1、Vol.32,No.2296305文章編號(hào)：0254-5357(2013)02-0296-10氨氮污染源區(qū)包氣帶剖面微生物生態(tài)分布特征的研究程雅楠口，關(guān)翔宇'，曲文龍3,陳鴻漢，劉菲），謝宇軒'，朱玲玲'（1.水資源與環(huán)境工程北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)地質(zhì)大學(xué)（北京），北京100083；2.中交鐵道勘察設(shè)計(jì)院有限公司，北京100088；3.沈陽(yáng)水務(wù)集團(tuán)，遼寧沈陽(yáng)110003）摘要：包氣帶土壤中氨氮污染遷移規(guī)律已成為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)，目前在氨氮污染遷移規(guī)律研完中采用柱實(shí)驗(yàn)?zāi)M以及軟件模擬的方法較多，土壤生物技術(shù)則廣泛應(yīng)用于污染物降解領(lǐng)域，而在污染物遷移規(guī)律研完中應(yīng)用

2、較少。本文采用變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術(shù)、16SrRNA序列分析技術(shù)以及典范時(shí)應(yīng)分析相結(jié)合,對(duì)華北平原3個(gè)典型氨氮污染區(qū)土壤表層至包氣帶剖面微環(huán)境的細(xì)菌垂直分布特征及群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。結(jié)合污染區(qū)土壤理化性質(zhì)分析，認(rèn)為包氣帶上壤剖面的細(xì)菌群落中存在著與氮循環(huán)、硫酸鹽代謝等過(guò)程偶聯(lián)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群，說(shuō)明土壤微環(huán)境中細(xì)菌群落分布明顯受氨態(tài)氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮和硫酸鹽的分布影響，進(jìn)一步表明污染土壤優(yōu)勢(shì)茵群的群落結(jié)構(gòu)信息是描述包氣帶土壤環(huán)境氨氮污染物遷移規(guī)律的重要參數(shù)。關(guān)鍵詞：包氣帶；氨氮污染；微生物群落；變性梯度凝膠電泳；l6SrR、A中圖分類號(hào)：S151.93；X820.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A包氣帶作

3、為全球生物地球化學(xué)循環(huán)的重要地質(zhì)介質(zhì)，對(duì)地下水生態(tài)系統(tǒng)影響顯著，其理化因素的空間特異性能夠使相應(yīng)上壤環(huán)境中微生物群落發(fā)生改變，進(jìn)而影響氨氮污染物在包氣帶土壤生態(tài)系統(tǒng)中的運(yùn)移，以及氨氮污染降解菌的分布。近年來(lái)，現(xiàn)有的物理化學(xué)技術(shù)對(duì)處理大面積的土體和地下水污染已不具優(yōu)勢(shì)，污染土壤生態(tài)環(huán)境的研究重點(diǎn)已開(kāi)始轉(zhuǎn)向分子生物修復(fù)領(lǐng)域.采用PVA1799冷凍改良技術(shù)固定的優(yōu)勢(shì)菌群，能夠使?jié)舛葹?65mg/L的苯酚去除率達(dá)到94%以上。在硝化性能明顯的氮污染土壤中分離得到的一種微生物Bacillussp.LY能夠在有機(jī)物去除的同時(shí),將氨氮轉(zhuǎn)化為氮?dú)猓⒛芤远喾N有機(jī)污染物包括壬基酚聚氧乙烯醮（NPEOs）、鄰苯二

4、酚及苯酚等為唯一碳源生長(zhǎng)，是新型高效生物脫氮聯(lián)合去除有機(jī)污染物技術(shù)的重要突破電。土壤環(huán)境中分離出具有特殊作用的微生物，一株鑒定為OchrobactrumintermediumDN2的煙堿降解細(xì)菌經(jīng)證實(shí)，能夠去除或減少煙草廢棄物中煙堿”。在苯乙酸廢水污染的高鹽土壤分離出的中度嗜鹽菌Halomotuissp.BYS-1中分離提取的耐鹽基因片段，為耐鹽遺傳機(jī)制的研究提供了高質(zhì)雖實(shí)驗(yàn)材料，在鹽污染土壤治理中得到有效利用們。收稿日期：2012-03-07；接受日期：2012-07-24基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目面上基金（51078338）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)自由探索項(xiàng)目（2010ZY05）作者簡(jiǎn)

5、介：程雅楠.碩士研究生.從事地卜水及土壤污染微生物修復(fù)技術(shù)研究。E-mail：ptinny_5696163.conu,通訊作者：陳鴻漢，教授，主要從事地下水科學(xué)與環(huán)境工程教學(xué)與科研工作。E-mail：ehenhonghaneugb.«lu.en0反滲透等物理方法以及化學(xué)還原脫氮法是去除包氣帶土壤氨氮污染的傳統(tǒng)方法。但是，這些方法并非完全將硝酸鹽降解為無(wú)毒的氣態(tài)貌化合物和氮?dú)猓瑑H為硝酸鹽的轉(zhuǎn)移，還會(huì)產(chǎn)生二次污染問(wèn)題。近年來(lái)，生物脫覦技術(shù)尤其是分子生物技術(shù)在土壤氨氮污染去除中逐漸得到關(guān)注。變性梯度凝膠電泳（簡(jiǎn)稱DGGE）技術(shù)能夠直接利用DNA及DNA對(duì)微生物遺傳特性進(jìn)行表征，不但避免r耗

6、時(shí)的傳統(tǒng)菌種分離，更可鑒定出無(wú)法利用傳統(tǒng)方法分離的萌種，它的分辨精度相比瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳更加精確，可以檢測(cè)到一個(gè)核甘酸水平的差異。DGGE膠體圖譜中出現(xiàn)的可見(jiàn)條帶，分別代表土壤樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌16SrRNA的目的片段，條帶的數(shù)鼠反映出細(xì)菌群落組成中的優(yōu)勢(shì)群體的數(shù)量，條帶的強(qiáng)度代表細(xì)菌種群中細(xì)菌的含量，與模板25.StefanJG,OrnP,ThomasMG.Denitrifyingbacteriaisolatedfromterrestrialsubsurfacesedimentsexposedtomixed-wastecontamination_J_.AppliedatulEn

7、viron-menlalMicrobiology,2010(76):3244-3254.26ChristianeW,AndreaT,AntjeW.Horizon-specificbacterialcommunitycompositionofgennangrasslandsoils,asrevealedbypyrose(,uencing-basedanalysisofI6SrRNAgenesJ.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2010(76):6751-6759.MicrobialEcologicalDiversityCharacteristicsofth

