1、CpG-containing 寡聚脫氧核苷酸對新化療藥物Coramsine的抗腫瘤增強效應概述Coramsine（即龍葵總堿）是一種從Solanum linnaeanum（devils apple）中提取出來的新的化療藥物臨床上主要用于治療皮膚腫瘤本實驗通過研究Coramsine對惡性間皮細胞瘤的小鼠模型的體內抗腫瘤效應來探討Coramsine更廣泛的臨床應用前景研究發現Coramsine全身用藥可以延緩腫瘤生長和延長小鼠生存期并且當Coramsine與ODNs 聯用時,未甲基化的ODNs作為先天免疫系統的激活物可以增強Coramsine的抗腫瘤效應.兩藥聯用更為有效的延緩了腫瘤的生長和提供生

2、存獲益. Coramsine 可能是通過直接裂解細胞的方式來殺死腫瘤細胞.我們用兩種不同的方法來檢測凋亡(caspase 激活和DNA斷裂),沒有發現Coramsine誘導任何形式的程序化細胞死亡的證據.實驗發現, 由ODNs 增強的Coramsine的抗腫瘤效應表明Coramsine介導的細胞死亡是一種與免疫學無關的事件。關鍵詞化學治療, CpG寡聚脫氧核苷酸,免疫治療, 惡性間皮細胞瘤(J Immunother 2006;29:134-142) 細胞毒性化療仍然是大部分實體腫瘤治療的最好選擇.然而,并非所有腫瘤都對此有效.單一模式的藥物化療已經很難治愈腫瘤,部分原因是目前的單藥治療容易導致

3、腫瘤細胞產生耐藥性.因此有必要探索新的化療藥物用于以后的化療或與其他治療方式的聯用上.一般情況下我們通過以下兩種思路尋找藥物。一是新藥物能夠特異性的干擾象細胞繁殖這樣的生化途徑，如抗代謝藥物吉西他濱.二是,新藥物中的有效成分可以在天然復合物中被發現和提取出來，如紅豆杉、紫杉酚類的藥物。 Daunter 和 Cham在20世紀90年代發現在澳大利亞昆士蘭地區的一種叫做Solanum linnaeanum （即龍葵）的植物可以有效的延緩牲畜皮膚癌的發展在此基礎上提出了幾種具有細胞毒作用的甾體生物堿苷類成分。混合物中的兩種活性生物堿成分澳洲茄堿和澳洲茄邊堿共享一個各種三糖碳水化合物附著的甾體配基。隨

4、后人們把這兩種復合物用來治療表淺的皮膚疾病如角化病、基底細胞癌、和鱗狀細胞癌，并把它推向市場。澳洲茄堿和澳洲茄邊堿的混合物最初被稱為SBP002現在被命名為Coramsine，體外細胞實驗發現它有更寬的抗癌譜說明其可能有更廣的應用范圍。最初人們提出龍葵總堿的細胞毒作用是直接裂解細胞。現在也有觀點認為誘導凋亡也是這些生物堿類的細胞毒作用機制。但在我們實驗當中，尚未發現支持龍葵總堿誘導凋亡的證據。我們在惡性間皮細胞瘤的小鼠模型上進一步研究了Coramsine對實體腫瘤的療效。實驗證明Coramsine全身用藥可以減緩腫瘤生長和提供適度的生存獲益。Coramsine 目前正在由Australia S

5、pecial Access Scheme機構進行臨床實驗評估。這是一個對未上市藥品有選擇性的對病人進行臨床實驗的機構。近年來，腫瘤化療逐漸與免疫治療相結合。我們先前的實驗證明抗代謝藥物吉西他濱作用于惡性間皮細胞瘤小鼠模型，可以通過凋亡促進腫瘤細胞死亡并增加了淋巴灌注區（DLNs）腫瘤抗原的表達。吉西他濱聯合對抗抗-CD40的FGK-45抗體激活樹狀突細胞上的CD-40的免疫輔助的治療方式對腫瘤有很高的治愈率。目前化療和免疫結合的綜合治療已經越來越多樣化。比較有前景的免疫治療方法是通過免疫治療來激活機體的先天免疫系統。這種治療方式本質上與CD-40的激活是不同的，后者實際上是一種后天獲得性免疫治

