1、實驗一實驗一 細菌的形態細菌的形態結構觀察和染色結構觀察和染色目目 的的 要要 求求u觀察細菌菌落的特征。觀察細菌菌落的特征。u掌握簡單染色法和革蘭氏染色法的原理掌握簡單染色法和革蘭氏染色法的原理及操作步驟。及操作步驟。u在油鏡下觀察細菌個體的形態在油鏡下觀察細菌個體的形態。u了解了解幾種細菌的特殊染色方法，包括芽幾種細菌的特殊染色方法，包括芽孢、莢膜及鞭毛染色。孢、莢膜及鞭毛染色。 u了解環境微生物的檢查。了解環境微生物的檢查。奧林帕斯奧林帕斯( (OLYMPUS) )雙筒生物顯微鏡雙筒生物顯微鏡鏡筒鏡筒物鏡轉換器物鏡轉換器載物臺載物臺載物臺調節紐載物臺調節紐粗調節器粗調節器細調節器細調節器

2、電源電源光強調節鈕光強調節鈕孔徑光闌孔徑光闌視場光闌視場光闌雙筒目鏡雙筒目鏡攝像頭攝像頭物鏡物鏡鏡座鏡座鏡臂鏡臂熒光發射裝置熒光發射裝置奧林帕斯生物顯微鏡的使用方法奧林帕斯生物顯微鏡的使用方法1.1.接通電源。接通電源。2.2.打開主開關。打開主開關。3.3.轉動光強調節鈕，使亮度適中。轉動光強調節鈕，使亮度適中。4.4.把標本固定在載物臺上。把標本固定在載物臺上。5.5.用低倍物鏡，旋轉粗調和微調用低倍物鏡，旋轉粗調和微調來進行對焦。來進行對焦。6.6.調節雙目鏡筒間距和視度差。調節雙目鏡筒間距和視度差。7.7.再適當調節照明度。再適當調節照明度。8.8.使焦點正確地對準標本。使焦點正確地對

3、準標本。8.8.調節孔徑光闌。調節孔徑光闌。9.9.依次用低、中、高倍鏡觀察。依次用低、中、高倍鏡觀察。10.10.油鏡觀察：高倍鏡下找到清晰的物象后，油鏡觀察：高倍鏡下找到清晰的物象后，下降載物臺，在標本中央滴一滴香柏油，下降載物臺，在標本中央滴一滴香柏油，使油鏡鏡頭浸入香柏油中，再細調至看使油鏡鏡頭浸入香柏油中，再細調至看清物象為止。清物象為止。11.11.換片：另換新片，必須從第換片：另換新片，必須從第9 9條開始操條開始操作。作。 12.12.觀察完畢，下降載物臺，取下載物臺上觀察完畢，下降載物臺，取下載物臺上的載玻片，將的載玻片，將4 4的目鏡對準載物臺，的目鏡對準載物臺，再用擦鏡紙

4、擦去鏡頭上的油，然后用擦再用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后用擦鏡紙沾取少量乙醇鏡紙沾取少量乙醇/ /水擦去殘留的油，水擦去殘留的油，最后用擦鏡紙擦去殘留的乙醇最后用擦鏡紙擦去殘留的乙醇/ /水。水。13.13.用畢復原：先將電壓調節旋鈕復原，關用畢復原：先將電壓調節旋鈕復原，關閉主開關，切斷電源。閉主開關，切斷電源。顯微鏡保養和使用中的注意事項顯微鏡保養和使用中的注意事項1.1.不準擅自拆卸顯微鏡的任何部件不準擅自拆卸顯微鏡的任何部件, ,以免損壞。以免損壞。2.2.鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度。鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度。3.3.觀察標本時，必須依次

