1、細胞培養中細節問題基礎篇基礎篇- -無菌操作基本技術無菌操作基本技術 1. 1. 實驗進行前，無菌室及無菌操作臺實驗進行前，無菌室及無菌操作臺(laminar flow) (laminar flow) 以紫外燈照射以紫外燈照射30-60 30-60 分鐘滅菌，以分鐘滅菌，以70 %ethanol 70 %ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風扇運轉擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風扇運轉10 10 分鐘后，才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株，且即使培養基分鐘后，才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株，且即使培養基相同亦不共享培養基，以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后

2、，將實驗相同亦不共享培養基，以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以物品帶出工作臺，以70 % ethanol 70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間隔應讓無菌擦拭無菌操作抬面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉操作臺運轉10 10 分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。 2. 2. 無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應移出，以利于氣流之取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應移出，以利

3、于氣流之流通。實驗用品以流通。實驗用品以70 % ethanol 70 % ethanol 擦拭后才帶入無菌操作臺內。實驗操作應擦拭后才帶入無菌操作臺內。實驗操作應在抬面之中央無菌區域，勿在邊緣之非無菌區域操作。在抬面之中央無菌區域，勿在邊緣之非無菌區域操作。 3. 3. 小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約握住瓶身，傾斜約4545 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上

4、放置桌面。角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。 4. 4. 工作人員應注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進行工作人員應注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作，并實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作，并選擇適當等級之無菌操作臺選擇適當等級之無菌操作臺( (至少至少Class II)Class II)。操作過程中，應避。操作過程中，應避免引起免引起aerosol aerosol 之產生，小心毒性藥品，例如之產生，小心毒性藥品，例如DMSO DMSO 及及TPA TPA 等，等，并避免尖銳針頭之傷害等。并避免尖銳針頭之傷害

5、等。 5. 5. 定期檢測下列項目：定期檢測下列項目： 5.1. CO2 5.1. CO2 鋼瓶之鋼瓶之CO2 CO2 壓力壓力 5.2. CO2 5.2. CO2 培養箱之培養箱之CO2 CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染濃度、溫度、及水盤是否有污染( (水盤的水盤的水用無菌水，每周更換水用無菌水，每周更換) )。 5.3. 5.3. 無菌操作臺內之無菌操作臺內之airflow airflow 壓力，定期更換紫外線燈管及壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA HEPA 過濾膜，預濾網過濾膜，預濾網(300(300小時小時/ /預濾網，預濾網，3000 3000 小時小時/HEPA)/HEPA)

6、。 6. 6. 水槽可添加消毒劑水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水。，定期更換水槽的水?；A篇基礎篇- -實驗用品實驗用品 1. 種類種類 1.1. 細胞培養實驗用品均為無菌，除了玻璃容器細胞培養實驗用品均為無菌，除了玻璃容器與與pasteur pipet 外，其它均為塑料無菌制品。外，其它均為塑料無菌制品。 1.2. TC 級培養盤表面均有級培養盤表面均有coating 高分子物質高分子物質以讓細胞吸附，培養容器種類有以讓細胞吸附，培養容器種類有Tflask，plates, dishes, roller bottle 等，依實驗需要

7、使用。等，依實驗需要使用。 1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml 1.4. 塑料離心管塑料離心管: 15 ml, 50 ml，均有，均有2 種不種不同材質，其中同材質，其中polypropylene (PP) 為不透明材質，為不透明材質，polystyrene (PS) 為透明材質，可依實驗需要而為透明材質，可依實驗需要而選擇適合材質之離心管。選擇適合材質之離心管。 1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉廢，用以抽掉廢棄培養液等。棄培養液等。 1.6. 玻璃血清瓶玻璃血清瓶(Pyr

8、ex or Duran glassware)：100 ml, 250 ml,500 ml,1000ml 2. 清洗清洗 2.1. 新購玻璃血清瓶先以新購玻璃血清瓶先以0.10.05 N HCl 浸泡數浸泡數小時，洗凈后才開始使用。小時，洗凈后才開始使用。 2.2. 用過之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分用過之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈，勿加清潔劑清洗。別用一次與二次去離子水沖洗干凈，勿加清潔劑清洗。 3. 滅菌滅菌 3.1. 實驗用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽實驗用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌滅菌121, 15 lb, 20 分鐘

9、，置于分鐘，置于oven 中烘干。中烘干。 3.2. 實驗用玻璃實驗用玻璃pasteur pipet 以干熱滅菌以干熱滅菌170, 4 小時。小時。 3.3. 液體或是固體廢棄物可用液體或是固體廢棄物可用10 % hypochloride 溶液溶液(次氯酸，即漂白水次氯酸，即漂白水) 或是蒸汽高壓滅菌或是蒸汽高壓滅菌121 , 15 lb, 20 分鐘處理。分鐘處理。 基礎篇基礎篇- -培養基培養基 1. 液體培養基貯存于液體培養基貯存于4 冰箱，避免光照，實驗進行冰箱，避免光照，實驗進行前放在前放在37 水槽中溫熱。水槽中溫熱。 2. 液體培養基液體培養基(加血清加血清) 存放期為六個月，期