6、療。(postlicensing therapy)，如淋巴灌注區啟動事件后的T淋巴細胞的激活。而先天免疫系統的激活會反過來增強啟動事件 。先天免疫系統可以被脂多糖（LPS）、鞭毛素、雙鏈RNA、和未甲基化的含有CpG 結構的寡聚脫氧核苷酸等不同的微生物結構所激活，機制主要與病原體的分子結構有關。細胞上的受體如TLRs識別這些結構并激活先天免疫反應。在臨床前期實驗中，我們發現幾種TLR配體尤其是雙鏈RNA以及與之具有相似藥代動力學的多聚次黃嘌呤核苷酸和含有CpG 結構的寡聚脫氧核苷酸具有抗腫瘤活性并且在與其他治療方式聯用時具有協同作用我們發現Coramsine對免疫系統有輕微毒性，因此我們研究了

7、其與不同的免疫刺激治療（如激活CD40或多聚次黃嘌呤核苷酸和含有CpG 結構的寡聚脫氧核苷酸等TLR配體治療）相結合時的治療獲益 。結果發現Coramsine與CpG-ODNs聯用可以降低腫瘤生長速度而與FGK-45聯用時沒有協同作用。材料和方法：1 細胞培養和試劑鼠AB1-HA惡性間皮細胞瘤細胞株貼壁培養在DMEM中，DMEM由20mM羥乙基哌嗪乙磺酸，0.05mM 2-巰基乙醇，100u/mL 青霉素(CSL，Melbourne,Australia），50ug/mL 慶大霉素，(David Bull Labs,Warwick,UK)，和5%的胎牛血清配制而成。AB1-HA惡性間皮細胞來源于

8、AB1惡性間皮細胞。AB1細胞是由經石棉誘導的惡性間皮細胞瘤的BALB/C小鼠身上得到的。AB1-HA細胞正常條件下可以逃避免疫監視。AB1和AB1-HA屬于高度同源基因。SBP002(Coramsine)由Solbec Pharmaceuticals公司提供（Perth,Western Australia）。消毒蒸餾水稀釋Coramsine至200ug/ml，用3%冰醋酸過濾法消毒。進一步稀釋時均用消毒的一次性蒸餾水。吉西他濱(美國印第安納波利斯禮來公司生產）由Sir Charles Gairdner醫院藥房提供。將吉西他濱用消毒蒸餾水稀釋成1ug/ml的原液備用，使用時用消毒蒸餾水稀釋。其

9、他材料均購于Sigma公司（Castle Hill,New South Wales,Australia）。2實驗鼠，腫瘤的體內生長和化學治療BALB/C(H-2d)小鼠由澳洲西部的佩思動物實驗中心提供，養殖于標準條件下。AB1-HA細胞1*106個皮下接種于實驗鼠的一側下腹部。大約10-12天后當腫瘤直徑可捫及約1-2mm 大小時開始用藥（day0）。實驗組小鼠腹膜內注射含有不同劑量Coramsine 的溶液200 uL。用生理鹽水稀釋的乙酸相應的處理對照組。Coramsine用藥期間用雙腳規每周3次測量腫瘤大小。當腫瘤大小達到100mm2時，處死小鼠。3免疫治療和TLR配體治療活化的抗CD-

10、40 FGK45抗體實驗組小鼠6天內分3次靜脈注射（day4,6,和day9）含有FGK45 100ug（由Antonius Rolink博士贈送）的PBS100uL。在TLR配體治療中，當腫瘤可捫及時（day0），分別瘤內注射含有10ug的poly I/C（Invivogen,CA），洛索立賓 (Invivogen),CpG1668(5-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3),或非GpG操縱的GpG1720（5-TCCATGAGCTTCCTGATGCT-3）（德國柏林，TIB-MOLBIOL）生理鹽水50uL。每隔3天重復一次，用藥至day15。4淋巴細胞及其亞群的細胞數目分析當腫瘤

11、可捫及時（day0），Coramsine處理AB1-HA細胞荷瘤小鼠（14mg/kg）。生理鹽水稀釋的乙酸相應的處理對照組小鼠（14mg/kg）。在day0，1，2，7，8，9，14，15時向荷瘤小鼠體內腹膜內注射含有Coramsine的溶液300uL，并在day3，10，17時分批處死小鼠。分別收集小鼠脾臟、腫瘤灌注區淋巴結和對側淋巴結，制成細胞懸液，并用抗CD3和抗B-220單克隆抗體熒光標記細胞。將細胞置于FACScalibur流式細胞儀檢測和CellQuest and FlowJo軟件分析結果。通過上述淋巴器官細胞懸液序列稀釋，苔盤蘭染色（Sigma）和血細胞儀記數器計算出細胞總數。5

