1、血管性癡呆大鼠腦內超微結構變化及生長抑素和nNOS的表達                          作者：宋志宇 盧宏 孫玉華 魏建科 譚巖 方艷秋【摘要】  目的 研究血管性癡呆(VD)大鼠生長抑素(SS)、一氧化氮合酶(nNOS)的變化，探討兩者與認知功能的關系。方法 將30只1415 w齡大鼠隨機分為假手術組(SOG)和模型組(MDG

2、)，MDG組采用雙側頸總動脈絲線結扎方法，制備慢性前腦缺血動物模型，SOG組僅分離雙側頸總動脈，但不阻斷血流。應用水迷宮實驗測試大鼠空間學習記憶能力，應用透射電鏡觀察大鼠神經元超微結構變化，應用免疫組化方法檢測海馬及顳葉皮層SS及nNOS的表達情況。結果 水迷宮實驗中MDG組大鼠的逃避潛伏期(69.70±4.77)s較SOG組(12.93±2.77)s明顯延長(P<0.05)，MDG組大鼠的跨平臺次數(1.80±1.31)較SOG組(8.33±1.30)明顯減少(P<0.05)。透射電鏡觀察，海馬神經元高度水腫，核固縮或崩解，線粒體腫脹。免疫

3、組化結果表明，海馬區SS的表達MDG組(3.07±1.44)較SOG組(13.73±1.87)明顯下降(P<0.05)，顳葉皮層區SS的表達MDG組大鼠(2.73±0.96)較SOG組(12.93±1.67)明顯下降(P<0.05);海馬區nNOS的表達MDG組大鼠(29.60±2.03)較SOG組(9.33±1.63)明顯增加(P<0.05)，顳葉皮層區nNOS的表達MDG組大鼠(28.87±2.47)較SOG組(8.40±1.64)明顯增加(P<0.05)。結論 VD大鼠學習記憶能力降低

4、，腦內超微結構變化明顯，腦內SS表達水平下降、nNOS表達水平增高。 【關鍵詞】  血管性癡呆;水迷宮實驗;透射電鏡;生長抑素;一氧化氮合酶【Abstract】 Objective To study the changes of the somatostatin (SS), nitric oxide synthase (nNOS) of thevascular dementia (VD) rats, and to explore the relationship between them and the cognitive function. Methods 30 1415month

5、old rats were randomly divided into sham operation (SOG) and model groups (MDG), MDG group was ligated bilateral carotid artery by thread to prepare for the animal model of the chronic front cerebral ischemia. SOG group was only separated bilateral main carotid artery, but was not blocked the blood

6、flow. Water maze test was used to test the abilities of spatial learning and memory of the rats. The transmission electron microscope was used to observe ultrastructural changes in rat neurons; immunohistochemical method was adopted to detect the SS and nNOS expressions in hippocampus and temporal c

7、ortex. Results In the water maze test, the escape latency of the MDG rats (69.70±4.77)s was significantly longer than that of SOG group (12.93±2.77)s, P<0.05，the number of crossplatform of MDG rats (1.80±1.31) was decreased significantly compared with that in SOG group (8.33±1

8、.30), P<0.05. TEM observation showed that there was high degree of edema in hippocampal neurons, karyopyknosis or collapse, and mitochondrial swelling. Immunohistochemistry results showed that the expression of SS in hippocampus was decreased significantly in MDG group(3.07±1.44)compared wit

9、h that in SOG group (13.73±1.87), P<0.05, the expression of SS in temporal lobe was decreased significantly in MDG group(2.73±0.96)compared with that in SOG group (12.93±1.67), P<0.05 , the expression of nNOS in hippocampus was increased significantly in MDG group(29.60±2.0

10、3)compared with that in SOG group (9.33±1.63), P<0.05, the expression of nNOS in temporal lobe was increased significantly in MDG group(28.87±2.47)compared with that in SOG group (8.40±1.64), P<0.05. Conclusions The abilities of learning and memory of VD rats with are reduced, a