10、間存放期為六個月，期間glutamine 可能會分解，若細胞生長不佳，可以再添加可能會分解，若細胞生長不佳，可以再添加適量適量glutamine。 3. 粉末培養基配制粉末培養基配制(以以1 升為例升為例)： 3.1. 細胞培養基通常須添加細胞培養基通常須添加10 % 血清，因此粉末培血清，因此粉末培養基之配制體積為養基之配制體積為900 ml，pH 為。為。NaHCO3 為另外為另外添加，若將添加，若將NaHCO3 粉末直接加入液體培養基中會造粉末直接加入液體培養基中會造成成pH 之誤差，或局部過堿。因此粉末培養基及之誤差，或局部過堿。因此粉末培養基及NaHCO3 粉末應分別溶解后才混合，然

11、后用粉末應分別溶解后才混合，然后用CO2 氣體氣體調整調整pH，而非用強酸，而非用強酸(HCl)或強堿或強堿(NaOH)，因為氯離，因為氯離子對細胞生長可能有影響，且貯存時培養基的子對細胞生長可能有影響，且貯存時培養基的pH 易發易發生改變。生改變。 3.2. 材料：材料： 純水純水(milli-Q 水或二次至三次蒸餾水，水品質非常重要水或二次至三次蒸餾水，水品質非常重要) ，粉末，粉末培養基培養基 ，NaHCO3 ，電磁攪拌器，電磁攪拌器 無菌血清瓶無菌血清瓶 ，0.1 或或0.2 mm無菌過濾膜無菌過濾膜 ，pH 計，真空泵，計，真空泵，CO2 氣體氣體 3.3. 步驟：步驟： 3.3.1

12、. 取粉末培養基溶于取粉末培養基溶于700 ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解。水中，攪拌使其溶解。 3.3.2. 稱取適量之稱取適量之NaHCO3 粉末溶于粉末溶于200ml milli-Q 水中，攪水中，攪拌使其溶解，然后通入拌使其溶解，然后通入CO2 氣體至飽和，約氣體至飽和，約3-5 分鐘。分鐘。 3.3.3. 將溶解且含飽和將溶解且含飽和CO2 之之NaHCO3 溶液加入溶解之液體溶液加入溶解之液體培養基中混合?；旌笕芤褐囵B基中混合。混后溶液之pH 應為，除非應為，除非pH 值偏差太大，否值偏差太大，否則不需用酸堿再調整之。若為太堿，可再通入則不需用酸堿再調整之。若為太堿，可

13、再通入CO2 氣體調整氣體調整pH。培養基以真空幫浦通過過濾膜時，培養基以真空幫浦通過過濾膜時，pH 會升高。會升高。 3.3.4. 以以0.1 或或0.2 mm 無菌過濾膜過濾滅菌，同時分裝至無無菌過濾膜過濾滅菌，同時分裝至無菌容器中，標示培養基種類、日期、瓶號等，貯存于菌容器中，標示培養基種類、日期、瓶號等，貯存于4。(血清血清亦可加入培養基中一起過濾亦可加入培養基中一起過濾) 3.3.5. 配制之培養基配制須作生長試驗與污染測試。配制之培養基配制須作生長試驗與污染測試。 附附- -配制培養基之生長測試配制培養基之生長測試 材料：材料： MDCK cell (ATCC CCL-34 或或C

14、CRC 60004) 6-well TC plate (or 35 mm TC dish) methanol glacial acetic acid 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013) 步驟：步驟： 1. 以待測試培養基培養以待測試培養基培養MDCK cell，接種，接種MDCK 細胞于細胞于6-well plate (或或35mm TC dish) 中，每個中，每個well 接種接種1 102 活細胞，同活細胞，同時作對照組實驗。時作對照組實驗。 2. 接種接種57 天后，在天后，在100 倍倒立顯微鏡作觀察細胞群落之生長，倍倒立顯微鏡作觀察細

15、胞群落之生長，待細胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸時即可。待細胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸時即可。 3. 去除培養基，加入去除培養基，加入1 ml Carnoys 固定液固定液(甲醇：冰醋酸甲醇：冰醋酸 3:1)，室溫下靜置室溫下靜置10 min。 4. 去除固定液，水洗二次。去除固定液，水洗二次。 5. 加入加入1 ml 10 % Giemsa solution，室溫下靜置染色，室溫下靜置染色2-3 min。 6. 去除染液，水洗二次。去除染液，水洗二次。 7. 以肉眼計數群落數，并比較之，若新配制或新批號的培養基對細以肉眼計數群落數，并比較之，若新配制或新批號的培養