5、用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。當觀察標本時，必須依次用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。當目視目鏡時，特別在使用油鏡時，切不可使用粗調節器，以目視目鏡時，特別在使用油鏡時，切不可使用粗調節器，以免壓碎玻片或損傷鏡面。免壓碎玻片或損傷鏡面。4.4.光強要適中，太亮不僅損傷燈泡壽命，也對眼睛有一定的傷光強要適中，太亮不僅損傷燈泡壽命，也對眼睛有一定的傷害，并且無法進行圖像采集。害，并且無法進行圖像采集。5.5.觀察時，兩眼睜開，養成能夠用兩眼觀察的習慣，使兩眼同觀察時，兩眼睜開，養成能夠用兩眼觀察的習慣，使兩眼同時聚焦。時聚焦。6.6.觀察臨時制片時，不要讓玻片中的水分流到載物臺上，更不觀察臨時制片時，

6、不要讓玻片中的水分流到載物臺上，更不能使酸、堿及其它化學藥品與顯微鏡接觸。能使酸、堿及其它化學藥品與顯微鏡接觸。油鏡使用的原理油鏡使用的原理 u油鏡，即油浸接物鏡。油鏡，即油浸接物鏡。u當光線由反光鏡通過玻片當光線由反光鏡通過玻片與鏡頭之間的空氣時，由與鏡頭之間的空氣時，由于空氣與玻片的密度不同，于空氣與玻片的密度不同，使光線受到曲折，發生散使光線受到曲折，發生散射，降低了視野的照明度。射，降低了視野的照明度。u若中間的介質是一層油若中間的介質是一層油（其折射率與玻片的相其折射率與玻片的相近近），則幾乎不發生折射，），則幾乎不發生折射，增加了視野的進光量，從增加了視野的進光量，從而使物象更加清

7、晰。而使物象更加清晰。基基 本本 原原 理理 ( (一一) )簡單染色法原理簡單染色法原理( (二二) )革蘭氏染色法原理革蘭氏染色法原理( (三三) )抗酸染色原理抗酸染色原理( (四四) )芽孢染色原理芽孢染色原理( (五五) )莢膜染色原理莢膜染色原理( (六六) )鞭毛染色原理鞭毛染色原理 染色劑和染色原理染色劑和染色原理微生物染色常用染料如下表：微生物染色常用染料如下表：實驗內容實驗內容（簡單染色的方法和步驟）（簡單染色的方法和步驟）涂片涂片自然自然干燥干燥微火固定微火固定染色染色l min沖洗沖洗吸干吸干鏡檢鏡檢實驗內容實驗內容（革蘭氏染色的方法（革蘭氏染色的方法和步驟）和步驟）涂

8、片，干燥、固定涂片，干燥、固定草酸銨結晶紫染液染色草酸銨結晶紫染液染色lmin，用，用水沖洗水沖洗用革氏碘液媒染用革氏碘液媒染lmin，用水沖去，用水沖去碘液碘液用用95乙醇脫色乙醇脫色10-30s，至乙醇，至乙醇液不呈現紫色液不呈現紫色蕃紅染液復染蕃紅染液復染lmin，用水沖洗，用水沖洗吸干并鏡檢吸干并鏡檢實驗內容實驗內容（了解了解抗酸染色的方法和步驟）抗酸染色的方法和步驟）1 1制片制片 將少量草分枝桿菌制成菌懸液，將少量草分枝桿菌制成菌懸液，8080恒溫水浴恒溫水浴3h3h殺死菌體。取殺死菌體。取菌懸液涂片，自然干燥。菌懸液涂片，自然干燥。2 2染色染色 滴加石炭酸復紅染液滴加石炭酸復紅

9、染液2 2滴，覆蓋涂片，在微火上加熱至有蒸氣出滴，覆蓋涂片，在微火上加熱至有蒸氣出現，不斷補充染液，加熱現，不斷補充染液，加熱8 810min10min，棄染液。，棄染液。3 3脫色脫色 用用3 3鹽酸乙醇液脫色，至乙醇液呈淡紅色或無色。鹽酸乙醇液脫色，至乙醇液呈淡紅色或無色。4 4水洗水洗 滴加蒸餾水洗去鹽酸乙醇。滴加蒸餾水洗去鹽酸乙醇。5 5復染復染 加美藍染液染加美藍染液染lminlmin。6 6水洗后自然干燥、鏡檢水洗后自然干燥、鏡檢 草分枝桿菌呈現紅色。若用非抗酸性菌作為對照，則菌體被染成草分枝桿菌呈現紅色。若用非抗酸性菌作為對照，則菌體被染成藍色。藍色。實驗內容實驗內容（了解了解芽