11、nd the ultrastructure in the brain are significantly changed, the level of SS in the brain is decreased, the nNOS expression is increased.     【Key words】 Vascular dementia;Water maze test;Transmission electron microscopy; Somatostatin;Nitric oxide synthase 血管性癡呆(vascular dementi

12、a，VD)發病機制尚不十分清楚，目前尚無有效方法和藥物控制病程進展。根據文獻報道，大鼠雙側頸總動脈結扎能造成大鼠明顯的學習記憶障礙1。本文通過雙側永久性結扎老齡大鼠頸總動脈，建立VD動物模型，觀察VD大鼠學習記憶能力、海馬神經元的結構以及海馬、顳葉皮層生長抑素(SS)及一氧化氮合酶(NOS)陽性細胞的表達情況，探討VD的發病機制。1 材料與方法1.1 動物模型的制備 SD大鼠30只，體重約450550 g，1415 w，由河南省實驗動物中心提供。將SD大鼠隨機分為模型組(MDG)及假手術組(SOG)。MDG組根據Olsson方法2，術前12 h禁食、6 h禁水。10%水合氯醛(0.30 ml/

13、100g)腹腔注射麻醉，頸前部去毛，消毒后沿腹側頸正中切開，氣管旁分離出雙側頸總動脈，以“0”號線雙重結扎頸總動脈。SOG組動物行頸前切開，分離但不結扎頸總動脈。1.2 大鼠空間學習記憶能力測試(Morris水迷宮)3 分為定位航行實驗及空間搜索實驗兩部分。定位航行實驗：實驗歷時5 d，第1天讓大鼠自由游泳2 min;從第2天起，每天分上、下午兩段，每段訓練4次，每次訓練間隔為60 s。訓練時隨機選擇一個入水點，將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠尋找并爬上平臺時所需時間(即潛伏期)。如果大鼠在120 s內未找到平臺，須將其引至平臺，這時潛伏期計為120 s。空間搜索實驗：在第5天最后一次訓練后撤

14、除水下平臺，在同一入水點將大鼠面向池壁放入水中，測其在120 s內跨過原平臺相應位置的次數。術后61 d按上述方法進行學習記憶測試，按癡呆標準以假手術組大鼠逃避潛伏期的平均值作為參考值，計算VD大鼠逃避潛伏期的平均值與參考值之差占該鼠逃避潛伏期的比值，若該值大于20%為癡呆鼠。1.3 電鏡標本的制備 大鼠斷頭處死后，參照大鼠腦圖譜，迅速切取右側海馬區組織塊，迅速放入4預冷的4%戊二醛中固定，常規脫水、Epon812環氧樹脂包埋，LKB超薄切片,醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色，應用日立H7500型透射電鏡觀察。1.4 免疫組化試劑及方法 SS兔抗大鼠多克隆抗體、神經元型NOS (nNOS)兔抗大鼠

15、多克隆抗體、免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化物酶(SP)試劑盒(均購自武漢博士德生物工程有限公司)，采用SP免疫組化技術，實驗步驟按試劑盒說明進行操作。將石蠟包埋組織連續4 m切片，常規二甲苯脫臘，梯度酒精水化，進行微波抗原修復，PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性切片作陽性對照。在海馬CA1區及顳葉皮層，分區選擇3個相鄰視野，在400倍光鏡下作免疫反應陽性神經元計數，結果取3個視野的平均值。1.5 統計學處理 實驗數據以x±s表示，組間比較采用t檢驗，所有數據采用運用SPSS11.5醫學統計學軟件處理。2 結 果2.1 行為學測試 應用水迷宮實驗，對兩組大鼠學習記憶成績進行比較，

