1、(19)中民*CN102174414A*(12)發(fā)明專利申請(10)申請公布號(43)申請公布日CN 1021744142011.09.07A(21)申請?zhí)?01010622986.8C12R1/645 (2006.01)(22)申請日2010.12.28(83)生物信息CGMCC 3899 2010.06.13(71)申請人 青海大學(xué)地址 810016 青海省西寧市寧大路 251 號(72)發(fā)明人(74)專利機(jī)構(gòu) 北京北翔知識(shí)產(chǎn)權(quán)公司 11285人有限(51)Int.Cl.C12N C12P A23L A61K A61P A61P A61PA61P1/14 (2006.01)19/04 (2

2、006.01)1/30 (2006.01)36/06 (2006.01)3/06 (2006.01)31/04 (2006.01)35/00 (2006.01)37/02 (2006.01)權(quán)利要求書 1 頁 說明書 9 頁 附圖 3 頁(54) 發(fā)明名稱一種新的肋脈羊肚菌 M8-13 液體發(fā)酵物在保健品及開發(fā)中的應(yīng)用(57) 摘要本 發(fā) 明 涉 及 一 種 新 分 離 的 羊 肚 菌(Morchella)M8-13 及其在的應(yīng)用。及品開發(fā)中CN 102174414 A權(quán)利要求書CN 102174414 A1/1 頁1. 一種肋脈羊肚菌 (Morchella Costata)M8-13，其號為

3、 CGMCC3899。2. 權(quán)利要求 1 所述的肋脈羊肚菌 M8-13 用于發(fā)酵生產(chǎn)肋脈羊肚菌菌絲體的用途。3. 權(quán)利要求 1 所述的肋脈羊肚菌 M8-13 或其菌絲體在品中的用途。4. 權(quán)利要求 3 所述的用途，其中所述品用于 ：降血脂、抑氧化、抗輻射、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫功能、抗疲勞，以及減輕患者放化療引起的毒副作用。5. 權(quán)利要求 1 所述的肋脈羊肚菌 M8-13 或其菌絲體在用于治療疾病中的用途。6. 權(quán)利要求 5 所述的用途，其中所述疾病包括 ：腫瘤、高血脂、免疫功能失調(diào)。7. 一種用權(quán)利要求 1 所述的肋脈羊肚菌 M8-13 或其菌絲體發(fā)酵生產(chǎn)真菌多糖的方法， 包括 ：(1) 發(fā)酵培養(yǎng)

4、權(quán)利要求 1 所述的肋脈羊肚菌 M8-13 的孢子 ；(2) 離心沉淀步驟 (1) 的發(fā)酵液中多糖 ；(3) 提取并純化步驟 (2) 中沉淀的多糖。8. 權(quán)利要求 7 所述的方法，其中步驟 (3) 的提純方法為醇沉法。9. 權(quán)利要求 1 所述的肋脈羊肚菌 M8-13 或其菌絲體在用于抑菌的的中的用途。10. 權(quán)利要求 9 所述的用途，其中所述細(xì)菌為金黃色葡萄球菌。2說明書CN 102174414 A1/9 頁一種新的肋脈羊肚菌 M8-13 液體發(fā)酵物在發(fā)中的應(yīng)用品及開技術(shù)領(lǐng)域0001本發(fā)明涉及一種新分離的羊肚菌 M8-13 及其在及品開發(fā)中的應(yīng)用。背景技術(shù)0002羊肚菌 (Morchella

5、sp.) 是世界著名的 ( 藥 ) 食用菌，在美國被稱為“”，歐美一些發(fā)達(dá)認(rèn)為它是營養(yǎng)的高級補(bǔ)品。在世界各地均有分布。羊肚菌子實(shí)體含有多種化學(xué)成分，據(jù)分析測定，每 100g 干品羊肚菌中含水分 12.869g，脂肪 3.829g，蛋白質(zhì)22.069g，其中蛋白質(zhì)含量是木耳的 2 倍，香菇的 1.5 倍(等，1997)，且極易被吸收，這一點(diǎn)是其他高蛋白食品難以比擬的。羊肚菌含有 10 種氨基酸，特別是所必需的氨基酸含量豐富，高出一般食用菌的 25一 40。羊肚菌中維生素和礦物質(zhì)元素種類齊全，含量高，含維生素 B 及煙酸、生物素、毗哆醇、葉酸、多種氨基酸等。每 100 克羊肚菌含礦物質(zhì)元素鉀 2.