16、基對細胞生長不佳，則丟棄之。胞生長不佳，則丟棄之。 基礎篇基礎篇- -抗生素抗生素 1. 細胞庫之細胞培養基不加抗生素細胞庫之細胞培養基不加抗生素 1.1. 培養自培養自ATCC 引進之細胞株，培養基中不加抗生引進之細胞株，培養基中不加抗生素。素。 1.2. 培養自其它實驗室引進之細胞株，制作培養自其它實驗室引進之細胞株，制作token freeze 前培養基須添加抗生素，待前培養基須添加抗生素，待token freeze 通通過污染測試后，大量培養時則不加抗生素。過污染測試后，大量培養時則不加抗生素。 2. 寄送活細胞時，須將培養液充滿整個寄送活細胞時，須將培養液充滿整個flask 時，則時

17、，則須添加抗生素須添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。 3. 若要檢測若要檢測mycoplasma，則培養基內不可添加，則培養基內不可添加gentamicin，因，因gentamicin 會抑制會抑制mycoplasma 生長。生長。 4. 去除細菌污染之抗生素混合配方去除細菌污染之抗生素混合配方: penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin 250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml，注意混合使用后藥物毒性會增強。，注意

18、混合使用后藥物毒性會增強。 5. 抗生素使用種類與濃度：抗生素使用種類與濃度： 工作濃度工作濃度. 儲存溫度儲存溫度. 殺滅殺滅細菌細菌 penicillin 100 units/ml -20 G(+) bacteria streptomycin 100 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria chlotetracycline 50 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria gentamicin 50 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma amphotericin B 2.5 ug/ml -2

19、0 yeast and molds nystatin 50 ug/ml -20 yeast and molds fungizone 2.5ug/ml -20 yeast and molds 基礎篇基礎篇- -血清血清 1. 血清必須貯存于血清必須貯存于20 -70，若存放于，若存放于4，請，請勿超過一個月。如果一次無法用完一勿超過一個月。如果一次無法用完一 瓶，可將瓶，可將4045 ml 分裝于無菌分裝于無菌50 ml 離心管中，由于血清結凍時體積離心管中，由于血清結凍時體積會增加約會增加約10 %， 必須預留此膨脹體積之空間，否則易必須預留此膨脹體積之空間，否則易發生污染或容器凍裂之情形。發

20、生污染或容器凍裂之情形。 2. 一般廠商提供之血清為無菌，不需再無菌過濾。若一般廠商提供之血清為無菌，不需再無菌過濾。若發現血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養基內一起發現血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養基內一起過濾，勿直接過濾血清。過濾，勿直接過濾血清。 3. 瓶裝瓶裝(500ml) 血清解凍步驟血清解凍步驟(逐步解凍法逐步解凍法): -20或或70至至4冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，一般以一般以50 ml 無菌離心管可分裝無菌離心管可分裝4045 ml。在溶解過。在溶解過程中須規則搖晃均勻程中須規則搖晃均勻(小心勿造成氣泡小心勿造成氣泡)，使溫

21、度與成分，使溫度與成分均一，減少沈淀的發生。勿直接由均一，減少沈淀的發生。勿直接由20直接至直接至37解解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質凝結而發生沈淀。凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質凝結而發生沈淀。 4. heat-inactivation 是指是指56, 30 分鐘加熱已完全分鐘加熱已完全解凍之血清。加熱過程中須規則搖晃均勻。此熱處理之解凍之血清。加熱過程中須規則搖晃均勻。此熱處理之目的是使血清中之補體成份目的是使血清中之補體成份(complement) 去活化。除去活化。除非必須，一般不建議作此熱處理，因為會造成沈淀物之非必須，一般不建議作此熱處理，因為會造成沈淀物之顯著增多，且會

22、影響血清之品質。補體參與之反應有：顯著增多，且會影響血清之品質。補體參與之反應有：cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis and activation of lymphocytic and macrophage cell type。 5. 勿將血清置于勿將血清置于37太久，若在太久，若在37放置太久，血清放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩定之成份亦會

23、因此會變得混濁，同時血清中許多較不穩定之成份亦會因此受到破壞，而影響血清之品質。受到破壞，而影響血清之品質。 6. 血清之沈淀物血清之沈淀物 6.1. 凝絮物：發生之原因有許多種，但普遍之原因是凝絮物：發生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白血清中之脂蛋白(lipoprotein) 變性及解凍后血清中存變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白在之血纖維蛋白(fibrin) 造成，這些凝絮沈淀物不會造成，這些凝絮沈淀物不會影響血清本身之品質。若欲減少這些凝絮沈淀物，可影響血清本身之品質。若欲減少這些凝絮沈淀物，可用離心用離心3000 rpm, 5 min 去除，或離心后上清液可以去除，或離心后