12、 熒光激活細胞分類器和終端脫氧核苷酸轉移酶末端標記脫氧尿苷三磷酸鹽（TUNEL）分析細胞凋亡和細胞壞死. ApoStat異硫氰酸熒光素(R&D, 美國明尼蘇達州)檢測Caspase途徑誘導的凋亡.六孔板接種AB1-HA細胞，每孔2*105個，置于標準條件下（37，5%CO2）培養過夜。吉西他濱或Coramsine 稀釋液加入六孔板中繼續培養細胞。收集細胞前，六孔板中每孔添加10uL，50ug/mL的ApoStat繼續培養半小時。然后收集細胞，PBS洗滌，用400uLPBS 重懸細胞。滴加5uL PI（propidium iodine）至細胞懸液，擱置20分鐘后，流式細胞儀檢測結果。通過

13、終端脫氧核苷酸轉移酶末端標記脫氧尿苷三磷酸鹽方法（TUNEL）檢測Coramsine用藥后的細胞凋亡表現。六孔板接種AB1-HA細胞，每孔1*106個，Coramsine致死劑量組和亞致死劑量組作用不同時段后，收集100uL細胞懸液用細胞離心涂片器旋轉制作載波片， 95%乙醇固定10分鐘。TUNEL法分析載波片上細胞核DNA斷裂情況。6 免疫組化筆者用免疫組化TUNEL法對腫瘤組織內淋巴細胞記數。AB1-HA 細胞1*106個皮下接種于小鼠側腹部，每隔兩天觀察腫瘤在鼠體內生長情況，待腫瘤可觸及時做為day0。實驗組和對照組分別在day0，1，2，7，8，9，14，15時向荷瘤小鼠腹膜內注射30

14、0uLCoramsine（14mg/kg）溶液和生理鹽水稀釋的乙酸（14mg/kg）并在day3，10，17時分批處死小鼠。將腫瘤從小鼠體內完整取出做組織學切片，層厚約9um。切片用抗CD4，CD8，和B220單克隆抗體染色。用F4-80單克隆抗體檢測小噬細胞microphages。TUNEL法分析腫瘤細胞在鼠體內的凋亡情況。7 統計學分析程序 (Graph Pad Software,San Diego,CA)處理數據，做出統計學分析。結果1 Coramsine抗腫瘤的化療作用。筆者通過Coramsine作用于惡性間皮細胞瘤的小鼠模型來評價Coramsine作為化療藥物時在抗腫瘤方面的效應。A

15、B1-HA細胞1*106個經皮接種于實驗鼠的一側下腹部。當腫瘤可觸及時（大約在接種后10-12天）開始用藥（day0）。筆者首先通過變化劑量和藥物作用時間尋找最佳的治療方案。筆者觀察到Coramsine經腹膜內注射用藥時，當劑量>16mg/kg,每天一次， 該藥有很高比例的死亡率。由此結果本實驗始終采用用藥3天中斷4天(3days on-4days off)和用藥劑量<16mg/kg的治療方案。當AB1-HA腫瘤可觸及時, 經小鼠(n=5)腹膜內注射Coramsine(12mg/kg) ,觀察其抗腫瘤效應。結果顯示用藥3天中斷4天的時間方案在治療前兩周可以顯著延緩腫瘤生長。 (P=

16、0.0027;圖1A)。當Coramsine顯著延緩腫瘤生長而且在治療后15天還觀察到腫瘤體積的縮小(圖1A)。當用藥停止后,腫瘤恢復生長。但在14mg/kg劑量組荷瘤小鼠的生存時間顯著延長（P=0.047）。所有荷瘤小鼠最終都因為腫瘤死亡。 圖1：Coramsine腹膜內注射延緩了腫瘤生長。當AB1-HA腫瘤可觸及時，以用藥3天間隔4天的時間方案往BALB/c荷瘤小鼠腹膜內注射不同劑量的Coramsine（12mg/kg或14mg/kg，每個劑量組n=5），。A，可見治療方案。盲法進行實驗。實驗組和對照組的腫瘤生長速率（A）和生存曲線（B）如圖所示。2 Coramsine對免疫系統的影響因為

17、許多化療藥物都會對免疫系統產生影響,使淋巴細胞記數降低。本實驗在小鼠模型上觀察Coramsine是否會誘導淋巴細胞記數降低。Coramsine經腹膜內注射入荷瘤小鼠(n=5,14mg/kg)后,分別于治療開始后第3,10,17天收集脾臟,腫瘤淋巴灌注區,和對側淋巴灌注區的淋巴細胞并記數。結果發現對照組荷瘤小鼠三個區域的淋巴記數在第3和10天時輕度降低,第10-17天時開始升高(圖2A)。而實驗組Coramsine用藥能夠導致免疫器官的淋巴細胞記數輕度降低。（圖2A）。筆者進一步用熒光標記的抗CD3和B220抗體對Coramsine處理組的荷瘤小鼠免疫器官的B淋巴細胞和T淋巴細胞記數。結果顯示C