6、89g，磷 1.59g，分別是冬蟲夏草的 7 倍和 4 倍 ：鋅的含量是香菇的 4.3 倍，猴頭菌的 4 倍 ；鐵的含量是香菇的 31 倍，猴頭菌的 12 倍(等，2002)。羊肚菌中還含有鈣、鎂、鈉、鉻等所需的元素，尤以有機(jī)鍺含量高。多種礦物質(zhì)的存在，使羊肚菌更顯得身價(jià)不凡。國內(nèi)外的研究主要集中在多糖、氨基酸和脂肪類化合物，另外關(guān)于酶、吡喃酮抗生素、無機(jī)元素、色素、醇、甾醇和皂苷類也有【1-3】。由于羊肚菌的菌絲體不但含有子實(shí)體的各種營養(yǎng)物質(zhì)和活性成分，而且還能較好的保持子實(shí)體獨(dú)特的風(fēng)味，并適于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)，所以羊肚菌菌絲體發(fā)酵研究近年來得到了迅速的發(fā)展，開發(fā)利用菌絲體、發(fā)酵液的以也很多。

7、發(fā)酵技術(shù)具有易操作、菌絲體增殖快、生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量大等優(yōu)點(diǎn)，發(fā)酵菌絲體和發(fā)酵液為主要原料提取羊肚菌各種營養(yǎng)成分和活性成分，可明顯降低成本，提高生產(chǎn)效率。但是，目前國內(nèi)還沒有成熟羊肚菌菌絲體及多糖等方面的上市。0003羊肚菌營養(yǎng)豐富具有較高的藥用價(jià)值，開發(fā)出系列品將具有廣闊的市場前景。野生羊肚菌量有限、人工栽培不、野生羊肚菌國際市場供不應(yīng)求等因素，使羊肚菌價(jià)格逐年上漲( 達(dá) 2000 元/ 公斤)。因此，通過羊肚菌發(fā)酵開發(fā)在免疫機(jī)能低下、抗藥性等多方面醫(yī)學(xué)難題。品將為解決人類0004大型真菌多糖免疫增強(qiáng)機(jī)制主要是從免疫、免疫細(xì)胞和免疫各層次刺激巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、自然細(xì)胞 (NK

8、細(xì)胞 )細(xì)胞、B 細(xì)胞，增加他們的層次上促進(jìn)胸腺和脾數(shù)量，增強(qiáng)他們的活性，進(jìn)而促使免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用。多糖從免疫臟的生長和分化，增加他們的重量，進(jìn)而促進(jìn)免疫中的 T 細(xì)胞、B 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量增加。多糖從免疫細(xì)胞層次上促進(jìn) T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞細(xì)胞、自然細(xì)胞的成熟、分化和。羊肚菌科 (Morchellaceae)，不僅營養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨(dú)特，羊肚菌還具有較高的藥效，其菌體內(nèi)的多糖等成分，具有較強(qiáng)抗腫瘤作用，調(diào)節(jié)免疫功能，抗疲勞，并能減輕患者放化療引起的毒副作用。由此可見，羊肚菌是是一種具有開發(fā)前景的珍稀食用菌，并可出口創(chuàng)匯，其在、食品、健品、化妝品等領(lǐng)域具有較高的應(yīng)用

9、價(jià)值。羊肚菌含有較高的蛋白質(zhì)碳水化合物多種氨基酸多種維生素等營養(yǎng)成3說明書CN 102174414 A2/9 頁分 ；與冬蟲夏草功能相同，是一種不含任何激素?zé)o任何副作用的天然補(bǔ)品，常吃不但可提高免疫力，還可消除面部的色斑黃斑雀斑使皮膚變白變嫩 2。但目前，對羊肚菌有效成分的提取與純化研究尚不夠深入，關(guān)于羊肚菌對細(xì)菌等的抑制作用基本沒有查到相關(guān)0005現(xiàn)有技術(shù)中的問題。0006羊肚菌作為一種珍稀食藥用真菌，其研究仍停留在形態(tài)學(xué)和學(xué)水平，對其營養(yǎng)生化特征的研究很少。國內(nèi)至今沒有對羊肚菌多糖進(jìn)行過較系統(tǒng)研究。近幾年，國內(nèi)學(xué)等 11 以者對羊肚菌多糖的研究取得了一定進(jìn)展。發(fā)酵的羊肚菌菌絲體和發(fā)酵液為主