24、上清液可以加入培養基中一起過濾。不建議用過濾步驟去除這些加入培養基中一起過濾。不建議用過濾步驟去除這些凝絮沈淀物，因為會阻塞過濾膜。凝絮沈淀物，因為會阻塞過濾膜。 6.2. 顯微鏡下觀察之顯微鏡下觀察之“小黑點小黑點”：通常經過熱處理之：通常經過熱處理之血清，沈淀物的形成會顯著的增多。有些沈淀物在顯血清，沈淀物的形成會顯著的增多。有些沈淀物在顯微鏡下觀察像是微鏡下觀察像是“小黑點小黑點”，常會誤認為血清遭受污，常會誤認為血清遭受污染，而將血清放在染，而將血清放在37中欲培養此中欲培養此“微生物微生物“，但在，但在37環境下，又會使此沈淀物增多，更會誤認為微生環境下，又會使此沈淀物增多，更會誤認

25、為微生物之增殖，但以培養細菌之培養基檢測，又沒有污染。物之增殖，但以培養細菌之培養基檢測，又沒有污染。一般而言，此小黑點應不會影響細胞之生長，但若懷一般而言，此小黑點應不會影響細胞之生長，但若懷疑此血清之品質，應立即停用，更換另一批號的血清。疑此血清之品質，應立即停用，更換另一批號的血清。 附附- -血清之生長測試血清之生長測試 材料：材料： MDCK cell (ATCC CCL-34 或或CCRC 60004) a-MEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12000-022 ) 6-well TC plate (or 3

26、5mm TC dish) methanol glacial acetic acid 10 % Giemsa solution(GibcoBRL 10092-013) 步驟：步驟： 1. 以以a-MEM with 10 % FBS (已測試過已測試過) 培養培養MDCK 細胞于細胞于T75 flask 至至80% confluency。 2. 以以trypsin-EDTA 處理細胞，離心后，加入適量不加血清之處理細胞，離心后，加入適量不加血清之a-MEM 制成細胞懸浮液，并測細胞濃度。以不加血清之制成細胞懸浮液，并測細胞濃度。以不加血清之a-MEM 稀釋細胞濃度為稀釋細胞濃度為1102活細胞數活

27、細胞數/ ml。 3. 將將1 ml 細胞懸浮液接種入細胞懸浮液接種入6-well plate 中，并另加入中，并另加入1 ml 含不同濃度的血清含不同濃度的血清(20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %) 之之a-MEM，使血清最終濃度為，使血清最終濃度為10% , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已測試過之血清同時進行對照組試驗。用已測試過之血清同時進行對照組試驗。 4. 37 oC，5 % CO2 培養箱培養培養箱培養5-7 天，期間不需更換培養天，期間不需更換培養基，待細胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸即可。

28、基，待細胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸即可。 5. 去除培養基，加入去除培養基，加入1 ml Carnoys 固定液固定液(甲醇甲醇:冰醋酸冰醋酸 3:1)，室溫下靜置，室溫下靜置10 min。 6. 去除固定液，水洗二次。去除固定液，水洗二次。 7. 加入加入1 ml 10 % Giemsa solution，室溫下靜置染色，室溫下靜置染色2-3 min。 8. 去除染液，水洗二次。去除染液，水洗二次。 9. 以肉眼計數群落數以肉眼計數群落數 10. 計算計算SPE ( Serum Plating Efficiency )： SPE = ( no. of colonies / w

29、ell ) / 100 x 100 % 11. 計算計算RPE(Relative Plating Efficiency)： SPE = total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) x100 % 比較各濃度血清培養基之比較各濃度血清培養基之RPE，即可得知待測血清對細胞生長，即可得知待測血清對細胞生長的影響。訂購多量同一批號的優良血清，置于的影響。訂購多量同一批號的優良血清，置于70 保存之保存之基礎篇基礎篇- -細胞傳代培養細胞傳代培養 1. 細胞生長至高密度時，即須分殖至新的培養瓶中，一般稀

30、釋比例為細胞生長至高密度時，即須分殖至新的培養瓶中，一般稀釋比例為1:3 至至1:6，依細胞種類而異。，依細胞種類而異。 2. 材料：材料： 2.1. 無菌磷酸生理緩沖液無菌磷酸生理緩沖液(Dulbeccos phosphate-buffered saline, Ca+/Mg+ free, D-PBS, GibcoBRL 21600-010) 2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062)： 以以10 ml 分裝于分裝于15 ml 無菌離心管中，保存于無菌離心管中，保存于20，使用前放

31、在，使用前放在37 水槽水槽回溫?；販?。 2.3. 新鮮培養基新鮮培養基 2.4. 無菌吸管無菌吸管/離心管離心管/培養瓶培養瓶 3. 步驟：步驟： 3.1. 附著型胞附著型胞(adherent cell) 3.1.1. 吸掉舊培養液。吸掉舊培養液。 3.1.2. 用用D-PBS 洗滌細胞一至二次。洗滌細胞一至二次。 3.1.3. 加入加入trypsin-EDTA 溶液溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2)，37 作用數分鐘，于倒立顯微鏡下作用數分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當細胞將要分離而呈現圓粒狀時，吸掉觀察，當細胞將要分離而呈現圓粒狀時，吸掉trypsin-EDTA 溶液。溶液。(