8、eSoilProfileintheVadoseZonePollutedbyAmmoniaNitrogenCHENGYa-nan1'2,GUANXiang-yu1,QUWen-long3,CHENIlong-han*,LIUFei,XIEYu-xuan,ZHULing-ling(1.BeijingKeyLaboratoryofWaterResourcesandEnvironmentalEngineering,ChinaUniversityofGeosciences(Beijing),Beijing100083,China；2. RailwaySurveyandDesignInstitut

9、eofChinaCommunicationsCo.,LTD,Beijing100088,China；3. ShenyangWaterGroupCo.LTD,Shenyang110003,China)Abstract:Scholarsathomeandabroadinrecentyearshavefocusedonresearchingammonianitrogenpollutionmigrationrulesinthevadosezonesoil.Columnsimulationandsoftwaresimulationwereprimarilyconductedforthestudyofam

10、monianitrogenpollutionmigration.Biotechnologywaswidelyusedindegradationofpollutantinsoil,butlessappliedtothestudyofpollutionmigration.ThisstudyappliedDenaturingGradientGelElectrophoresis(DGGE)andthesequenceanalysisoftheV3RegionofI6SrRNAcombinedwithcanonicalcorrespondenceanalysistocharacterizethebact

11、eriaverticaldistributioncharaclerislicsandbacterialcommunitystructureinthesoilfromthreetypicalcontaminatedzonesintheNorthChinaPlain.Accordingtotheanalysisofphysicalandchemicalsoilpropertiesinpollutedareas,thereweresomedominantindividualbacteriainthekeypathwaysofthenitrogencycleandsulfatemetabolism.I

12、tissuggestedthatthebacterialcommunitiesareaffectedbythedistributionsofammonia,nitrateandnitritenitrogen,showingthatthecommunitystructureinfonnationofthedominantpopulationincontaminatedsoilisanimportantparametertostudytheammonianitrogenpollutionmigiationrules.Keywords:vadosezone；ammoniapollution；micr

13、obialcomniunities;DenaturingGradientGelElectrophoresis(DGGE)；16SrKNA27NicoleD,BrunoG,SteffenK.MethanolrophiccommunitiesinBrazilianFerralsolsfromnaturallyforested,afforested,andagriculturalsitesJ'.AppliedandEnvironinenial.Microbiology,2010(76)：1307-1310.DNA片段含量成正比。然而該技術(shù)的缺點(diǎn)在于,膠體條帶的分辨率影響部分條帶的生物信息，不

14、能獲取到全部的樣品微生物信息。此外16SrRNA克隆文庫(kù)分析也是有效鑒定樣品微生物分予生物技術(shù),該方法能夠詳細(xì)地揭示樣本中微生物的多樣性,能夠?qū)悠肺⑸锓诸愯b定至種的水平。具體過(guò)程是將總DNA山樣本中提取出，應(yīng)用通用引物對(duì)其進(jìn)行16SrRNA基因的擴(kuò)增.進(jìn)而建立基因克隆文庫(kù).再以限制性內(nèi)切犧對(duì)其進(jìn)行酶切自由，通過(guò)對(duì)其I6SrR、A基肉前切圖潛的分析鑒定微生物的具體分類，得到微生物群落多樣性的信息。針對(duì)DGGE技術(shù)有限分辨率造成的信息缺失以及克隆文庫(kù)分析的覆蓋范圍局限，本文將DGGE技術(shù)與克隆序列結(jié)合，對(duì)微生物群落豐富度的差異進(jìn)行深層研究，同時(shí)通過(guò)典范對(duì)應(yīng)分析對(duì)污染源區(qū)微生物群落多樣性及生態(tài)分

15、布特征進(jìn)行評(píng)估，以期揭示氨氮污染源區(qū)包氣帶土壤理化性質(zhì)對(duì)其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的塑造作用，為通過(guò)細(xì)菌生態(tài)系統(tǒng)變化反映污染物在包氣帶中的分布和遷移規(guī)律提供理論依據(jù)。1實(shí)驗(yàn)部分11儀器和裝冒PCR擴(kuò)增儀（CFX9，美國(guó)Bio-rad公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（GelDocXR,美國(guó)Bio-rad公司），變性梯度凝膠電泳儀（DCode,美國(guó)Bio-rad公司），瓊脂糖凝膠電泳儀（DYCP-44P,北京六一儀器生產(chǎn)公司），小型高速臺(tái)式離心機(jī)（5418型，德國(guó)Eppdorf公司），高速冷凍離心機(jī)（3K3O,美國(guó)Sigma公司）,-80Y冰箱（美國(guó)ThennoElectronCorporation公司），高溫高壓滅

16、菌鍋（LDZM-60KCS,上海醫(yī)療器械廠），旋渦混合器（Vortex-Genie2T,美國(guó)ScientificIndustries公司），潔凈工作臺(tái)（SW-CJ-1FD,蘇州安泰），恒溫?fù)u床（THZ-82A型，蘇州威爾），電熱恒溫水槽（DK8I）,上海風(fēng)棱），電熱恒溫培養(yǎng)箱（D、P-9052,蘇州威爾），電子分析天平（AI204,美國(guó)梅特勒公司），哈納多參數(shù)測(cè)定儀（HI832O型，意大利Hanna公司）。12主要試劑去離子水（Millipore純化柱），丙烯酰胺（純度>99.0%,美國(guó)Sigma公司），雙丙烯酰胺（純度>99.9%,美國(guó)Promega公司），尿素（純度N99.5%

17、,美國(guó)Sigma公司）,Tris堿（純度'99.9%,美國(guó)Promega公司），EDTA二鈉（EDTA-Na2-2H20,純度"99.9%,美國(guó)Promega公司），去離子甲酰胺（純度99.5%,美國(guó)Amresco公司），甲酰胺（純度99.5%,美國(guó)Amresco公司），TEMED（純度N99%，美國(guó)Sigma公司），過(guò)硫酸被（純度N99.9%,美國(guó)Promega公司）,CTAB（生化級(jí)，純度N99.0%,美國(guó)Sigma公司）。乙酸（分析純，純度N99.5%）,乙醇（分析純,純度N99.7%）,NaOH（分析純，純度N99.5%）,甲醛（分析純，純度299.5%）,NaCl（