10、要原料提取羊肚菌多糖，對影響多糖提取率的幾個(gè)因素分別進(jìn)行了對比實(shí)驗(yàn)，并對等 12 從液體多糖進(jìn)行了純化及組分鑒定。發(fā)酵所得的羊肚菌發(fā)酵液中提取了 3種羊肚菌純多糖，分析了其組分和結(jié)構(gòu)。13 用蒽酮比色法進(jìn)行了羊肚菌多糖含量的測定，為羊肚菌多糖的深入研究奠定了基礎(chǔ)。0007而羊肚菌菌絲體在營養(yǎng)成分上與子實(shí)體相當(dāng) 15。由于羊肚菌不能進(jìn)行大規(guī)模的人工栽培，因此在食用羊肚菌子實(shí)體的同時(shí)，人們更側(cè)重于羊肚菌菌絲體的發(fā)酵研究。00081958 年 J.Sguest 首次在發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)羊肚菌菌絲球，并進(jìn)行了 25000 加侖的生產(chǎn)試驗(yàn)，上世紀(jì) 60 年代以來，美、法等國開始大規(guī)模生產(chǎn)其菌絲體，用以制造調(diào)味

11、品，其產(chǎn)品深受消費(fèi)者的歡迎。目前 14 國外已經(jīng)能夠進(jìn)行 500L 以下規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)，并出現(xiàn)了專門適于羊肚菌發(fā)酵的設(shè)備。我國研究雖然較為滯后，目前仍處于中小試階段，但近年來研究等 16取得了較大的進(jìn)展。人們對羊肚菌液體菌種、液體培養(yǎng)基進(jìn)行了廣泛的研究等 17(1999) 通過搖瓶正交試(1998) 探索了羊肚菌液體培養(yǎng)條件并篩選了培養(yǎng)基驗(yàn)研究了尖頂羊肚菌液體發(fā)酵的合適條件。而今，人們都致力于尋找羊肚菌菌絲的最優(yōu)發(fā)酵條件，以求羊肚菌菌絲產(chǎn)量達(dá)到更高，使效益更高。發(fā)0009 在實(shí)踐中已經(jīng)證明，只有獲得較高活力、生產(chǎn)性能優(yōu)良的菌株，才有可能實(shí)現(xiàn)發(fā)酵和生產(chǎn)，降低生產(chǎn)成本。通過自然選育淘汰活力差、發(fā)酵

12、能力弱的菌株，為進(jìn)一步菌株改良和發(fā)酵生產(chǎn)打下一個(gè)堅(jiān)實(shí)的起點(diǎn)和基礎(chǔ)。因此，本發(fā)明從菌種選育著手，主要對本實(shí)驗(yàn)室已有的 24 株羊肚菌進(jìn)行產(chǎn)多糖和菌絲體干重的初步篩選。從菌種方面的優(yōu)勢作為以后大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)的前提，旨在提高胞外多糖量的同時(shí)生物量也達(dá)到較高水平。0010 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種肋脈羊肚菌 (MorchellaCostata)M8-13，其號為 CGMCC3899。0011在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了所述肋脈羊肚菌 M8-13 用于發(fā)酵生產(chǎn)肋脈羊肚菌菌絲體的用途。0012在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了所述肋脈羊肚菌 M8-13 或其菌絲體在保健品中的用途。優(yōu)選地，其中