10、孢染色的方法和步驟）芽孢染色的方法和步驟）u孔雀綠染色法：取一干凈載片，在載片中央加一小滴孔雀綠染色法：取一干凈載片，在載片中央加一小滴水，按無菌操作取巨大芽孢桿菌菌體少許混合均勻，水，按無菌操作取巨大芽孢桿菌菌體少許混合均勻，制成涂片，風干固定后，在涂菌處滴加制成涂片，風干固定后，在涂菌處滴加7.67.6的孔雀綠的孔雀綠飽和水溶液，間斷加熱染色飽和水溶液，間斷加熱染色10min10min后后( (注意添加染液注意添加染液勿使涂片干燥勿使涂片干燥) )，用水沖洗。再用，用水沖洗。再用0.50.5蕃紅液染色蕃紅液染色lminlmin，水洗，自然干燥后鏡檢。芽孢被染上綠色，營，水洗，自然干燥后鏡檢

11、。芽孢被染上綠色，營養體呈現紅色。養體呈現紅色。實驗內容實驗內容（了解了解莢膜染色的方法和步驟）莢膜染色的方法和步驟）1 1制片制片 加一滴加一滴6 6葡萄糖水溶液于載片一端，挑取少量膠質芽孢桿菌與其混合，葡萄糖水溶液于載片一端，挑取少量膠質芽孢桿菌與其混合，再加一滴黑色素充分混勻。用推片法制片，將菌液鋪成薄層，自然干再加一滴黑色素充分混勻。用推片法制片，將菌液鋪成薄層，自然干燥。燥。2 2固定固定 滴加滴加l l2 2滴無水乙醇覆蓋涂片，固定滴無水乙醇覆蓋涂片，固定lminlmin，自然干燥。，自然干燥。3 3染色，沖洗染色，沖洗 滴加結晶紫，染色滴加結晶紫，染色2min2min，用水輕輕沖

12、洗，干燥后鏡檢。，用水輕輕沖洗，干燥后鏡檢。u有莢膜的菌、菌體呈紫色，背景灰黑色，莢膜不著色呈無色透明圈。有莢膜的菌、菌體呈紫色，背景灰黑色，莢膜不著色呈無色透明圈。無莢膜的菌，由于干燥菌體收縮，菌體四周也可能出現一圈狹窄的不無莢膜的菌，由于干燥菌體收縮，菌體四周也可能出現一圈狹窄的不著色環，但這不是莢膜，莢膜不著色的部分寬。著色環，但這不是莢膜，莢膜不著色的部分寬。實驗內容實驗內容（了解了解鞭毛染色的方法和步驟）鞭毛染色的方法和步驟）1 1載片的清洗：將載片洗凈浸泡在載片的清洗：將載片洗凈浸泡在9595乙醇中備用。乙醇中備用。2 2實驗菌種的準備：將枯草芽孢桿菌在新制備的肉膏蛋白胨斜面培養基

13、上實驗菌種的準備：將枯草芽孢桿菌在新制備的肉膏蛋白胨斜面培養基上( (斜面下部要有少量冷凝水斜面下部要有少量冷凝水) )，連續移種，連續移種3 34 4次，每次培養次，每次培養121218h18h，最后一次培養最后一次培養121216h16h。3 3制片：擦干載片，在載片一端加一滴蒸餾水，用接種環挑取少許菌苔底制片：擦干載片，在載片一端加一滴蒸餾水，用接種環挑取少許菌苔底部有水部分的菌體部有水部分的菌體( (注意不要挑出培養基注意不要挑出培養基) )，將接種環懸放在水滴中片刻，將接種環懸放在水滴中片刻，將載片稍傾斜，使菌液隨水滴緩緩流到另一端，可再返轉一次使菌液流將載片稍傾斜，使菌液隨水滴緩緩