18、分析純，純度99.5%）,Na2HPO4（分析純，純度N99.5%）,KH2PO4（分析純，純度N99.5%）:這些試劑均購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。EB（10mg/mL母液，上海生工生物有限公司）,FastDNASpinKitforSoil（美國(guó)公司）,DNA膠網(wǎng)收試劑盒（北京天根生化科技有限公司）oTris-鹽酸溶液（1mol/L,pH8.0）：稱取Tris堿6.06g,加超純水40mL溶解，滴加濃鹽酸約2.1mL調(diào)pH至8.0,定容至50mLoEDTA（0.5mol/L,pH8.0）：稱取9.306g的EDTA二鈉，加超純水35mL,劇烈攪拌，用約1gNaOH顆粒調(diào)pH至8.0,定容至50mL

19、。TAE（50x）緩沖液：Tris-HC12mol/L,CTAB50minol/L,EDTA（0.5mol/L,pH=8.0）20mmol/L。PBS緩沖液（0.01mol/L,pH=7.4）配方:NaCl8g/L,KC10.2g/L,Na2HPO41.44g/L,KH,P040.24g/L0TE（1x）緩沖液：1mol/LTris-HCl（pH8.0）1mL,0.5mmol/LEDTA（0.5mol/L,pH=8.0）0.2mL。超純水定容至100mL013場(chǎng)地概況與樣品采集采樣區(qū)位于華北平原溫榆河畔與北京城區(qū)之間，區(qū)域平均海拔約20m,上覆厚度為1015m黏土層，含水層為410m,具體由埋

20、深02m的雜性土壤層、埋深為210m的粉質(zhì)黏土夾粉土層以及埋深為10-25m的粉砂-細(xì)沙層組成。取樣區(qū)域單層含水層厚度一般小于5m,部分地區(qū)可大于5m,累計(jì)厚度在20m左右，局部地段大于30m,整體滲透系數(shù)在30-50m/d之間。土壤樣品的采集點(diǎn)（T1、T2和T3）地處東經(jīng)116°33北緯39。59,范圍內(nèi),】'】位點(diǎn)位于靠近城區(qū)的生活潛在污染區(qū),T2位點(diǎn)位于市郊果蔬種植場(chǎng)地,T3位點(diǎn)為靠近溫榆河岸及垃圾填埋廠的污染區(qū)域。各站點(diǎn)土壤的野外采集完成后，迅速將樣品統(tǒng)一置于無(wú)菌盒中，貼好標(biāo)簽密封，返回實(shí)驗(yàn)室后置于-70無(wú)超低溫冰箱內(nèi)長(zhǎng)期保存，用于后續(xù)微生物計(jì)數(shù)和核酸提取。14樣品環(huán)

21、境因子測(cè)定土壤樣品pH值及電導(dǎo)率等參數(shù)利用哈納多H18320參數(shù)測(cè)定儀進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定，顆粒組成、土壤含水率、三氮含量及其他化學(xué)成分由后期實(shí)驗(yàn)測(cè)定,其他具體理化參數(shù)測(cè)定遵循表1所列的標(biāo)準(zhǔn)方法。表1上壤樣品環(huán)境因子測(cè)定方法Table1Determinationofenvironmentalfactorsinsoilsamples測(cè)試項(xiàng)目測(cè)試方法測(cè)試項(xiàng)目測(cè)試方法土填含水址質(zhì)量法態(tài)氮、總貌紫外分光光度法pH值電化學(xué)分析法亞硝態(tài)氮N-（l-恭基）-乙二胺光度法縝化還原電位電位法131囪字電感耦合等離子體顆粒組成比收計(jì)法I4J罔丁發(fā)射光諧法鉉態(tài)氮納氏比色法其他陰離r離子色諳法1.5熒光染料（DAPI）i，t

22、數(shù)取0.5g凍存土樣和3.5mL無(wú)菌水，用勻漿器充分混勻，再加1.5mL含有0.05%TritonX-KX）的3xPBS緩沖液，750g離心1min（約2500r/min）,取1mL上清液，與3mL4%多聚甲醛均勻混合,4弋放置過(guò)夜以固定細(xì)胞。1mL細(xì)胞固定液中加染料DAPI至終濃度為200ng/mL,染色10min后用細(xì)幽濾器過(guò)濾，使菌體集中在0.22jun聚碳酸濾膜（Walemum濾膜）上,取下濾膜置于載玻片上迅速進(jìn)行鏡檢;隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野中的菌體個(gè)數(shù)取平均值，計(jì)算出每克土樣中萌體細(xì)胞總數(shù)5。16樣品中總DNA提取及細(xì)菌16SrRNA-V3叮變區(qū)片段的擴(kuò)增取5g凍存樣品裝入10mL離心管

23、中，加入4mL裂解緩沖液3%CTABJOOmmol/LTris-鹽酸（pH=8.0）,100mmol/LEDTA（pH8.0）,1.4mol/LNaCl,2%R筑基乙醇（V7U）,1%PVP,充分研磨,旋渦振蕩儀劇烈振蕩，盡雖使沉積物懸浮于裂解緩沖液中。加入蛋白麗K至終濃度1mg/mL,55勾溫浴1h,其間每15min補(bǔ)充一次蛋白酶K。將裂解后的上清液分裝到4個(gè)1.5mL離心管中，加入等體積的氯仿-異戊醇（體積比24：1）,以12000g轉(zhuǎn)速4Y離心10min,抽提兩次。取上清液加1/10體積3mol/L醋酸鈉和預(yù)冷的等體積異丙醇，于-20幻放置1h后以12000g的轉(zhuǎn)速4無(wú)離心29815mi

24、n,棄上清液，剩余沉淀用1mL70%乙醇洗滌一次，自然干燥，用50皿IxTE緩沖液（pH=8.0）溶解沉淀"門。利用16SrRNA-V3區(qū)引物341F/534R擴(kuò)增樣品DNA序列，上游引物341F包括一段5黏性末端連接GC夾子結(jié)構(gòu)的前導(dǎo)區(qū)，具體序列成分見(jiàn)表2i。PCR反應(yīng)體系為：DNA模板I皿；引物10pmol；TaqDNA聚合的1U；2.5mol/LdNTP,4p.L；5xPCR緩沖液，10piL；Mg2+溶液1.6皿；去離了水補(bǔ)至50puLoPCR反應(yīng)條件為：95丁預(yù)變性4min，然后94丁變性30s,55幻退火30$和72X延伸1min,共35個(gè)循環(huán)，最后72T延伸10mino