13、所述品用于 ：降血脂、抑氧化、抗輻射、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫功能、抗疲勞，以及減輕患者放化療引起的毒副作用。0013在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了所述肋脈羊肚菌 M8-13 或其菌絲體在用于治療疾病中的用途。優(yōu)選地，其中所述疾病包括 ：腫瘤、高血脂、免疫功能失調(diào)。0014在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用所述肋脈羊肚菌 M8-13 或其菌絲體發(fā)酵生產(chǎn)真菌多糖的方法，包括 ：4說明書CN 102174414 A3/9 頁(1) 發(fā)酵培養(yǎng)所述肋脈羊肚菌 M8-13 的孢子 ；(2) 離心沉淀步驟 (1) 的發(fā)酵液中多糖 ；(3) 提取并純化步驟 (2) 中沉淀的多糖。001500160017001

14、80019菌的優(yōu)選地，其中步驟 (3) 的提純方法為醇沉法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了所述肋脈羊肚菌 M8-13 或其菌絲體在用于抑的中的用途，優(yōu)選地，其中所述細(xì)菌為金黃色葡萄球菌。附圖說明0020 圖 1 示出了羊肚菌 M8-13 子實(shí)體 ( 左 ) 及培養(yǎng)的菌絲體 ( 右 )。0021 圖 2 示出了羊肚菌 M8-13 固體培養(yǎng)物( 左) 及 M8-13 胞內(nèi)物質(zhì)對金黃色葡萄球菌的抑制 ( 中 )，對照菌株 ( 右 )。0022 圖3 示出了M8 系列羊肚菌生物量的比較，小寫字母表示5差異顯著水平，大寫字母表示 1差異顯著水平 ；相同字母表示差異不顯。0023 圖 4 示出了 M8

15、系列羊肚菌第 5 天產(chǎn)胞外多糖的比較，小寫字母表示 5差異顯著水平，大寫字母表示 1差異顯著水平 ；相同字母表示差異不顯著，不同字母表示差異顯著。0024 圖 5 示出了 M8 和 M9 系列羊肚菌第 5 天產(chǎn)胞內(nèi)多糖的比較，小寫字母表示 5差異顯著水平，大寫字母表示 1差異顯著水平 ；相同字母表示差異不顯著，不同字母表示差異顯著。具體實(shí)施方式0025本發(fā)明的菌株的篩選、鑒定、多糖的測定篩選、抗菌活性的篩選等都是在中國，青海西寧，青海大學(xué)教授的中進(jìn)行的。羊肚菌是世界著名的野生食 ( 藥) 用菌，肉質(zhì)脆嫩鮮美、營養(yǎng)和藥用價(jià)值極高，故在食品、化妝品等領(lǐng)域顯示出極大的開發(fā)潛力。近年來，由于人工砍伐森

16、林、水土流失、鼠害、人類的過度活動(dòng)及對利益追逐等，青藏高原羊肚菌急劇減少。0026本發(fā)明的發(fā)明人收集并分離純化青藏高原羊肚菌屬 24 株分離株純培養(yǎng)物( 分別屬黃羊肚菌和黑羊肚菌涵蓋了 5-6 個(gè)種 )，試驗(yàn)菌株 ：M8 和 M9 系列菌由青海大學(xué)生物科學(xué)系微生物2008 年 5 月和 2009 年 5 月從青藏高原采羊肚菌分離得到。發(fā)明人還選用羊肚菌 51009(Morchella esculenta 51009，中國農(nóng)科院 ) 菌株做對照。0027實(shí)施例 1 羊肚菌的收集0028將自青藏高原的羊肚菌表面處理干凈，用 95的乙醇擦拭后，放于干凈的平皿或廣口瓶中，置于烘箱中 40下，待孢子大量

17、彈出后，挑取其孢子，在 PDA( 土豆 20、蔗糖 2、瓊脂 1.5-2，pH 自然 ) 平板上劃線。25培養(yǎng)一天后用顯微鏡觀察，待觀察到有單個(gè)孢子萌發(fā)后，再將萌發(fā)處的培養(yǎng)基切下轉(zhuǎn)移于另一 PDA 平板上。保存在 PDA 斜面培養(yǎng)基中。0029 發(fā)明人對這些菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，所有菌株都先在 PDA 固體培養(yǎng)基上活化，液體發(fā)酵培養(yǎng)基 (KH2PO4 0.1，MgSO4 0.1，蔗糖 2，蛋白胨 0.5 )，再其轉(zhuǎn)到 150mL 三角瓶裝的液 60mL 的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在 25下、100r/min 的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。5說明書CN 102174414 A4/9 頁0030 在所培養(yǎng)的 24 株羊

