1、人骨髓間充質干細胞的擴增及向成軟骨樣細胞的誘導分化邱麗燕,王金福(浙江大學生命科學學院 浙江杭州 310012摘要 從人骨髓中分離和培養間充質干細胞,在原代和傳代培養中其形態學上均為貼壁、纖維狀的細胞,隨著代次的增加細胞形態更加趨于一致。流式細胞儀鑒定CD45、CD34、CD117、HLA-DR 陰性,CD29、CD166陽性,并隨著培養的MSCs 代次的增加,陽性比率和陰性比率出現相應的上升和降低,說明細胞純度增加。第三代的MSCs 大約有80%處于G 0/G 1期,S+G 2+M 期約20%左右,說明MSCs 有強大的增殖潛能。MSCs 在傳代培養中的最適接種密度約為5.0×10

2、3/cm 2 左右。MSCs 在體外經歷了滯緩期、對數生長期、平穩期三個時期,傳代培養的MSCs 生長速度比原代的MSCs 明顯快很多。采用程序降溫法對MSCs 進行凍存,6090天后對凍存的MSCs 進行復蘇,發現MSCs 仍可在體外良好生長46代,特定的MSCs 樣本可以擴增10代,說明經過凍存的細胞仍具有良好的增殖能力。對四例標本的前三代MSCs 在體外利用TGF 1和維生素C 誘導兩周后,用RT-PCR 證明MSCs 表達軟骨特異性的II 型前膠原的mRNA ,說明我們培養的細胞具有向成軟骨樣細胞分化的潛能,由此進一步證實其為MSCs 。關鍵詞 骨髓間充質干細胞 擴增 成軟骨樣細胞Ex

3、pansion and Chondrogenic Induction of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Qiu Liyan, Wang Jinfu(College of Life Science, Zhejiang University, Hangzhou, Zhejiang 310012Abstract MSCs from human BM were isolated by Ficoll density centrifugation and cultured expanded in DMEM-LG containing FBS. MSCs

4、 are adherent and fibroblastic, and maintained similar morphology with passaging. Flow cytometry analysis indicated that MSCs were universally positive for CD29, CD166, and negative for CD34, CD45, CD117, and HLA-DR. At passage 3, cell cycle status analysis by measuring DNA content revealed that a s

5、mall population of the cells was engaged in proliferation (S+G 2+M=20%, and more than 80% of cells were in G 0/G 1 phase. The number of cells in G 0/G 1 phase decreased with passage. In passage culture, It is proper for the cells plated at the density of 5000 cells/cm 2 to propagate. The MSCs of pas

6、sage 1 to 3 were froze in liquid nitrogen by two-step frozen procedure ,after 6090 days, we thawed the frozen MSCs and found the cells can proliferate about 46 passages in vitro ,10 passages especially for sample 17. It suggested that the frozen MSCs still have good expansion ability. At passage 1 t

7、o 3, four cases was induced by the combination of TGF-1 and Vitamine C in vitro for two weeks and expressed articular cartilage matrix-procollagen II mRNA.Key word Mesenchymal stem cells (MSCs, expansion, chondrocyte骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells ,MSCs是存在于骨髓中的一類多能干細胞。Friedenstein 等1首先發現MSCs 在體外可分化為

8、骨和軟骨組織,即使經過20-30次細胞分裂后,其分化特性也不會消失。Pittenger 等2通過擴增單個MSCs 的克隆后,在不同的條件下誘導其分化,結果分別分化出骨,軟骨,脂肪組織。隨后,Piersma 等人發現MSCs 在體外除了可以誘導分化為骨、軟骨、脂肪外,甚至還可以分化為肌肉組織3, 4。最近又有學者證實MSCs 可以向神經細胞、造血細胞等多種終末分化細胞分化5-7。Friedenstein 等1建立了MSCs 分離及擴增的方法,并多次對該方法進行了改進。但是,人們對這種細胞本身的認識還遠遠不足。至今還未能篩選到MSCs 特異性的標記分子,尚未能建立鑒定MSCs 的統一標準,不同實驗

9、室的數據之間的可比性較差。所以,尋求MSCs 的穩定培養條件還有待進一步的研究。本文通過分離和體外培養擴增MSCs ,觀察MSCs 的形態,測定細胞生長動態,尋求MSCs合適的接種密度,利用流式細胞儀對培養的細胞進行表面標記的測定和細胞周期的分析,并且通過體外誘導MSCs向軟骨方向分化,檢測軟骨特有的II型前膠原mRNA的表達,從而研究MSCs的生物學性狀,為將來MSCs在組織工程,細胞工程,基因治療以及臨床應用打下基礎。1 材料和方法1.1 MSCs的分離和培養:取成人骨髓3-5ml,用等量的PBS洗滌后900×g離心。沉淀用含10% FBS的DMEM-LG 培養液重新混勻后,用F

10、icoll分離液分離和收集單個核細胞層。調節細胞密度至5×106/ml,接種于底面積為25cm2的培養瓶中,放置于37,5%CO2培養箱內培養,48h后更換培養液。當原代培養的細胞生長到培養瓶底的大約90%時,用消化液消化和懸浮細胞。經離心洗滌后,重新懸浮細胞。按1:3進行傳代培養。1.2流式細胞儀分析培養的細胞生長到大約80-90%融合后,用消化液消化成單細胞懸液,400×g離心后收集細胞。分別加入熒光標記的抗體,4孵育30min,然后PBS洗去未標記抗體,10g/L多聚甲醛固定。用流式細胞儀檢測細胞CD34、CD29、CD45、CD166、CD117、HLA-DR表面抗