25、PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到的PCR產(chǎn)物利用產(chǎn)物純化試劑盒（北京天根生化科技有限公司）進(jìn)行純化°表2引物序列Table2Primersequence引物序列34IF5'-CCTACCCCACGCAGCAG-3，534R5'-ATIACCGCGGCTCCTCC-3'34IF-GCS'一CCCCCGCCGCGCGCCGCGGGCGGGGCCCGGGCACGCCCCGCCTACCGCAGGCAGCAG-3'MI3-475'-TAATACGACTCACTATAGGGC-3，RV-M5*-ATTTAGGTGACACTATAGA

26、ATACTC-3'1.7細(xì)菌16SrRNAV3可變區(qū)片段的DGGE分肉與聚類分析將40jiL的16SrRNA-V3區(qū)PCR膠P）收產(chǎn)物，用變性梯度凝膠電泳儀（D-Codesystem,BIO-RAD,Hercules,CA,USA）進(jìn)行DGGE分離,PAGE膠濃度為8%,變性梯度30%60%.60Y,80V電壓，1xTAE（20mmol/LTris基質(zhì)，10mmol/L醋酸鈉,0.5mmol/LEDTA）緩沖液中運(yùn)行13ho電泳后EB染色30min,置于凝膠成像儀紫外光下檢測(cè)并照相。利用NTsys軟件對(duì)DCGE凝膠電泳膠體上條帶位置及條帶亮度進(jìn)行測(cè)定'，對(duì)DGGE條帶分離出的優(yōu)

27、勢(shì)菌群進(jìn)行LPGMA聚類及豐度分析，得到以皮爾森相似度為基礎(chǔ)的聚類分析結(jié)果，并通過(guò)離差平方和法繪制聚類樹(shù)狀圖。聚類樹(shù)狀圖中，縱軸站點(diǎn)兩個(gè)對(duì)象延長(zhǎng)線交線垂直于橫軸相似系數(shù)，對(duì)應(yīng)橫軸上的數(shù)據(jù)即為兩者之間的相似度。同樣,4個(gè)層位延長(zhǎng)線與另外4個(gè)層位延長(zhǎng)線的垂直交線對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù).即為兩站點(diǎn)間的相似程度。1.8細(xì)御16SrRNA-V3區(qū)序列的克隆和測(cè)序紫外燈下對(duì)成型的DGGE凝膠進(jìn)行檢測(cè)，將紫外光激發(fā)下可見(jiàn)的凝膠條帶切下，用去離子水沖洗3次后，浸入50似，去離子水中,4丁過(guò)夜沉淀。取各樣品浸出液2jxL為模板再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，二次PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后，連接到PMD18-T載體（TAKARA，大連

28、）上,經(jīng)熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10細(xì)胞中，涂布含有Amp/X-Gal/IPTG的LB平板,37勾靜置培養(yǎng)16ho然后4幻靜置Ih,使藍(lán)色充分顯現(xiàn)后，隨機(jī)調(diào)取白色函落到新的培養(yǎng)平板內(nèi)過(guò)夜培養(yǎng)。隨機(jī)挑取單個(gè)白色菌落，加入含100jiLddH2O的PCR管內(nèi).置于PCR儀99丁加熱裂解細(xì)胞c取2皿裂解液作為模板，利用M13-47和RV-M為引物（具體序列列于表2）,進(jìn)行后續(xù)的PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證插入片斷的大小，篩選陽(yáng)性克隆。將篩選好的陽(yáng)性克隆保存于1mL含有20%H油的液體LB培養(yǎng)星中，每個(gè)平板隨機(jī)選取10株已得到驗(yàn)證的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序（BGI,北京）o1.9典范對(duì)應(yīng)分析（CCA）將三個(gè)站點(diǎn)土壤樣品

29、的理化因子數(shù)據(jù)，包括pH值、Eh值、含水率、硝態(tài)氮含筮、亞硝態(tài)氮含雖、氨態(tài)敏含量、紐離子及氯離含量，與克隆文庫(kù)測(cè)得的上壤細(xì)菌群落組成進(jìn)行了典范對(duì)應(yīng)分析,分為兩個(gè)數(shù)據(jù)矩陣,即土壤理化因子數(shù)據(jù)矩陣以及土壤細(xì)菌排落組成數(shù)據(jù)矩陣。通過(guò)Canoe。軟件計(jì)算分析出生態(tài)重要理化因了與土壤細(xì)菌群落分布之問(wèn)的相丘影響關(guān)系,從而分析出單個(gè)環(huán)境因子對(duì)細(xì)弟群落組成的具體影響。1.10核酸序列世錄號(hào)通過(guò)隨機(jī)測(cè)序共獲得107個(gè)16SrRNA-V3區(qū)序列，利用Check-Chimera檢測(cè)（http:/cgis/llimera.cgi?su=SSL），將其中的嵌合體等不正常的序列剔除,81個(gè)

30、屬于正常序列。本實(shí)驗(yàn)中采用的全部序列已提交到GenBank,序列號(hào)（AccessionNumber）為HQ916750HQ916804。111系統(tǒng)發(fā)育與統(tǒng)計(jì)分析獲得的16SrRNA-V3區(qū)序列通過(guò)BLAST工具從GenBank獲得與本實(shí)驗(yàn)所得到序列親緣關(guān)系最近的類群序列。使用Thompson等"刁的方法對(duì)這些16SrRNA序列進(jìn)行比對(duì)，然后利用MEGA3.0中的Neighbor-Joining模型進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化分析。并利用DOTUR軟件（以DNA序列間距劃分微生物分類及多樣性的軟件）版本1.53比較本實(shí)驗(yàn)三個(gè)站點(diǎn)共12個(gè)土層樣品的細(xì)菌多樣性,將相似性298%的細(xì)菌I6SrRNA基

31、因序列歸為同一可操作分類單元（OUT）。2結(jié)果與討論2.1士壤樣品細(xì)曲總數(shù)統(tǒng)計(jì)及環(huán)境理化因素測(cè)定站點(diǎn)細(xì)電總數(shù)/酸堿度pH含水率/%代化還原電位Eli/mV干重mgkg'1)土峰巖性(CUFL)深度/mNH4-NNO,-Nno2-nSO?T1-1粉質(zhì)黏土5.37x1091.948.7320.53247.002.240.460.0856.22Tl-2黏土夾砂7.27x10s3.278.7316.75201.000.520.470.1236.61T1-3粉細(xì)砂8.17xlO67.458.6318.34133.100.420.690.139.82Tl-4細(xì)砂2.64xI058.218.6817