18、肚菌中，對其生物量、胞外多糖及其對應(yīng)黃色葡萄球菌的抑制作用進(jìn)行研究。通過對其形態(tài)學(xué)特征的分析 ( 子實(shí)體的形態(tài)特征，例如菌絲體的寬度和生長習(xí)性) 及它的 ITS 序列，鑒定菌株肋脈羊肚菌 (Morchella Costata)M8-13。對 23 株羊肚菌進(jìn)行了胞內(nèi)和胞外抗菌實(shí)驗(yàn)篩選，供試菌種為乳酸大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌 ；并用蒽酮硫酸法測定了 23 株羊肚菌的菌絲體胞內(nèi)多糖含量。0031 實(shí)施例 2 篩選生物量及胞外多糖產(chǎn)量高的菌株 ：0032 將斜面液體石蠟封存的菌種轉(zhuǎn)接至 PDA 固體培養(yǎng)基上，25下恒溫光照培養(yǎng)，其中 M8 系列和 M51009 培養(yǎng) 5 天。在 PDA

19、 培養(yǎng)基中進(jìn)行菌種活化后，再將其轉(zhuǎn)到 150mL 三角瓶裝液 60mL 的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，每種菌株做 3 個(gè)平行對照，25和 100r/min 的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。0033(1) 胞外多糖的沉淀 ：0034分別將培養(yǎng)到第 3 天、第 4 天、第 5 天的羊肚菌發(fā)酵液吸出 4mL，以 3500r/min 離心15min，每個(gè)離心管吸 3mL 上清液，加入 9mL 無水乙醇，-10沉淀 24 小時(shí)。0035(2) 胞外多糖的測定 ：0036將沉淀的多糖以 3500r/min 離心 15min，棄上清，加入 3mL 蒸餾水在 60水浴中溶解，稀釋 30 倍，配成多糖溶液，用蒽酮硫酸法測定多糖，取多糖

20、溶液 2mL，置于冰水浴 5min后，在冰水浴中加蒽酮顯色劑 ( 蒽酮 H2SO4 1g 500mL，待蒽酮溶解后即成 )6mL，混勻，沸水浴15min，然后再次置于冰水浴中5min，室溫下平衡10min，使用UV-9200 紫外可見分光光度計(jì) ( 北京分析儀器公司 ) 在 620nm 處比色，結(jié)果如圖 4 所示。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方：y 9.5256x-0.0027(R2 0.9993)0037表 1 菌株的胞外多糖含量0038(3) 菌絲體干重的測定 ：將發(fā)酵 8 天的發(fā)酵液以紗布過濾以獲得菌絲體，用蒸餾水反復(fù)沖洗 3 次，置烘箱中0039004055下烘至恒重，稱重，結(jié)果如圖 3 所示。表

21、2 菌株的菌絲體干重004100426說明書CN 102174414 A5/9 頁0043實(shí)施例 3 胞內(nèi)多糖測定 ：稱取 0.020g 左右干燥的羊肚菌菌絲體，分兩次添加共 1mL 水研磨，煮沸提取0044004530min，冷卻后 2500r/min 離心 20min。取上清液置于一離心管中，再向殘?jiān)屑?1mL 水，煮沸提取30min，收集上清液置于上述同一離心管中。于上清液中加入7mL 無水乙醇使多糖析出，沉淀30min 后以2500r/min 離心20min，棄去上清液，殘?jiān)偌?.5mL 乙醇攪拌后同樣離心棄去上清液。用約 80熱水將沉淀溶解，冷卻后同上，參見圖 5。2mL，蒽酮硫

