1、方法簡介所謂的實時熒光定量 PCR 就是 通過對 PCR 擴增反應中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量 PCR 反應中，引入了一種熒光化學物質(zhì)，隨著 PCR 反應的進行，PCR 反應產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線。RT-qPCR是由三個步驟組成1、反轉錄:依賴反轉錄酶將RNA反轉錄成cDNDA2、擴增:用PCR的方法擴增cDNA3、檢測:實時檢測和定量擴增的產(chǎn)物RT-qRCR影響分析可靠性關鍵點(Key porint)1、分析結

2、果依賴于模板的數(shù)量、質(zhì)量以及合理的檢測方法設計2、反轉錄反應的非標準化影響試驗的穩(wěn)定性3、數(shù)據(jù)分析應該高度客觀，如果不合理的分析，從分析結果中會得到混淆的錯誤結果，因此通過對RT-qPCR的每一組分進行質(zhì)量評價以達到最小化變異性，最大化可重復性，而且還需要沿用一個通用的數(shù)據(jù)分析的指南。對基因表達分析的標準化的需要是與人類臨床診斷分析相適應的。QRT-PCR 抑制物的組成QRT-PCR抑制物嚴重減少了PCR的靈敏度以及熱動力學反應,高度的抑制還導致假陰性的結果。抑制物的來源：生物樣品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物，鹽離子，尿素，血紅素，heparin以及IgG.存在的問題由于各個學術團體和科研機

3、構使用不同的操作流程，必然導致大家使用不同定量的來源物以及數(shù)據(jù)分析：1、.新鮮、冰凍、甲醛固定的樣品2、整個組織樣本，顯微切割樣本，單個細胞，組培細胞3、總RNA或者mRNA4、RNA反轉錄成cDNA的不同的引發(fā)策略5、不同的酶以及酶的不同組合6、變異系數(shù)、靈敏度7、多類型的檢測化學方法，反應的條件，熱循環(huán)儀的分析以及匯報方式。8、每一步驟缺乏標準化分析流程造成了在樣品的處理，內(nèi)參的使用，歸一化的方法，質(zhì)量控制等等因素嚴重影響RT-qPCR的可信度，重復性。RNA 質(zhì)量評價現(xiàn)在RNA 定量的程序很多。最近EMBO qPCR course () 比較了用Ribogreen, Agilent Bi

4、oAnalyser, spectrophotometer,Nanodrop and the BioRad Experion 來定量同樣的樣品。結果顯示沒有哪兩種方法得到同樣的分析數(shù)據(jù)。所以用不同的方法進行定量是不明智的。因此，我們需要用統(tǒng)一套定量分析方法來完成所有RNA樣品的評價。RNA 質(zhì)量RNA 質(zhì)量主要包括RNA的純度（沒有蛋白質(zhì)和DNA的污染）以及完整性。傳統(tǒng)的RNA質(zhì)量的評價通過分析A260/A280的比值或者對瓊脂糖凝膠電泳rRNA的條帶的分析。Agilent Bioanalyser/BioRad Experion 微流體毛細電泳系統(tǒng)也是一種較新的分析方法。Agilent的2100

5、也是一種十分好的分析RNA質(zhì)量的方法，它通過分析18S以及28S rRNA的分析圖譜，通過圖譜來反應RNA的量和完整性，其完整性通過完整性系數(shù)（RIN）來反應。樣品的RINs在10-4之間。10代表完整的RNA，4代表沒有完整的rRNA帶。由于以上的方法并非100準確定反應mRNA的完整性，因為他們只是反應rRNA的量來間接測定mRNA的完整性。這里推薦一種方法：采用GAPDH的3：5分析法。我們使用oligo dT進行逆轉錄，然后對逆轉錄的cDNA用multiplex熒光定量評價。設計三個taqman探針來定量三種相同大小的擴增產(chǎn)物。探針設計的位點分別位于3;5以及中部。擴增產(chǎn)物的之間的比值