32、.26107.200.531.960.126.62T2-1黏土8.87xlO90.958.1417.77566.0021.0422.2116.8819.04T2-2粉土1.53xl0R2.218.7117.75187.604.885.090.3524.38T2-3粉細(xì)砂8.31xlO64.008.333.83284.009.972.040.4349.83T2-4粉土9.53xIO68.158.569.83226.0066.5911.610.8133.2913-1黏上夾砂3.22xlO70.278.550.17491.000.464.561.34448.0513-2福土含砂1.54xlO81.2

33、38.6319.17372.00l.ll4.062.4729.10T3-3中細(xì)砂8.00xlO63.258.6218.0290.702.483.210.5945.75T3-4粗砂1.60xlO54.218.7316.8786.005.163.680.5228.00表3各點(diǎn)位土壤樣品理化參數(shù)及微生物數(shù)量統(tǒng)計(jì)Table3physicochemicalfactorsandmicroorganismsofsoilsamples實(shí)驗(yàn)區(qū)三個(gè)站點(diǎn)土壤樣品的pH值均為8.0以上;含水量在各點(diǎn)的變化較小，均在15%以上;氨氮含量及硝基氮含在T2站點(diǎn)積累較為明顯,在站點(diǎn)T3積累其次，而T1站點(diǎn)三氮含量:檢出較站點(diǎn)

34、T2與T3明顯減少，亞硝氮在站點(diǎn)T3的表層位點(diǎn)含量較高，在T1站點(diǎn)及T2站點(diǎn)中沒(méi)有明顯積累;三個(gè)站點(diǎn)中硫酸鹽含量不均，在6.62448.05mg/kg之間（表3）。各站點(diǎn)12個(gè)土壤樣品中，土壤巖性細(xì)菌總數(shù)在1.6x1058.87xIO。范圍之內(nèi)。研究區(qū)剖面上壤樣品各環(huán)境因素的測(cè)定結(jié)果表明，總氮及各類污染氮素的分布及含童在各采樣站點(diǎn)差異明顯，最高站點(diǎn)約是最低站點(diǎn)的60倍。取樣位點(diǎn)的土壤環(huán)境中NO2-N、NO-N、Nf-N、so：-等陰離了的含鼠過(guò)高，表明研究區(qū)土壤處于氮素及無(wú)機(jī)鹽類污染狀態(tài)，地下水環(huán)境極有可能因此受到威脅。其中，研究區(qū)T1位點(diǎn)土壤的總微生物量隨地層深度加深明顯減少，說(shuō)明細(xì)菌數(shù)量隨

35、地層增加、有機(jī)質(zhì)含量減少而減少。同時(shí)，表3數(shù)據(jù)還反映出，研究區(qū)內(nèi)部水平方向微生物筋群分布基本均勻.但影響細(xì)菌總數(shù)的因素并不單-,研究區(qū)T2站點(diǎn)中深層位點(diǎn)（地下8m左右）與中層位點(diǎn)（地下3m左右）的細(xì)曲總量同屬一個(gè)數(shù)量級(jí)，說(shuō)明其他土壤理化因素的改變，如污染氮素的異常積累、土壤含水率及溶氧技等同樣是影響土壤微生物總雖的關(guān)鍵因素。研究區(qū)站點(diǎn)同樣存在特例,表層的細(xì)菌總數(shù)略低地下淺層的細(xì)菌總數(shù)，說(shuō)明土壤樣品中細(xì)菌的含雖并非隨地層加深而增多，站點(diǎn)中土壤顆粒組成變化仍是影響細(xì)前總量的主要因素。2.2基于DGGF：的微生物多樣性分析對(duì)研究區(qū)T1、T2及T3共12個(gè)土層進(jìn)行變性梯度凝膠電泳（DGGE）的測(cè)定，結(jié)

36、果表明三個(gè)站點(diǎn)的上壤細(xì)菌群落具有較為明顯的差異（如圖1所示）。12個(gè)泳道中產(chǎn)生的條帶均聚集在膠體的中間部位（該區(qū)域的變性濃度屬于高低混合）。DGGE膠體圖譜中共出現(xiàn)85條可見(jiàn)條帶，并標(biāo)注出35條亮度明顯、位置清晰的DGGE膠體條帶，代表土壤樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌16SrRNA目的片段，進(jìn)行后續(xù)序列分析。DGGE膠體圖譜中，站點(diǎn)T1中表層土壤及淺層土壤的DGGE條帶分布較為相似，各層位條帶隨深度增加亮度降低、種類也相應(yīng)減少，部分菌群（條帶1、3、4、6、8、9）表現(xiàn)尤為明顯。結(jié)合表3中各站點(diǎn)土壤理化參數(shù)分析，包氣帶土壤剖面表層至底層之間微生物多樣性發(fā)生的明顯改變，與層位加深后上壤顆粒結(jié)構(gòu)改變?cè)斐傻挠袡C(jī)質(zhì)

37、積累變化相關(guān)。同時(shí)表現(xiàn)在DGGE圖譜中，站點(diǎn)T2各層位的條帶隨層位加深變化并不明顯，除部分菌群（條帶17、18、19、21、24）為個(gè)別層位的特別優(yōu)勢(shì)菌群外，其他菌群（條帶12、13、14、15、20）均貫穿于所有層位土壤之中，這與該位點(diǎn)各層位相似的土壤顆粒組成（表層至底層多以黏土及粉質(zhì)黏土為主），及相似的污染物積累狀態(tài)（氮污染積累較為明顯）關(guān)系密切。站點(diǎn)T3在DGGE圖譜中的條帶分布表明,表300圖1三個(gè)站點(diǎn)12個(gè)層面上壤樣品16SrR、A-V3可變區(qū)的DGGE圖潛Fig.ID（；（；Eprofilesof（he16SrDNA-V3regionof（hrtwelvelayersalongth