22、酸法測定多糖，實(shí)施例 4 分離菌株 M8-13 菌株的純化 ：分離菌株 M8-13 的樣品來自于羊肚菌屬子實(shí)體孢子分離物。是通過在篩選培00460047養(yǎng)基上一系列的次代培養(yǎng)而純化。篩選培養(yǎng)基包含 0.6蛋白胨，0.1 K2HPO4，0.05 MgSO4·7H2O，和 1葡萄糖，pH 7.0。在 28下培養(yǎng) 3-5 天。然后將生長良好的菌落通過次代培養(yǎng)轉(zhuǎn)接到新鮮 PDA 培養(yǎng)基上。從均勻生長的菌落上，用接種環(huán)挑取一環(huán)轉(zhuǎn)接到液體發(fā)酵培養(yǎng)基 ：KH2PO4 0.1，MgSO4 0.1，蔗糖 2，蛋白胨 0.5。在 25下，以 100rmp 的轉(zhuǎn)速在搖床中培養(yǎng)。為了，菌株被接種到 PDA

23、培養(yǎng)基上于 4條件下保存。實(shí)施例 5 羊肚菌 M8-13 形態(tài)學(xué)和學(xué)上的鑒定 ：00480049將羊肚菌 M8-13 的菌絲體在 PDA 培養(yǎng)基上持續(xù)培養(yǎng) 5 天，用來測量形態(tài)學(xué)特征，如菌絲寬度，孢子的形成和孢子的形狀。用 CTAB 法 (vanBurik et al.，1998)從在 PDA 培養(yǎng)基上生長 5 天的菌絲體中提取組 DNA，利用具有正向 ITS5 引物，5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3和 ITS4 反向引物 5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3PCR 以Yang.(2007) 方法擴(kuò)增 ITS DNA。后通過 NCBI BLAST 數(shù)據(jù)庫對 PC

24、R 產(chǎn)物進(jìn)行序列分析。通過和其他菌株 ITS 序列的比較，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，根據(jù)序列相似度確定其分類地位。ITS 的 PCR 反應(yīng)體系均采用以PCR 反應(yīng)體系 (25L)系 ：0050005100527說明書CN 102174414 A6/9 頁0053ITSPCR 擴(kuò)增程序如下 ：00541) 預(yù)變性 ：94 1min00552) 變性 ：94 15s火 ：58 15s伸 ：72 1min退延00560057005830 個(gè)循環(huán)00593) 補(bǔ)平 ：72 5min0060PCR 結(jié)束后取 5L 擴(kuò)增產(chǎn)物在 1瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，紫外燈下檢測并擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的條帶。所用試劑均購自上海生

25、工。0061從圖 1 中可見，M8-13 的菌絲體呈現(xiàn)典型的白色的干的羽絨狀，遍及菌落各處(Fig.3A)。菌絲體由許多間隔組成 (Fig.3B).)。為了鑒定羊肚菌 8-13，它的菌絲體接種到固體培養(yǎng)基固體上，在 25培養(yǎng) 6 天滿皿。0062在和18S 核糖體部分序列相關(guān)的組鑒定，提取菌株M8-13 中的組DNA，內(nèi)部轉(zhuǎn)作為 PCR 擴(kuò)增的模板，通過 PCR 技術(shù)，擴(kuò)增內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) 1，5.8S 核糖體 RNA錄間隔區(qū) 2 和 28S 核糖體 RNA部分序列。PCR 擴(kuò)增出的序列信息在 NCBI 數(shù)據(jù)庫中被用來做 BLAST 研究。BLAST 結(jié)果顯示 M8-13 分析區(qū)段，其中 99和

26、肋脈羊肚菌相一致。結(jié)合形態(tài)學(xué)和學(xué)的分析M8-13 件定為肋脈羊肚菌，并根據(jù)菌種的規(guī)則于 2010年 6 月 13 日路甲 3 號，中國在中國微生物菌種微生物管理委員會(huì)普通微生物中心 ( 北京市朝陽區(qū)大屯：100101)號 ：CGMCC3899。0063數(shù)據(jù)處理與誤差分析 ：0064采用DPS 數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行誤差分析 ：對不同菌株之間顯著性檢驗(yàn)采用Duncan 新復(fù)極差多重比較法。0065實(shí)施例 6 羊肚菌 M8-13 抑菌試驗(yàn) ：0066(1) 供試菌培養(yǎng)及：將保存的乳酸大腸桿菌 ( 青海省畜牧獸醫(yī)提供 )、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)接至牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，置于 25智能光