32、若不移去若不移去trypsin-EDTA，則在則在trypsin-EDTA 作用后，加入適量含血清之新作用后，加入適量含血清之新鮮培養基終止鮮培養基終止trypsin 作用，離心后再吸掉上清液。作用，離心后再吸掉上清液。) 3.1.4. 輕拍培養瓶使細胞自瓶壁脫落，加入適量之輕拍培養瓶使細胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養基，以吸管上下吸放數次以打散細胞團塊，新鮮培養基，以吸管上下吸放數次以打散細胞團塊，混和均勻后，依稀釋比例轉移至新的培養瓶中，以正混和均勻后，依稀釋比例轉移至新的培養瓶中，以正常培養條件培養。常培養條件培養。 3.2. 懸浮型細胞懸浮型細胞(suspension cell) 3

33、.2.1. 吸出細胞培養液，放入離心管中，離心吸出細胞培養液，放入離心管中，離心1000 rpm 5 分鐘。分鐘。 3.2.2. 吸掉上清液，加入適量之新鮮培養基，混吸掉上清液，加入適量之新鮮培養基，混和均勻后，依稀釋比例轉移至新的培養瓶中，以正和均勻后，依稀釋比例轉移至新的培養瓶中，以正常培養條件培養。常培養條件培養。 3.3. 融合瘤融合瘤(hybridoma) 3.3.1. 有些有些hybridoma cell 需培養三天以上才會需培養三天以上才會產生抗體，若是更換培養基，則可能會失去抗體。產生抗體，若是更換培養基，則可能會失去抗體。因此繼代培養不需離心后更換培養基，直接添加新因此繼代培

34、養不需離心后更換培養基，直接添加新鮮培養基稀釋細胞濃度即可。若體積太大，可傾斜鮮培養基稀釋細胞濃度即可。若體積太大，可傾斜放置，或分殖至新培養瓶中。放置，或分殖至新培養瓶中。 基礎篇基礎篇- -細胞冷凍保存細胞冷凍保存 （一）（一） 1. 注意事項：注意事項： 1.1. 欲冷凍保存之細胞應在生長良好欲冷凍保存之細胞應在生長良好(log phase) 且存活率高之且存活率高之狀態，約為狀態，約為80 90 致密度。致密度。 1.2. 冷凍前檢測細胞是否仍保有其特有性質，例如冷凍前檢測細胞是否仍保有其特有性質，例如hybridoma 應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產生。應在冷凍保存前一至二

35、日測試是否有抗體之產生。 1.3. 注意冷凍保護劑之品質。注意冷凍保護劑之品質。DMSO 應為試劑級等級，無菌且應為試劑級等級，無菌且無色無色(以以0.22 micronFGLP Telflon 過濾或是直接購買無菌產品，過濾或是直接購買無菌產品，如如Sigma D-2650)，以，以510 ml 小體積分裝，小體積分裝，4避光保存，避光保存，勿作多次解凍。勿作多次解凍。Glycerol 亦應為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌亦應為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內使用，因長期儲存后對細胞會有毒后避光保存。在開啟后一年內使用，因長期儲存后對細胞會有毒性。性。 1.4. 冷凍保存之細

36、胞濃度：冷凍保存之細胞濃度： 1.4.1. normal human fibroblast: 13 x 106 cells/ml 1.4.2. hybridoma: 13 x 106cells/ml，細胞濃度不要，細胞濃度不要太高，某些太高，某些hybridoma 會因冷凍濃度太高而在解凍會因冷凍濃度太高而在解凍24 小小時后死去。時后死去。 1.4.3. adherent tumor lines: 57 x 106，依細胞種類，依細胞種類而異。而異。Adenocarcinoma 解凍后須較高之濃度，而解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需只需1-3 x 106cells/ml。 1.4.4.

37、other suspensions: 510 x 106cells/ml, human lymphocyte 須至少須至少5 x 106cells/ml。 1.5. 冷凍保護劑濃度為冷凍保護劑濃度為5 或或10 DMSO，若是不確定細，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應作一個胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應作一個backup culture，以防止冷凍失敗。，以防止冷凍失敗。 1.6. 冷凍方法：冷凍方法： 1.6.1. 傳統方法傳統方法: 4 10 分鐘分鐘- -20 30 分鐘分鐘- -80 16 - 18 小時小時(或隔夜或隔夜) - 液氮槽液氮槽vapor pha

38、se 長期儲存。長期儲存。 1.6.2. 程序降溫：利用等速降溫機以程序降溫：利用等速降溫機以1 -3/分鐘之分鐘之速度由室溫降至速度由室溫降至120，放在液氮槽，放在液氮槽vapor phase 長期儲長期儲存。適用于懸浮型細胞與存。適用于懸浮型細胞與hybridoma 之保存。之保存。 基礎篇基礎篇- -細胞冷凍保存細胞冷凍保存 （二）（二）2. 材料：材料： 2.1. 生長良好之培養細胞生長良好之培養細胞 2.2. 新鮮培養基新鮮培養基 2.3. DMSO (Sigma D-2650) 2.4. 無菌塑料冷凍保存管無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020) 2.5. 0.4