38、esoilsamplethreestations層及淺層I.壤的細(xì)菌群落分布相似性很高，條帶2734所對(duì)應(yīng)的細(xì)菌菌群在兩層位中的含量存在差異，而細(xì)菌種類兒乎沒(méi)有改變，但該層位見(jiàn)水較淺，且土壤顆粒變化較大，因此表層及淺層中大量存在的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落在位處淺層他水帶的13-3及T3-4層位中逐漸消亡，僅有少量?jī)?yōu)勢(shì)菌群存在（條帶29、30、31）并新增一種優(yōu)勢(shì)菌（條帶35）,說(shuō)明該位點(diǎn)土壤顆粒吸附細(xì)菌的能力隨土壤剖面加深而減弱，同時(shí)較深層位污染物濃度的增加,也是造成土壤剖而細(xì)菌多樣性分布差異明顯的主要原因。使用軟件NTsysVersion2.0131根據(jù)DGGE圖譜中每條帶所建立的矩陣進(jìn)行聚類分析，通過(guò)

39、非加權(quán)組平均法（UPGMA）分析表明三個(gè)站點(diǎn)之間的群落結(jié)構(gòu)相似程度均存在變化，聚類圖如圖2所示，橫線鏈接的末端垂線所對(duì)應(yīng)的數(shù)值即為兩者的相似程度，如圖中站點(diǎn)T1表層Tl-1與T1-3的微生物群落結(jié)構(gòu)最相近，相似度為90%左右。說(shuō)明T1-3中部分微生物種群在較深地層仍然存在。地下淺層T1-2與表層T1-1相比，微生物群落結(jié)構(gòu)變化稍明顯，相似度為86%。而隨著地層的加深，底層T1-4的微生物群落分布明顯不同于另外三層，相似度約只有75%。同樣站點(diǎn)T2各層位的微生物群落結(jié)構(gòu)也存在差異,T2-2層與其他三層差別最明顯，相似度只有76%左右，而地層12-4與T2-I及T2-3兩層的群落結(jié)構(gòu)相似度則保持在

40、80%以上，其中表層T2-1與地下深層T2-3的微生物群落結(jié)構(gòu)相似度最高，達(dá)到88%。丫-變形簫酸桿菌7%放線菌3%擬桿菌4%厚壁南4%芽布桿菌5%產(chǎn)黃桿陶2%a-變形菌7%&變形菌7%綠彎菌3%站點(diǎn)層位|T1-1'TI-3TI-2ITI-4|T3-1T3-2一|T3-3T3-4T2-1IT2-3T2-4T2-20.570.650.730.800.880.96相似系數(shù)圖2DGGE分離所得細(xì)常I6SrRNA-V3|乂序列的NTSYS聚類圖Fig.2NTSYSdendrogrambasedon16SrRNA-V3regionsequencesfromDGGE站點(diǎn)T3的各層位群落結(jié)構(gòu)

41、差異較為明顯，反映在圖譜中的成層分布差異較大。表層T3-1與T3-2之間的相似度達(dá)到96%,而深層T3-3與T3-4之間的群落結(jié)構(gòu)相似度同樣為96%。但較淺兩層與較深兩層之間的差異明顯，只達(dá)到80%,說(shuō)明淺層與深層土壤剖而的微生物群落結(jié)構(gòu)變化較大。反映在三個(gè)站點(diǎn)之間的群落結(jié)構(gòu)相似性，站點(diǎn)T1與站點(diǎn)T3的群落結(jié)構(gòu)較為接近，相似度達(dá)到75%,而站點(diǎn)T2與其他兩個(gè)站點(diǎn)T1、T3差異較大，相似度只有57%。說(shuō)明微生物菌群在站點(diǎn)T1及T2之間變化不大，但站點(diǎn)T3與站點(diǎn)T1及T2的細(xì)曲.群落結(jié)構(gòu)分布差異均比較明顯，原因在于站點(diǎn)T3緊靠溫榆河畔，包氣帶地層見(jiàn)水層位較淺，土質(zhì)成多為砂質(zhì)土壤，造成站點(diǎn)T3的微生

42、物群落結(jié)構(gòu)變化明顯。2.3細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育分析將DGGE分離出的優(yōu)勢(shì)細(xì)兩條帶（分別標(biāo)記為條帶135）在NCBI基因庫(kù)（NCBI,/）中進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)區(qū)12個(gè)土壤樣品中提取出的81個(gè)正常細(xì)菌16SrRNA序列共54個(gè)不同親緣類型（OUT）,分屬于11個(gè)系統(tǒng)發(fā)育門類。如圖3所示，各分屬具體細(xì)菌門類及所占細(xì)菌總親緣類型比例分別為：a-變形細(xì)茜（7%）,8-變形細(xì)菌（10%）"-變形細(xì)菌（25%）,S-變形細(xì)菌（7%）壁前（4%），酸桿菌（7%）,放線菌（3%），綠彎菌（3%）,擬桿菌（4%）,產(chǎn)黃桿曲（2%），芽單胞幽（5%

43、）和未分類細(xì)菌（26%基于16SrDNA基因序列相似性298%的準(zhǔn)則，0變形菌未分類細(xì)菌26%a-變形菌綠彎菌。酸桿蔭8變形菌厚壁菌擬桿蔭Y-變形菌產(chǎn)黃桿菌芽弛桿菌&變形菌放線維未分類細(xì)茜圖3研究區(qū)三站點(diǎn)各層位總微生物胖落組成Fig.3Microbialcommunitycompositionofsoilhorizonsfromthreestationsinresearcharea選取DGGE圖譜（圖1）中得到的部分代表?xiàng)l帶進(jìn)行序列系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明細(xì)菌類群在不同站點(diǎn)和層位中的分布存在顯著差異。如圖4所示,T1站點(diǎn)4個(gè)層位樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群是y-變形細(xì)萌（代表?xiàng)l帶3、7）,3-變

44、形細(xì)菌（代表?xiàng)l帶2、8）-變形細(xì)菌（代表?xiàng)l帶5）,綠彎菌（代表?xiàng)l帶1），厚壁菌（代表?xiàng)l帶4、9）和芽抱桿菌（代表?xiàng)l帶6）,另外在該站點(diǎn)深層區(qū)域T1-4上壤樣品中，檢出少量產(chǎn)黃桿萌（代表?xiàng)l帶10）和放線菌（代表?xiàng)l帶11）。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該站點(diǎn)土壤總細(xì)弟中y-變形細(xì)菌在所占比例最大為36.4%,其次是厚壁菌和3-變形細(xì)菌（占到18.2%），綠彎菌占到13.6%，芽弛桿菌所占比例為9%,產(chǎn)黃桿笛及放線菌所占總菌類的比例僅為4.5%，其余菌種屬于未分類細(xì)菌。隨著深度的增加.底層T1-4中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌主要為產(chǎn)黃桿前。該站點(diǎn)由于表層覆蓋建筑垃圾雜填土，淺層土壤顆粒為粉質(zhì)黏土，深層主要由粉細(xì)砂、細(xì)砂組成。