27、照培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 18h。然后從中挑取細(xì)菌轉(zhuǎn)接到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37下 100r/min 培養(yǎng) 10h，得到各種原菌液。吸取 20L 原菌液( 分別為乳酸大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的原菌液) 與180L 羊肚菌的發(fā)酵液( 發(fā)酵液分別取培養(yǎng)到第3、4、8說明書CN 102174414 A7/9 頁6、8 天 ) 混勻，制成供試菌液 1。用于胞外物質(zhì)抗菌篩選。0067(2) 羊肚菌 M8-13 的發(fā)酵液進(jìn)行篩選抗菌實(shí)驗(yàn) ：0068 取 50L 供試菌液 1 涂布于牛肉膏蛋白胨培固體養(yǎng)基上，25培養(yǎng) 18h。菌落計(jì)數(shù)。每個(gè)受試樣做 2 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，并做對照 (20L 的供試菌液加

28、 180L 的蒸餾水 )。0069(3) 羊肚菌菌絲體進(jìn)行的抑菌試驗(yàn)篩選 ：0070a. 抗菌濾紙片0071取 0.010g 干燥的羊肚菌菌絲體，加 0.3mL 水研磨。將已滅菌并干燥過的圓形濾紙片 (d 9.00mm) 放入研磨好的菌絲體液體中，浸泡 30min。0072b. 抑菌圈大小的測定0073吸取 20L 供試菌液 1 均勻涂布到牛肉膏蛋白胨平板上。每個(gè)平板上貼兩個(gè)抗菌濾紙片，濾紙片離平皿邊緣至少 15.00mm。置于 25智能光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 18h 后取出，用直尺測量抑菌圈直徑。對照為 M51009。0074結(jié)果 ：0075根據(jù)多糖產(chǎn)量、菌絲體生物量、抑菌試驗(yàn)等綜合，篩選出羊肚菌

29、 M8-13 菌株為最佳菌株，可用于食品及藥品的開發(fā)研究。羊肚菌 M8-13 菌株的培養(yǎng)特征見表 3，子實(shí)體及菌絲體見圖 1。抑菌試驗(yàn)結(jié)果見表 4，圖 2。0076表 3 羊肚菌 M8-13 菌株的培養(yǎng)特征00770078+”表示液體發(fā)酵培養(yǎng)中菌絲球數(shù)目在 25 左右0079表 4 羊肚菌 M8-13 液體發(fā)酵菌絲體對金黃色葡萄球菌的抑制作用0080羊肚菌 M8-13 對金黃色葡萄球菌的抑制作用較好，對乳酸大腸桿菌和枯草芽孢桿0081菌沒有明顯的抑制作用 ；羊肚菌 M8-13，發(fā)酵第八天菌絲體干中可達(dá) 5.867g/L，發(fā)酵第 3 天胞外多糖可達(dá)0.299g/L，菌絲體胞內(nèi)物質(zhì)對金黃色葡萄球菌

30、的抑菌圈達(dá)到20 毫米。平均生長速度每天 8.0mm，菌絲體直徑 6.64-11.96m，見表 5，圖 3，圖 4。表 5 羊肚菌 M8-13 液體發(fā)酵胞內(nèi)、胞外多糖及生物量008200839說明書CN 102174414 A8/9 頁00840085008656-61.0087這種菌株具有很強(qiáng)的參考文獻(xiàn) (REFERENCES)品開發(fā)潛能。1苓. 中國羊肚菌屬真菌J.科學(xué)，1999，21(2) ：2同，等 . 羊肚菌多糖研究進(jìn)展 J. 微生物學(xué)雜志，2005，25(4) ：89-91.0088008942-44.0090009134. 羊肚菌研究進(jìn)展 J. 食用菌學(xué)報(bào)，2002，9(2) ：56-61.莉 . 羊肚菌等野生菌無機(jī)元素分析 J. 中國野生植物，1994，(2) ：5 高尚士 .珍品羊肚菌 J. 特種動(dòng)植物，2000(3) ：38.6. 羊肚菌子實(shí)體部分化學(xué)成分研究 D. 吉林 ：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)位論文，2006.05.01.009200937. 真菌多糖的研究進(jìn)展真菌多糖的結(jié)構(gòu)、提純和應(yīng)用J.