39、 w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) 2.6. 血球計數盤與蓋玻片血球計數盤與蓋玻片 2.7. 等速降溫機等速降溫機(KRYO 10 Series II) 3. 步驟：步驟： 3.1. 冷凍前一日前更換半量或全量培養基，觀察細胞生長冷凍前一日前更換半量或全量培養基，觀察細胞生長情形。情形。 3.2. 配制冷凍保存溶液配制冷凍保存溶液(使用前配制使用前配制)：將：將DMSO 加入新鮮加入新鮮培養基中，最后濃度為培養基中，最后濃度為5-10，混合均勻，置于室溫下待，混合均勻，置于室溫下待用。用。 3.3. 依細胞繼代培養之操作，收集培養之細胞，取少量細依細胞繼

40、代培養之操作，收集培養之細胞，取少量細胞懸浮液胞懸浮液(約約0.1 ml) 計數細胞濃度及凍前存活率。計數細胞濃度及凍前存活率。 3.4. 離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細胞濃度為胞濃度為1-5 x 106 cells/ml，混合均勻，分裝于已標示，混合均勻，分裝于已標示完全之冷凍保存管中，完全之冷凍保存管中，1 ml/vial，并取少量細胞懸浮液作，并取少量細胞懸浮液作污染檢測。污染檢測。 3.5. 冷凍保存方法冷凍保存方法1: 冷凍管置于冷凍管置于4 10 分鐘分鐘 -20 30 分鐘分鐘 -80 1618 小時小時(或隔夜或隔夜)

41、液氮槽液氮槽vapor phase 長期儲存。長期儲存。 3.6. 冷凍保存方法冷凍保存方法2: 冷凍管置于已設定程序之等速降溫機冷凍管置于已設定程序之等速降溫機中，再放入液氮槽中。程序為中，再放入液氮槽中。程序為: program 7: HB CELL 基礎篇基礎篇- -冷凍細胞活化冷凍細胞活化 1. 冷凍細胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新冷凍細胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結晶而對細胞造成傷害，導致細胞之死亡。結晶而對細胞造成傷害，導致細胞之死亡。 2. 細胞活化后，約需數日，或繼代一至二代，其細胞細胞活化后，約需數日，或繼代一至二代，其細胞生長或特性表現才會恢復正常生長或特

42、性表現才會恢復正常(例如產生單株抗體或是例如產生單株抗體或是其它蛋白質其它蛋白質)。 3. 材料材料 37 恒溫水，新鮮培養基，無菌吸管恒溫水，新鮮培養基，無菌吸管/ 離心管離心管/ 培養培養瓶，液氮或干冰容器瓶，液氮或干冰容器 4. 步驟：步驟： 4.1 操作人員應戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂操作人員應戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。之傷害。 4.2 自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時蓋子易松掉。由于熱脹冷縮過程，此時蓋子易松掉。 4.3 將新鮮培養基置于將新鮮培養基置于37 C 水槽中回

43、溫，回溫后噴以水槽中回溫，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內。酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內。 4.4 取出冷凍管，立即放入取出冷凍管，立即放入37 C 水槽中快速解凍，輕搖水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在冷凍管使其在1 分鐘內全部融化，以分鐘內全部融化，以70 % ethanol 擦拭保擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內。存管外部，移入無菌操作臺內。 4.5 取出取出0.9 ml 解凍之細胞懸浮液，緩緩加入有培養基之解凍之細胞懸浮液，緩緩加入有培養基之培養容器內培養容器內(稀釋比例稀釋比例1:101:15)，混合均勻，放入，混合均勻，放入CO2 培養箱培養。另取培養箱培養。另取

44、0.1 ml 解凍細胞懸浮液作存活測試。解凍細胞懸浮液作存活測試。 4.6 解凍后是否立即去除冷凍保護劑解凍后是否立即去除冷凍保護劑(例如例如DMSO 或或glycerol)，依細胞種類而異，一般而言，大都不需要立即，依細胞種類而異，一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護劑。惟若要立即去除，則將解凍之細胞懸浮液去除冷凍保護劑。惟若要立即去除，則將解凍之細胞懸浮液加入含有加入含有5-10 ml 培養基之離心管內，離心培養基之離心管內，離心1,000 rpm, 5 分鐘，移去上清液，加入新鮮培養基，混合均勻，放入分鐘，移去上清液，加入新鮮培養基，混合均勻，放入CO2 培養箱培養。培養箱培養。 4.7

45、 若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養后隔日更若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養后隔日更換培養基。換培養基。基礎篇基礎篇- -收到細胞的處理方式收到細胞的處理方式 ( (一一) )1. 收到細胞株包裹時，收到細胞株包裹時， 請檢查細胞株冷凍管是否有解請檢查細胞株冷凍管是否有解凍情形，凍情形， 若有請立即通知。細胞株請盡速開始培養，若有請立即通知。細胞株請盡速開始培養， 或立即冷凍保存或立即冷凍保存(置于置于70 C， 隔夜后，隔夜后， 移到液氮移到液氮)。 2. 冷凍細胞解凍程序冷凍細胞解凍程序: 2.1. 依據細胞株數據單指定之基礎培養基種類、血清依據細胞株數據單指定之基礎培養基種類、