14、流到另一端，可再返轉一次使菌液流經面積擴大，然后放平，自然干燥。經面積擴大，然后放平，自然干燥。4 4染色染色（利夫森氏染色法）利夫森氏染色法） ：用蠟筆將涂菌區圈起，滴加染液，過數分鐘用蠟筆將涂菌區圈起，滴加染液，過數分鐘后，當染液的后，當染液的1/21/2以上區域表面出現金屬光澤膜時，用水輕輕將金屬膜以上區域表面出現金屬光澤膜時，用水輕輕將金屬膜及染液沖洗干凈，自然干燥。及染液沖洗干凈，自然干燥。u鏡檢鏡檢時應在涂片上按順序進行觀察，經常是在部分涂片區的菌體染鏡檢鏡檢時應在涂片上按順序進行觀察，經常是在部分涂片區的菌體染出鞭毛，菌體及鞭毛均為紅色。出鞭毛，菌體及鞭毛均為紅色。實實 驗驗 材

15、材 料料 ( (一一) )菌種菌種大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌。大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌。( (二二) )染液染液1.1.簡單染色：草酸銨結晶紫染液。簡單染色：草酸銨結晶紫染液。2.2.革蘭氏染色：草酸銨結晶紫染液、革氏碘液、革蘭氏染色：草酸銨結晶紫染液、革氏碘液、9595乙醇、蕃紅染液。乙醇、蕃紅染液。實實 驗驗 材材 料料 ( (三三) )標本標本細菌三型、細菌三型、四聯球菌、四聯球菌、莢膜、芽孢。莢膜、芽孢。( (四四) )其他物品其他物品無菌水、顯微鏡、載片、無菌水、顯微鏡、載片、蓋玻片、酒精燈、蓋玻片、酒精燈、吸水紙、香柏油、擦鏡紙、接種環。吸水紙、香柏油、擦

16、鏡紙、接種環。實驗內容實驗內容 ( (一一) ) 成片觀察成片觀察(1)(1)觀察細菌三型涂片，比較球菌、桿菌和觀察細菌三型涂片，比較球菌、桿菌和螺旋菌的形態。螺旋菌的形態。(2)(2)觀察四聯球菌的形態及觀察四聯球菌的形態及排列排列方式。方式。(3)(3)觀察觀察蘇云金芽孢桿菌的芽孢，褐球固氮蘇云金芽孢桿菌的芽孢，褐球固氮菌的莢膜的形態。菌的莢膜的形態。實驗內容實驗內容 ( (二二) )觀察平板上的細菌菌落，識別大腸桿觀察平板上的細菌菌落，識別大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的菌落特征。的菌落特征。u注意菌落的形狀、高度、大小、顏色，注意菌落的形狀、高度

17、、大小、顏色，是否濕潤、光澤、透明度、邊緣狀況是否濕潤、光澤、透明度、邊緣狀況等等。等等。實驗內容實驗內容 ( (三三) ) 革蘭氏染色法：大腸桿菌和金黃色葡萄革蘭氏染色法：大腸桿菌和金黃色葡萄球菌球菌（必做），枯草芽孢桿菌（選做）（必做），枯草芽孢桿菌（選做）( (四四) ) 環境微生物檢查，使用肉膏蛋白胨培養環境微生物檢查，使用肉膏蛋白胨培養基檢查環境中無處不在的微生物。基檢查環境中無處不在的微生物。實驗報告內容實驗報告內容( (一一) )畫表描述大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌菌落特征。畫表描述大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌菌落特征。( (二二) )繪圖：畫出大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的細胞形態繪圖：畫出大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的細胞形態圖。圖。( (三三) )記記錄革錄革蘭氏染色結果；分辨出革蘭氏陽性菌或陰性菌。如果染色結蘭氏染色結果；分辨出革蘭氏陽性菌或陰性菌。如果染