盒的操作說明書進(jìn)行1.乙肝表面抗原（HBsAg）檢測（1）每孔加待測血清50l，每板設(shè)HBsAg陽性、陰性及空白對照各一孔；再向每孔加入酶結(jié)合物50l（空白孔不加），用不干膠封孔后，37水浴30min。（2）棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿每孔，棄去拍干，反復(fù)5次。（3）每孔加顯色劑A、B各一滴，37孵育10min后加終止液一滴（2mol/L H2SO4，50l），終止反應(yīng)。結(jié)結(jié)果判斷：果判斷：（1）目測法：

3、陽性對照呈藍(lán)色、陰性及空白對照為無色，以此為依據(jù)來判斷標(biāo)本孔。（2）比色法：以空白孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀測492 nm吸光度，讀取各孔A值，以標(biāo)本吸光度A值/陰性對照吸光度A值 2.1者判為陽性。2.乙型肝炎病毒表面抗體（抗-HBs）、e抗原（HBeAg）檢測 取出相應(yīng)檢測試劑盒中的包被板（或條） 進(jìn)行同1的操作，結(jié)果觀察亦同1（略）。3.乙型肝炎病毒核心抗體（抗-HBc）、e抗體（抗-HBe）檢測（1）抗-HBc檢測 先用生理鹽水將待測血清作1:30稀釋，然后取50l加入相應(yīng)的包被板（或條）中，同時設(shè)陽性、陰性及空白對照各一孔（對照血清不必稀釋）；再向每孔加入酶結(jié)合物50l（空白孔不加），再進(jìn)行同1的操作。但結(jié)果觀察需反看：目測法是以不顯色（無色）孔為陽性；比色法是以標(biāo)本吸光度A值0.5N（陰性對照值）為陰性，標(biāo)本吸光度A值0.5N者判為陽性。（2）抗-HBe檢測 取出相應(yīng)的包被板（或條），每孔加待測血清50l，同時設(shè)立對照，每孔加中和試劑50l（試劑盒中配備），再加入酶結(jié)合物50l（空白孔不加），然后進(jìn)行同抗-HBc檢測的操作過程，結(jié)果觀察亦同抗-HB