18、oramsine處理組的T淋巴細胞總數也相應的有略微降低，對側淋巴灌注區更明顯一些（圖2B）。結果分析，Coramsine與其他的化療藥物相比如吉西他濱對免疫系統的影響是非常小的。筆者通過免疫組化方法觀察CD4、CD8 T淋巴細胞，B細胞，和巨噬細胞表達，分析Coramsine抑瘤作用是直接抑制腫瘤細胞還是誘導免疫系統間接抑制腫瘤細胞（圖3）。結果發現在整個治療過程中，Coramsine并沒有明顯改變腫瘤組織中CD4、CD8 T淋巴細胞，B細胞表達（圖2C）。實驗組和對照組腫瘤組織內主要的免疫細胞是巨噬細胞（圖3）。即使實驗組的腫瘤生長被Coramsine明顯延緩時，兩組的腫瘤組織內免疫細胞數

19、量也沒有明顯差異，此實驗結果說明Coramsine直接作用于腫瘤細胞。圖2：Coramsine對免疫系統的影響。接種 AB1-HA細胞的小鼠（n=5）經腹膜內注射14mg/kg的Coramsine或生理鹽水稀釋的乙酸。A，示Coramsine組和vehicle組在day3，10和17天時脾臟，腫瘤灌注區淋巴結，對側淋巴結細胞總數。B，治療開始后，Coramsine組和vehicle組在day3，10和17天時脾臟，腫瘤灌注區淋巴結，對側淋巴結CD3+ T細胞的頻率。C，治療開始后，Coramsine組和vehicle組在day3，10和17天時脾臟，腫瘤灌注區淋巴結，對側淋巴結B220+ B細

20、胞的頻率。圖3：Coramsine治療AB1-HA腫瘤對瘤內對淋巴細胞和巨噬細胞數目的影響。接種 AB1-HA細胞的小鼠（n=5）經腹膜內注射14mg/kg的Coramsine或生理鹽水稀釋的乙酸。治療開始后在day3，10和17天收集腫瘤。圖示day10天時的免疫組化染色。A，對照組CD4+細胞B ，實驗組CD4+細胞C，對照組CD8+細胞D，實驗組CD8+細胞E，對照組B細胞F，實驗組B細胞。G，對照組巨噬細胞。H，實驗組巨噬細胞。陽性細胞染成褐色。3 在與CpG-containing寡聚脫氧核苷酸聯用時，Coramsine的抑瘤作用增強因為Coramsine的在BALB/c荷瘤小鼠身上的

21、抑瘤作用與免疫系統介導的抑瘤作用并沒有明顯聯系并且Coramsine也不會像其他化療藥那樣導致淋巴細胞降低，我們探討在Coramsine用藥時給予免疫治療是否會增強其抑瘤作用。筆者實驗室先前的研究發現，吉西他濱與抗原呈遞細胞（directed 激活CD40）在作用于AB1-HA細胞時有很強的協同作用。在此，我們首先評價FGK-45抗CD40免疫治療（FGK-45抗體靜脈注射）配合Coramsine腹膜內用藥時的療效。治療方案大體如圖4A。很明顯，FGK-45單獨使用時可以延緩腫瘤生長（圖4A，P=0.011），與我們先前的研究一致。由圖4B我們可以看到Coramsine的抑瘤作用在用藥的前11

22、天，效果是比較顯著的（P=0.016）。但實驗沒有發現兩者的協同作用。在腫瘤淋巴灌注區的啟動事件后, FGK-45激活免疫反應， 但FGK-45并沒有增強Coramsine的抑瘤作用。說明與吉西他濱相比，Coramsine誘導的腫瘤細胞死亡并非由于其可能激活免疫反應。我們利用脂多糖，雙鏈RNA，膽堿磷酸甘油酯ODNs等相關病原體的炎性刺激能力啟動樹突狀細胞成熟并激活免疫反應。假設這些TLR配體激活免疫系統的信號有助于Coramsine在腫瘤治療中的作用。本實驗中將評價TLR-3(poly I/C),TLR-7(loxoribine),和TLR-9(CpG-containing ODNs)對Co