46、血清種類和其它指定之成份和比例，制備培養基。絕大多數種類和其它指定之成份和比例，制備培養基。絕大多數之細胞均無法立即適應不同之基礎培養基或不同之血清之細胞均無法立即適應不同之基礎培養基或不同之血清種類，種類， 若因實驗需要，若因實驗需要， 必須有所不同時，必須有所不同時， 務必以緩務必以緩慢比例漸次改變培養基組成，慢比例漸次改變培養基組成， 確定細胞適應后，確定細胞適應后， 方進方進行所需之實驗。行所需之實驗。 2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清小牛血清)和和HS (horse serum, 馬血清馬血清)

47、，對細胞而言差異極大，請務必依據細胞株資料單指定之對細胞而言差異極大，請務必依據細胞株資料單指定之血清種類培養之。血清種類培養之。 2.3. 將培養基置于將培養基置于37 C 水槽中回溫，水槽中回溫， 回溫后噴以回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之，酒精并擦拭之， 移入無菌操作臺內。取出冷凍管，移入無菌操作臺內。取出冷凍管， 立立即放入即放入37 C 水槽中快速解凍，水槽中快速解凍， 水面高度不可接近或高水面高度不可接近或高過冷凍管之蓋沿，過冷凍管之蓋沿， 否則易發生污染。輕搖冷凍管使其在否則易發生污染。輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化后，分鐘內全部融化后， 以以70 % ethanol 擦拭冷

48、凍管外部，擦拭冷凍管外部， 移入無菌操作臺內。移入無菌操作臺內。 2.4. 依據細胞種類和濃度，于無菌操作臺內取依據細胞種類和濃度，于無菌操作臺內取10 ml 培培養基加至養基加至T25 或或T75 flask中。取出已解凍之細胞懸浮液，中。取出已解凍之細胞懸浮液，緩緩加入緩緩加入T25 或或T75 flask 內之培養基，內之培養基， 混合均勻，放混合均勻，放入入37 C，5 % CO2 培養箱培養。培養箱培養。 2.5. 對絕大多數細胞而言，對絕大多數細胞而言，1 % 以下之冷凍保護劑以下之冷凍保護劑DMSO，不會對細胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻，不會對細胞之貼附或活化有不良影響，不

49、需立刻由解凍細胞中去除，由解凍細胞中去除， 待第二天確定細胞生長或貼附良好后待第二天確定細胞生長或貼附良好后再去除即可。惟對極少數因對再去除即可。惟對極少數因對DMSO 敏感或會造成細胞分敏感或會造成細胞分化之細胞，需立即去除化之細胞，需立即去除DMSO 者，者， 則可將解凍后之細胞則可將解凍后之細胞懸浮液放入懸浮液放入5 - 10 ml 培養基中，離心培養基中，離心300 xg (約約1000 rpm)，5 分鐘，小心移去上清液，加入適量新鮮培養基，分鐘，小心移去上清液，加入適量新鮮培養基，將細胞均勻混合后，將細胞均勻混合后， 轉移至培養瓶中，轉移至培養瓶中， 再放入再放入37 C， 5 %

50、 CO2 培養箱培養。培養箱培養?；A篇基礎篇- -收到細胞的處理方式收到細胞的處理方式 ( (二二) ) 收到收到T25 flask T25 flask 細胞時，細胞時， 處理方式為處理方式為 1. 1. 于寄送過程中，為避免起泡造成細胞脫落死亡，于寄送過程中，為避免起泡造成細胞脫落死亡，T25 flask T25 flask 均加滿培養基。請檢查均加滿培養基。請檢查flask flask 外觀，并于外觀，并于顯微鏡下觀察細胞生長狀況和有無污染現象，若有任顯微鏡下觀察細胞生長狀況和有無污染現象，若有任何問題，何問題， 不要打開蓋子，請立即通知細胞實驗室。不要打開蓋子，請立即通知細胞實驗室。

51、2. 2. 將原封之將原封之T25 flask T25 flask 靜置于靜置于37 37 C C， 5 % CO2 5 % CO2 培培養箱中，使細胞回溫至養箱中，使細胞回溫至37 37 C C， 并讓運送過程中少數并讓運送過程中少數脫落的細胞可再附著生長。隔天后，于無菌操作箱內脫落的細胞可再附著生長。隔天后，于無菌操作箱內取出取出flaskflask內之培養基，內之培養基，( (取出之培養基可以再使用取出之培養基可以再使用) )，僅留約僅留約5-10ml 5-10ml 培養基于培養基于flask flask 內，依一般培養方式再內，依一般培養方式再將細胞置入培養箱中，或細胞已長滿盤，將細胞