16、結果表明MDG組大鼠的逃避潛伏期較SOG組明顯延長(P<0.05)，MDG組大鼠的跨平臺次數較SOG組明顯減少(P<0.05)，見表1，說明VD大鼠學習記憶能力降低。表1 水迷宮試驗中小鼠的學習和記憶成績與SOG組比較：1)P<0.05，下表同2.2 透射電鏡觀察 SOG組可見神經元核膜完整，細胞器結構正常，線粒體結構清晰，可見溶酶體、粗面內質網。MDG組可見神經細胞高度水腫，細胞核變性，核固縮或崩解;線粒體腫脹，嵴的雙層膜結構不清、斷裂、萎縮，重者線粒體高度空泡化，正常線粒體少見;粗面內質網嚴重脫顆粒。見圖1。2.3 海馬區及顳葉皮層區SS、nNOS陽性細胞表達情況 免疫組

17、化結果表明，與SOG組比較MDG組SS的表達明顯下降(P<0.05)，nNOS的表達明顯增加(P<0.05)，見表2、圖2。表2 海馬區及顳葉皮層區SS、nNOS陽性細胞表達情況     3 討 論智能障礙是VD的主要癥狀，其中學習記憶能力減退尤為明顯。本研究行為學結果顯示，MDG組的逃避潛伏期明顯延長，跨越平臺次數也明顯減少，表明VD大鼠學習記憶能力降低，與文獻報道一致1。本研究透射電鏡觀察MDG組可見神經細胞高度水腫，細胞核變性，核固縮或崩解;線粒體腫脹，嵴的雙層膜結構不清、斷裂、萎縮，重者線粒體高度空泡化，正常線粒體少見;粗面內質網嚴重

18、脫顆粒。結果顯示，MDG組大鼠行為障礙的程度與海馬神經元變性、水腫程度平行。SS為從下丘腦分離出來的能抑制生長激素分泌的14氨基肽，具有激素和神經遞質的雙重作用。作為一種神經遞質廣泛分布于中樞神經系統和外周組織，參與了學習和記憶的過程，其含量降低與癡呆存在明顯相關性。早期研究發現癡呆者皮質、基底核、邊緣系統SS含量明顯降低。國外文獻報道多梗塞性癡呆(MID)患者CSF中SS降低與癡呆程度呈正相關4，還有人認為SS神經元的損害可能是癡呆神經遞質發生紊亂的最早啟動環節5。本研究結果顯示MDG組在海馬區及顳葉皮層區SS陽性細胞表達明顯減少，證實SS表達減少與VD大鼠的學習記憶功能減退有密切關系，提示

19、SS參與了VD的病理過程，與文獻報道一致6。SS在VD發病機制中的作用尚不清楚，有學者認為SS調控學習和記憶的途經可能與直接興奮SS能神經元引起鈣離子內流增加有關;此外，也可能由于SS能神經元和膽堿能神經元相距很近，SS可促進乙酰膽堿釋放從而影響學習和記憶功能。NO是一種血管活性物質，在中樞神經系統內具有保護和毒性雙重作用，外源性或內源性的NO過量產生或釋放時具有神經毒性，其與學習記憶的關系集中表現為NO在小腦、海馬長時程突觸增強(LTP)中的作用。腦內NOS至少有3型7：在神經元表達的nNOS，在神經膠質細胞(星形膠質細胞、小膠質細胞和少突膠質細胞)表達的誘導型NOS (iNOS )和內皮細胞表達的內皮型NOS(eNOS)。在缺血性腦損傷中3種不同的NOS 催化產生的NO起著不同的作用，其中nNOS催化產生NO參與腦缺血后神經元損傷。nNOS是一種鈣依賴性NOS，其活性受細胞內Ca濃度的影響，在正常生理情況下催化產生的NO作為中樞神經系統細胞間信使分子，可促進LTP的形成，在學習記憶機制中具有重要作用。腦缺血時谷氨酸釋放增加，使NMDA受體依賴的Ca通道過度激活，大量Ca內流并與CaM結合，當神經元內Ca濃度達0.11 mol/L時，受到CaCaM直接調節的NOS被大量激活，導致合成過量的NO,產生神經毒性作用。Huang等8實驗確定了nNO