45、地卜,污染氮素及以硫酸根高子為代表的無(wú)機(jī)鹽在粉質(zhì)黏土及黏土層積累明顯，在以細(xì)砂為主的土層中含最迅速降低,y-變形細(xì)曲占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。另外厚壁街、5-變形細(xì)菌、芽弛桿菌和綠彎菌同樣是表層的優(yōu)勢(shì)細(xì)萌群，其中厚壁菌類細(xì)南與來(lái)自植物根系土壤的細(xì)菌親緣性較高），尤其發(fā)現(xiàn)一類異養(yǎng)脫氮細(xì)菌Bacillussp,菌屬與氮循環(huán)密切相0000.«.、/、Z7ZVzz/-L80206040i11.z/A1蓍1A!11z.，/'/ii£|1£a1sl1§811*未分類細(xì)的芽抱桿情擬桿摘酸桿倆口放線菌H產(chǎn)黃桿菌厚壁的綠彎的方變形菌大變形前a缶變形菌甲變形菌T2.22-32-.

46、4T2T33T3-4n圖4三個(gè)站點(diǎn)各層位細(xì)偶組成統(tǒng)計(jì)Fig.4Bacterialcom|w）sitionfromthreestationsinresearcharea關(guān)|叫。另有分屬于5-變形菌的除硫單胞菌屬（Desulfuromonas）被認(rèn)為在硫循環(huán)中具有重要的作用“，同樣僅存在于土質(zhì)為粉質(zhì)黏土和黏土夾細(xì)砂的Tl-1及T1-2層位中，說(shuō)明相對(duì)砂質(zhì)土壤硫酸根離子-蓄積量較高的黏七質(zhì)土壤為是該類細(xì)菌.生存的首選環(huán)境,T2站點(diǎn)4個(gè)層位樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群是變形細(xì)菌（代表?xiàng)l帶I4、23）,y-變形細(xì)|將（代表?xiàng)l帶12、19、24、25）,a-變形細(xì)菌（代表?xiàng)l帶20,21）.擬桿菌（代表?xiàng)l帶15.2

47、2）,5-變形細(xì)菌（代表?xiàng)l帶I6J7、】8）,產(chǎn)黃桿菌（代表?xiàng)l帶26）和酸桿菌（代表?xiàng)l帶13）o序列測(cè)試結(jié)果顯示，各類細(xì)菌所占該站點(diǎn)總菌比例分別為/?-變形細(xì)菌（21.6%）、y-變形細(xì)菌（19.6%）、a-變形細(xì)菌（17.6%）、擬桿菌（17.6%）、5-變形細(xì)菌（5.9%）、酸桿菌（7.8%）和產(chǎn)黃桿菌（2%）.其余屬于未分類細(xì)菌。該站點(diǎn)位于長(zhǎng)期受到含氮類農(nóng)藥污染的城郊果蔬種植園,分析其土壤環(huán)境發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域氨態(tài)氮積累極為嚴(yán)重，尤其在地卜淺層與飽和帶之間積累更加顯著。硝態(tài)氮及亞硝態(tài)氮含量隨層位加深呈遞減趨勢(shì),說(shuō)明在這些層位的土壤微環(huán)境中發(fā)生了較為明顯的反硝化作用，其中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌均屬于反

48、硝化細(xì)菌類別，如假單胞菌和反硝化|W（ParacoccusfMintotrophusATCC35512）O此類細(xì)菌能夠利用硝酸根、亞硝酸根、氮釵化物作為末端電子受體，以還原性硫化物為能源生長(zhǎng)F-22.進(jìn)而解釋了站點(diǎn)T2中亞硝態(tài)瓶隨層位增加的現(xiàn)象。另外，分屬變形菌y亞綱的高度耐鹽W鹽單胞菌（Hulonunwssp.）生存于硫酸鹽含原較高的T2站點(diǎn)粉質(zhì)土壤中，與其親緣關(guān)系最近的物種來(lái)自于苯乙酸廢水的高鹽污泥'，這類細(xì)菌的存在多數(shù)受污染鹽類含量的影響。T2站點(diǎn)的各層位中還存在著各類有機(jī)污染的降解菌，如分屬于3-變形細(xì)菌的地桿菌（Geobaeteraceae）、放線菌、變形菌以及擬桿菌等，這些

49、門類的細(xì)菌多來(lái)自混合污染土壤及淤泥中：24_251o但草地土壤街、農(nóng)田）等環(huán)境的常見(jiàn)細(xì)菌綠彎菌、芽抱桿曲及厚壁菌未在T2站點(diǎn)中檢出。T3站點(diǎn)4個(gè)層位樣品中y-變形細(xì)菌（代表?xiàng)l帶30、31、32、35）占較大優(yōu)勢(shì)，是總菌量的17.6%,6-變形細(xì)幽（代表?xiàng)l帶33）愣-變形細(xì)曲.（代表?xiàng)l帶28）、芽抱桿菌（代表?xiàng)l帶29）、擬桿菌（代表?xiàng)l帶34）和酸桿菌（代表?xiàng)l帶27）所占比例均在8.0%左右，厚壁兩及產(chǎn)黃桿菌所占比例僅為2.1%,其余曲種屬于未分類細(xì)菌。毗鄰河道的站點(diǎn)T3,與站點(diǎn)T1及T2相比，飽水帶層位較淺，土壤密度較大,砂含量較高。由于主要顆粒幻成為粉土夾粉細(xì)砂的表層土壤T1，相比有黏土夾層的

50、淺層土壤12積累污染物質(zhì)及吸附微生物的能力略差，剖面表層T3-1、T3-2層位的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群組成屬于群落多樣性較為豐富的一層。站位T3氨態(tài)氮含量由淺層到深層飽和層逐漸增加，黏質(zhì)土壤層位T3-1中硝態(tài)知及亞硝態(tài)氮也有明顯積累,微生物數(shù)量和種類較為豐富。但隨著層位的加深,土壤受污染程度加大，包氣帶砂質(zhì)土壤中微生物吸附能力衰減，使微生物尤其是優(yōu)勢(shì)硝化菌群減種類大幅下降，硝化反應(yīng)程度減弱，氨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮及亞硝態(tài)氮的程度也連鎖性降低，造成細(xì)菌的群落多樣性隨著取樣地層的加深而明顯減少。2.4細(xì)慎類群的分布與環(huán)境因*的典范對(duì)應(yīng)分析（CCA）各站點(diǎn)三氮雖、含水率、pH值、總氮、陰離子含珀等環(huán)境因子與克隆文庫(kù)