52、置入培養箱中，或細胞已長滿盤， 則將細胞做則將細胞做傳代培養。傳代培養。 附附- -細胞計數與存活測試（一）細胞計數與存活測試（一） 1. 1. 原理：原理： 1.1. 1.1. 計算細胞數目可用血球計數盤或是計算細胞數目可用血球計數盤或是Coulter counter Coulter counter 粒子計數粒子計數器自動計數。器自動計數。 1.2. 1.2. 血球計數盤一般有二個血球計數盤一般有二個chamberschambers，每個，每個chamber chamber 中細刻中細刻9 9 個個1 1 mm2 mm2 大正方形，其中大正方形，其中4 4 個角落之正方形再細刻個角落之正方形

53、再細刻16 16 個小格，深度均為個小格，深度均為0.1 mm0.1 mm。當。當chamber chamber 上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1 1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 mlmm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用時，計數每個大正方形內之細胞。使用時，計數每個大正方形內之細胞數目，乘以稀釋倍數，再乘以數目，乘以稀釋倍數，再乘以104104，即為每，即為每ml ml 中之細胞數目。中之細胞數目。 1.3. 1.3. 存活測試之步驟為存活測試之步驟為dye exclusiondye exclusion，利

54、用染料會滲入死細胞中而，利用染料會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。一般使用呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍色之藍色之trypan blue trypan blue 染料，如果細胞不易吸收染料，如果細胞不易吸收trypan bluetrypan blue，則用紅，則用紅色之色之Erythrosin bluishErythrosin bluish。 附附- -細胞計數與存活測試（二）細胞計數與存活測試（二） 2. 2. 材料：材料： 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) 0.4 % w/

55、v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) Erythosin bluish stain Erythosin bluish stain 取取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及及0.05 gram 0.05 gram preservative methyl preservative methyl paraben (Sigma H-3647) paraben (Sigma H-3647) 溶于溶于100 ml Ca+/Mg+ free s

56、aline 100 ml Ca+/Mg+ free saline 血球計數盤及蓋玻片血球計數盤及蓋玻片(Hemocytometer and coverslip) (Hemocytometer and coverslip) ，計數器，計數器(counter) (counter) ，低倍倒立顯微鏡低倍倒立顯微鏡 粒子計數器粒子計數器(Coulter counter, Coulter Electronics) (Coulter counter, Coulter Electronics) 3. 3. 步驟：步驟： 3.1. 3.1. 取取50ml 50ml 細胞懸浮液與細胞懸浮液與50ml trypa

57、n blue (or Erythrosin bluish) 50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等等體積混合均勻于體積混合均勻于1.5ml 1.5ml 小離心管中。小離心管中。3.2. 3.2. 取少許混合液取少許混合液( (約約15ml) 15ml) 自血球計數盤自血球計數盤chamber chamber 上方凹槽加入，蓋上蓋上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于玻片，于100 100 倍倒立顯微鏡下觀察，活細胞不染色，死細胞則為藍色倍倒立顯微鏡下觀察，活細胞不染色，死細胞則為藍色( (或紅色或紅色- Erythrosinbluish)- Erythrosi

58、nbluish)。 3.3. 3.3. 計數四個大方格之細胞總數，再除計數四個大方格之細胞總數，再除4 4，乘以稀釋倍數，乘以稀釋倍數( (至少乘以至少乘以2 2，因與，因與trypan bluetrypan blue等體積混合等體積混合) )，最后乘以，最后乘以104104，即為每，即為每ml ml 中細胞懸浮液之細胞數。中細胞懸浮液之細胞數。若細胞位于線上，只計上線與右線之細胞若細胞位于線上，只計上線與右線之細胞( (或計下線與左線之細胞或計下線與左線之細胞) )。 4 4 大格大格* *細胞總數細胞總數x 2 x 104 / 4= x 2 x 104 / 4= 細胞數細胞數/ml /ml

59、 * *每一大格的體積每一大格的體積= 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml = 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml 3.4. 3.4. 若不用血球計數盤，可用若不用血球計數盤，可用Coulter counter Coulter counter 作自作自動計數，惟無法辨別死細胞或活細胞。動計數，惟無法辨別死細胞或活細胞。 3.5. 3.5. 范例：范例： T75 monolayer culture T75 monolayer culture 制成制成10ml 10ml 細胞懸浮液，取細胞懸浮液，取0.1 ml 0.1 ml 溶液與溶液與

60、0.1ml trypan blue 0.1ml trypan blue 混合均勻于試管混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計數盤，計數四大方格內中，取少許混合液加入血球計數盤，計數四大方格內之細胞數目。之細胞數目。 活細胞數活細胞數/ /方格：方格：55 ,62, 49, 59 55 ,62, 49, 59 死細胞數死細胞數/ /方格：方格：5, 3, 4, 6 5, 3, 4, 6 細胞總數細胞總數= 243 = 243 平均細胞數平均細胞數/ /方格方格= 60.75 = 60.75 稀釋倍數稀釋倍數= 2 = 2 細胞數細胞數/ml/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22