1、 10 GFP報告蛋白用于細胞活體分離與純化 n 利用細胞表面標記，通過流體細胞分光光度計或熒光活化細胞篩選儀(FACS， 可以分離與純化特殊類型細胞，對分析cDNA文庫、研究基因的細胞發育或 組織專一性表達十分重要26,27。利用GFP融合蛋白為細胞表面活體熒光 標記，通過篩選已經獲得GFP表達的大腸桿菌、人體腎細胞和猿猴COS-1細 胞特殊類型。Sheen J等在GFP轉染玉米原生質體的流體參數分析中發現， 轉染1518小時后，對照中只有一類細胞叢，表現較強紅色熒光和微弱的綠 色熒光，并且細胞間熒光強度相當一致，沒有明顯差異。而GFP轉染的原生 質體中出現兩類細胞叢，第一類與對照相似，呈現

2、紅色熒光，約占細胞總數 66.3%；第二類細胞叢呈現綠色熒光，熒光強度是對照的74倍。因此，用流 式細胞分光光度計或熒光活化細胞篩選儀(Epics Elite, Conlter Electronics,Miami FL, USA很容易將兩類細胞分離開來。原生質體可以來 源于不同類型的組織細胞原生質體表達的GFP信息，即可代表某種組織的信 息。采用發育專一性啟動子構建GFP表達載體，可以將這些具有基因表達特 異性的細胞類型分離出來。利用不同表達文庫轉染原生質體，通過流體參數 分析和細胞分類，可以揭示在信號傳導途徑中所包含的許多反方活化因子 (trans-activating fectors。GF

3、P在生物學和分子生物學研究中的利用還不 僅僅局限于上述幾個方面。隨著研究的深入開展，其廣泛利用的潛力將不斷 表現出來。 四、存在的問題及展望 n n GFP標記蛋白有很明顯的優點，但這項技術還是有很多的局限性。第一，這種方法需 要很高的空間分辨力，培養的細胞要稀疏而且很薄；第二，定量的范圍會受到融合蛋 白表達水平和顯像分辨力的干擾；第三，因為融合蛋白擴散到膜表面需要一定的時間， 因此動力學響應在某些情況下可能會受到時間上的限制；第四，由GFP標記物本身引 起的電勢干擾是很難估計的，因為幾乎沒有其它的方法可以用來做比較；第五，幾乎 在所有的情況下,細胞內GFP標記分子的表達都伴隨著一些未標記蛋白

4、的表達。例如,組 成高爾基反面網狀結構的膜蛋白TGN38，它的正確功能定位和動力學過程需要在同源 系統中低水平的表達，而在非同源系統中表達或在同源系統中高水平表達，則會導致 其斷裂或被錯誤地定位28。第六，GFP的分子量雖然不大(27kDa，但對蛋白功能 的影響比一些短的(大約10個氨基酸熒光標記蛋白要大。最后，雖然有報道指出，熒 光只能在表達GFP的細胞中檢測到，但是也有不少人擔心GFP基因可能還不能完全準確 地反映轉化情況，GFP基因的表達可能有假象存在：一方面，細胞本身存在一些可以 受光激發的物質，能產生一定量熒光；另一方面，GFP基固在受體內的表達頻率并不 高。Sheen等(1995在

5、一些被CAB GFP基因轉化的植株中檢測不到清晰的熒光信號。 Hu、Sheen、Haselof等l995年在發表的文章中也分別提到了這一現象，看來GFP的 應用條件還需進行進一步的摸索。 GFP成像技術是生化和分子細胞生物學中飛速發展的一個工具,它已經滲透到了分子生 物學、遺傳學、動物學、植物學、生理學等其它許多生命科學領域。有了GFP，培育 出奇特的熒光動物和熒光植物已不再是夢想。相信隨著基因工程技術和細胞工程技術 的日益成熟，GFP一定可以為我們揭開細胞中許多迄今為止還不為人所知的秘密,掀起 一場生物學上的綠色革命。 n n n n n n n n n n n n n n n 14Yuk

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