23、ramsine的協同作用。我們首先在預實驗的腫瘤模型中評價TLR配體的作用。AB1-HA腫瘤細胞接種到小鼠（n=4）。當腫瘤可觸及時（day0），開始用藥，每隔3天瘤內注射poly I/C，loxoribine， CpG-containing ODNs，和non CpG-containing ODNs，空白對照組注射PBS。所有小鼠以用藥3天中斷4天的方案經腹膜內注射Coramsine（14mg/kg）,監測腫瘤生長。治療方案如圖5A。引人注目的是，所有接受CpG- Coramsine方案的小鼠腫瘤生長明顯延緩（p=0.019與PBS組比較，P=0.027與non-CpG組比較.）生存期明顯延

24、長(P=0.009與PBS組比較,P=0.009與non-CpG組比較). CpG- Coramsine方案治愈一例腫瘤(1/4).如圖5B。相比之下在non CpG- Coramsin組(對照組),沒有發現兩者的協同抑瘤作用.(P=0.45,與PBS組比較，圖5)。我們擴展預實驗的數據范圍,進一步尋找CpG- Coramsin協同作用的證據.AB1-HA細胞接種于小鼠體內(n=10), Coramsine結合CpG或non CpG處理小鼠，如圖6所示。當Coramsine聯用CpG時, CpG可以增強Coramsine在延緩腫瘤生長和延長小鼠生存時間方面的作用.兩者聯用效果明顯優于CpG單藥

25、組 (p=0.023), Coramsine+non CpG對照組(p=0.0024)和PBS組(p=0.019). CpG單獨用藥時也可以明顯延緩腫瘤生長 (p=0.015,與non CpG組比較) 。Coramsine聯用CpG時可以顯著的延長荷瘤小鼠的生存時間, 與空白對照組(p=0.0015)和Coramsine+non-CpG組(p=0.0018)比較具有顯著性差異(如圖6B)。 但是CpG- Coramsin組的小鼠中位生存期為29天, CpG單獨用藥組為21天,兩組差異顯著(p=0.01)。圖4：快速篩選不同的TLRs配體對腫瘤生長速率（a）和生存曲線（b）的影響。各種不同的TL

26、Rs配體（三天一次）結合Coramsine治療（用藥3天間隔4天）。治療方案如圖a。盲法實驗。圖5，Coramsine結合CpG ODN用藥可以使治療獲益明顯增加。Coramsine和CpG ODN的協同作用對腫瘤生長速率（a）和生存曲線（b）的影響。Coramsine（用藥3天間隔4天）結合CpG ODN或non-CpG（三天一次）作用荷瘤小鼠（n=10）。治療方案如圖a。盲法實驗。討論 本實驗首次通過動物實驗闡述了澳洲茄堿和澳洲茄邊堿的生物堿苷類混合物全身用藥在詰抗實體腫瘤方面的效應。我們通過小鼠惡性間皮細胞瘤模型評估了這兩種生物堿苷類混合物（已命名為Coramsine）的抗腫瘤作用。實驗

27、證明Coramsine全身用藥可以延緩腫瘤生長并延長小鼠生存期。但所有小鼠最終都死于腫瘤說明其沒有使小鼠生存獲益。與其他化療藥物相比，Coramsine對免疫系統的影響較小。Coramsine治療過程中，并沒有淋巴器官中淋巴細胞記數的減少也沒有淋巴細胞進入腫瘤組織內。 Coramsine的抑瘤作用可以被CpG ODNs增強。雖然實驗證明Coramsine和CpG ODNs的協同作用是明確的但我們目前的數據在機制方面證明兩者的協同作用尚顯不足。Coramsine和CpG ODNs聯合用藥與他們單獨用藥相比可以顯著延緩腫瘤的生長。相反，當Coramsine聯合CD40的激活因子FGK-45單克隆抗

28、體用藥時，卻沒有發現兩者的協同作用。Coramsine與后天獲得性免疫治療（postlicensing ？）缺少協同作用的證據說明Coramsine誘導的細胞死亡是一個免疫沉默事件。如果Coramsine介導的細胞死亡是一個免疫激活事件，在我們先前對吉西他濱的實驗當中會發現APC對Coramsine治療的增強作用。事實恰恰相反。事實上，Coramsine的抑瘤作用可以被CpG增強與上述觀點是一致的。如果Coramsine誘導的腫瘤細胞死亡伴隨著很強的免疫激活信號（如CpG ODNs），腫瘤局部環境可由免疫沉默轉變成炎性環境。FGK-45可以增強Coramsine-CpG聯用時的療效預示上述結論的正確性。我們的數據驗證了數據尚未公布。我們的原始數據表明：coramsine引起的免疫休眠期細胞的死亡與暴露于coramsin間皮細胞瘤細胞產生白介素6減少有關，而吉西他濱能夠誘導白介素6產生。因為TLRs結合到樹突狀細胞可以激發白介素6的分泌，