11、原。每個樣本至少分析1×105個細胞。1.3細胞周期的測定將貼壁細胞消化,70%冷乙醇4固定24h,PBS液洗滌細胞二遍, 10mg/mlPI染液染色(4避光30min,用流式細胞儀FACScan檢測,Multicycle軟件分析結果。1.4接種密度取生長旺盛時期的細胞,以如下密度:1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0×103/cm2接種于12孔板中。培養10天后用消化液消化,并記數細胞量。以接種密度為橫坐標,細胞擴增的倍數為縱坐標作圖,尋找最合適的細胞接種密度.1.5生長曲線的測定取生長良好的MSCs的P2,P4,P6代細胞,以

12、1×104個/孔接種于24孔板中,加入含10%FBS的DMEM-LG培養液,每24h計數3孔細胞。以細胞數為縱坐標,天數為橫坐標繪制細胞生長曲線。1.6 MSCs的凍存將生長情況良好的P1、P2、P3代的MSCs用消化液消化成單細胞懸液,400×g離心后收集細胞沉淀。用凍存液重懸細胞,使細胞密度達到1×106個/ml。于4冰箱中平衡后,放入預冷4的程序降溫儀中,用兩步降溫法:第一階段:4-40,降溫速率1/min;第二階段:-40-80,降溫速率為5/min。然后-196液氮罐內保存。復溫時從液氮中取出樣品立即放入40水浴鍋內搖動凍存管,1-2min復溫完畢, 4

13、00×g離心后收集細胞,加入新鮮培養液放入CO2培養箱中培養。1.7 成軟骨細胞的誘導選前三代生長良好的MSCs,消化后制成單細胞懸液,以3×104/ml的密度接種于細胞瓶中。待細胞達到80-90%融合后,實驗組3瓶加入成軟骨細胞的誘導液(DEME高糖培養液,10%胎牛血清,100u/ml青霉素,100g/ml鏈霉素,TGF110ng/ml,抗壞血酸50µg/ml,對照組繼續用常規培養液,每隔三天換液一次。14天后終止誘導。提取總RNA,設計II型前膠元的引物序列,COL(II上游:5-TTCAGC TATGGAGATGACAATC-3,下游:5-AGAGTCCT

14、AGAGTGACTGAG-3,產物片斷475bp,進行RT-PCR擴增。其產物經瓊脂糖凝膠電泳后觀察,檢測II型前膠元mRNA的表達。2 結果2.1 MSCs的培養擴增及形態特征從骨髓中分離單個核細胞接種培養后,24h即可觀察到部分細胞貼壁,貼壁的細胞大部分為圓形,橢圓形,有少數伸出突起的細胞;48-72h可觀察到貼壁的細胞大部分呈纖維狀,也有少量的為寬闊、平坦的三角狀、星狀等;接種后5-7天,可見明顯的集落形成(圖1A。集落中的細胞不斷擴增,呈放射狀向周圍擴展,逐漸與鄰近集落相融合。大約14-17天的時間,原代培養的細胞相互匯合可達到90%的生長表面。傳代培養的細胞24h之內,絕大部分細胞貼

15、壁且成纖維狀,更換培養液將未貼壁的造血細胞排除,約4-7天傳代培養的細胞達到90%的融合(圖1B。經傳代培養后,細胞的形態更加趨于一致。 A B圖1 原代MSCs形成的集落(A和傳代培養形成貼壁細胞層的MSCs(B(10×10倍 Figure 1. MSC colonies in the first generation culture (A and the confluent MSC layer inthe passaging culture (B (10×102.2 細胞周期結果用流式細胞儀測定人MSCs內DNA的含量,第3代細胞處于分裂期(S+G2+M的約19.5%左

16、右,處于G0/G1期的細胞的約81.5%左右(如圖2。 圖2:人MSCs細胞周期檢測Figure 2. The cell cycle of MSCs during the Log phase of growth.On the average, 81.5% of cells were at G0/G1, 12.6% at S, and 5.9% at G2/M phase of cell cycle2.3 MSCs表面標記物的流式細胞儀分析結果經流式細胞儀檢測分析,培養的MSCs CD45、CD34、CD117和HLA-DR陰性,CD29、CD166陽性(圖3。對同一標本的第二代至第四代進行MS

17、Cs表面標記物的檢測,發現不但同一代細胞不同標記物陽性或陰性的比例不同,不同代次的細胞同一標記物的比例也不同。隨代次的增加,其中CD166的陽性比例由68.9%上升到93.5%,CD29的陽性比例由48.8%上升到87.4%。 HLA-DR CD29 CD45 CD34 CD117 CD166圖3 流式細胞儀檢測MSCs表面標記物Figure 3. Flow cytometry analysis of MSCs It indicates that MSCs were universally positive for CD29, CD166,and negative for CD34, CD45

18、, CD117, and HLA-DR.2.4 細胞生長曲線MSCs的生長曲線呈S型,符合Loigistic生長曲線。骨髓MSCs傳代培養的細胞較原代的細胞生長要快,一般在接種后的第47天即可鋪滿培養底面;多數樣本在第710代出現衰老現象?？梢园l現傳代培養具有以下特征(如圖4:(1每次傳代培養的生長滯緩期24 36h;(2每次傳代培養的骨髓MSCs對數增殖期為24天;(3對數增殖期結束后,進入平臺期。圖4是標本15的P2、P4、P6代傳代培養的生長曲線,隨著代次的增加,MSCs 的增殖能力開始減弱。 圖4 人骨髓MSCs 的P2、P4、P6代傳代培養生長曲線Figure 4. Growth dynamics of MSCs in P2, P4 and P6 passages2.5 最適接種密度將生長旺盛的細胞以不同密度接種于12孔板中,倒置顯微鏡下進行觀察。以13×10