51、細(xì)菌群落的典范對(duì)應(yīng)分析結(jié)果顯示（圖5）,實(shí)驗(yàn)區(qū)各采樣站點(diǎn)微生物組成在二維排序圖上的分布與各種理化因子具有一定的聯(lián)系。位于二維排序圖左上方的物種有變形菌、放線萌、芽單胞菌和擬桿菌等,在實(shí)驗(yàn)區(qū)土壤中的分布與總氮含成呈明顯正相關(guān)。放線菌及a-變形幽的分布與陰離子因素有一定的相關(guān)性，同時(shí)。-變形菌門與硝基氮含最顯著正相關(guān)，而亞硝基氮含量及氨敏含量是影響排序圖中右下方變形萌分布的關(guān)鍵參數(shù)。5-變形細(xì)菌和含水最具有顯著的正相關(guān)性，與其他陰高于因素，如氟離子等，也有一'定的相關(guān)性，表明這類細(xì)菌主要分布在鹽類含量較高的地區(qū)。圖5左下方的綠彎菌、壁厚菌受含水量及pH值影響較大,這兩種參數(shù)值的平穩(wěn)與否決定

52、了兩類萌群生長(zhǎng)的狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)區(qū)存在的未分類菌群分布受pH值及含水量影響較大，同時(shí)與亞硝基氮及氨短含址呈負(fù)相關(guān)。圖5實(shí)驗(yàn)區(qū)三位點(diǎn)中各細(xì)儡類群與環(huán)境關(guān)系的CCA二維排序圖Fig.5CCAbiplotofsamplesandenvironmentalfactorsfromthreestationsofresearcharea圖中各箭頭標(biāo)注代表的環(huán)境因子為:TN一總氮；Eh軾化還原電位;NO；-N暗基氮；NO；-N-亞硝基氮；NH；-N-氨氮；WC含水缺；pH-pH值；FCl"-MT；SOf-硫酸根離;NO；-無(wú)機(jī)鹽硝酸根。三角圖拆代表文庫(kù)所包含的所有微生物種群分屬的門類:Act放線菌；Un未

53、分類序列；gay-變形Bal擬桿菌；aia-變形菌；be尸-變形州deS-變形菌；Fir-壁厚菌；Chi一綠彎菌；Gem芽單胞菌；Fla-產(chǎn)黃桿爵3結(jié)語(yǔ)本研究樣品所處的地下水系統(tǒng)中具有顯著的空間特異性，地下水系統(tǒng)中微生物群落沿不同地層的成層分布特征與地球化學(xué)特征的成層分布相吻合。地下微環(huán)境中存在的微生物群落多為與氮循環(huán)有關(guān)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌個(gè)體，而總體群落結(jié)構(gòu)分析表明該區(qū)域存在的微生物及其群落還參與著生態(tài)系統(tǒng)中硫酸鹽等無(wú)機(jī)離子代謝的過(guò)程。研究結(jié)果表明研究區(qū)各站點(diǎn)土壤顆粒結(jié)構(gòu)是影響包氣帶環(huán)境中多種污染物遷移轉(zhuǎn)化及微生物群落多樣性的關(guān)鍵，污染物在土層中的分布變化是細(xì)前群落結(jié)構(gòu)更替的主要驅(qū)動(dòng)力，而土壤中的微

54、生物也是污染物遷移過(guò)程中不可或缺的作用因素。通過(guò)對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布與包y帶土壤環(huán)境的地球化學(xué)性質(zhì)分析，本研究揭示了地下水微環(huán)境中典型污染物遷移與細(xì)慎生態(tài)系統(tǒng)具有密切相關(guān)性，將為進(jìn)一步研究包氣帶土壤理化參數(shù)對(duì)地下水環(huán)境的影響奠定基礎(chǔ)。4參考文獻(xiàn):IWilliamJII.Vadosczonemierobialbioliarriersremovenitratefrompercolatinggroundwater'J.CurrentMicrobiology,2009(58)：622-627.'2MamieNI.KateMS,DennisER.Reductionofperrhloralt

55、*andnitratebymicrobialcommunitiesinvadosesoil:J.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2005,71(7)；3928-3934.3 卞華松，張仲燕.冷凍固定化優(yōu)勢(shì)萌群處理含甲醛苯酚廢水J.環(huán)境科學(xué),1998.19(2)：39-42.4 趙娟.呂劍，何義亮，靳強(qiáng).張文英，何霞.異養(yǎng)脫敏菌株Bacillus$p.LY降解有毒有機(jī)污染物的研究J.環(huán)境科學(xué).2007,28(12):2838-2842.5 袁勇軍.陸兆新，黃麗金.呂鳳霞.別小妹.煙堿降解細(xì)菌的分離鑒定及其降解性能的初步研究J.微生物學(xué)報(bào),2005.45(2

56、)：181-184.6 洪青.張忠輝.張曉舟.徐劍宏.李順胳.中度嗜鹽偏Halomonassp.BYS21啟動(dòng)子的克隆和測(cè)序J.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2005,11(6)：729-732.7 MyersBM,FischerSG,ManiatisT.M(HlificationofIhemeltingpropertiesofduplexDNAbyattachmentofaGC-richDNAsequenceasdeterminedbydenaturinggradientgelelectrophoresis_JJ.NucleicAcidsResearch,1985,13：3111-3129.I8Muy

57、zerG,BrinkhoffT,NubelU.Denaturinggradientgelelectrophoresis(DGGE)inmicrobialecologyJ.MolecularMicrobialEcologyManual,1998,3(44)：I-27.91ZweifelUL,HagstrornA.Totalcountsofmarinebaderiaincludealargefra(*tionofnon-nucleoid-containingIwiclrria(ghosts)J1.AppliedandEnviron-mentalMicrobiology,1995.61(6)：2180-2185.10SchallenbeiM,Kalfl*J,RasmussenJB.Solutionstoproblemsinenumeratingsedimentbacteriabydirectcount.J.Applie