6、反應RNA的完整性。如果3;5的比值在1,反應較高度完整性，如果高于5說明降解。是否有抑制物的評價體系：1、通過對目的樣品進行梯度稀釋進行PCR擴增效率的檢測2、.通過內(nèi)部擴增對照來反應樣品處理過程中樣本的情況3、用細菌檢測臨床樣品的抑制4、通過標準人工合成的擴增進行RT-PCR來反應目標檢測物的抑制情況反轉錄反應系統(tǒng)1、RT和PCR單一酶系統(tǒng)2、RT和PCR分離的酶系統(tǒng)3、RNA逆轉錄引物的選擇引物主要有三種：1、隨機引物：隨機引物，特別是6nt引物對所有的靶位點不產(chǎn)生十分穩(wěn)定一致的結果，建議使用15nt的隨機引物。2、oligo-dT：只能用于mRNA完整的樣品，特別有polyA .而且對

7、于一些特殊的變異體以及較長的3UTR的區(qū)域比較困難3、特異引物：最特異最靈敏的方法。特別RNA量足夠情況下建議使用此法。PCR 優(yōu)化PCR優(yōu)化主要有：1、引物的濃度2、建議使用SYBR Green I和EvaGreen 進行擴增和溶解曲線的測試筆者建議的操作流程:I靶的選擇和試驗設計1.針對目的基因序列選擇合適的擴增片斷查看以下三個網(wǎng)站是否有合適的已經(jīng)證實的QRT-PCR的擴增引物,探針以及反應條件.RTPrimerDB (),PrimerBank ()Real Time PCR Primer Sets ()如果沒有合適的或者已經(jīng)證實的可以提供參考,以下的設計方案僅供參考:A、最廣泛使用的商業(yè)

8、化的軟件Beacon Designer()B、DIY的軟件Primer ExpressC、如果Beacon Designer 無法得到您說需要的結果,或者獲得到設計方案的備選數(shù)目不夠的話,可以選擇Sigma-Genosys )的服務方案,詳細周到D、一個免費的基于網(wǎng)頁構架的引物和探針設計程序: 您可以挑選其中的4-6對引物進行試驗,選擇引物的擴增效率和靈敏度高的.這個軟件可以直接與NCBI的網(wǎng)站進行比對,并且用NCBI的ePCR進行虛擬的電子PCR引物設計簡介DNA引物長度:15-25 個堿基GC含量:50%左右如果引物的與AT區(qū)域富集結合,可以考慮用LNA替換幾個堿基,較少引物的長度以及避免

9、引物次級結構和3端二聚體的影響.由于引物和模板和探針與靶點之間的分之間的相互競爭,分之內(nèi)雜交,倒轉重復等等會引起引物的引發(fā)探針對結合效率達降低,因此我們選擇引物二聚體的G為負值,即:<10 kcal/mol.沒有連續(xù)的G/C.引物探針的保存一般遵循以下原則:正向和反向引物保存在-20度, 濃度為10mM 或者10×工作濃度.探針應該避光保存，貯存在-70度,最好以凍干粉狀態(tài)，工作濃度的液體保存一般兩周左右。2、輸入靶序列，用BLASTn在進行比對。3、檢查比對序列的多態(tài)性以及可能的錯誤避免這些區(qū)域來進行引物和探針設計。4、在靶序列中避免直接待重復區(qū)，在重復區(qū)進行雜交容易使得引物

10、非獲得產(chǎn)物性結合，降低DNA的擴增效率以及減少分析的靈敏度。5、考慮到潛在的剪接變異體以及合適的所需要的獲得到靶，通過學分析內(nèi)含子以及外顯子的邊界，主要通過cDNA和基因組序列比對來確定。一般都設計跨最長內(nèi)含子區(qū)，這樣減少了擴增子受到基因組DNA的污染的影響。這是十分有必要的，特別當用DNA做歸一化處理以及靶向某一特異的剪接變異體。最經(jīng)濟的做法是讓下游引物跨越剪接接頭，這樣允許使用一條探針檢測可能剪接變異體.然后如果在有效性和靈敏度無法保證情況下，可以使用跨越單一外顯子的設計方案。我們還是建議試驗者用DnaseI處理樣品，除去gDNA的污染。6、在RT步驟時，用()工具檢測在特定溫度下靶序列的

11、折疊情況，避免一些高度次級結構的區(qū)域，那些區(qū)域探針和引物結合效率較低。7、盡可能用60-150bp的擴增產(chǎn)物，GC含量在60或者稍小來確定高效的變性，更高度反應效率。GC含量高度序列容易產(chǎn)生非特異性的反應，短序列擴增是的擴增時間縮短gDNA污染可能性減少。短的序列容易人工合成，用來做擴增多標準曲線。用oligodT進行逆轉錄最好設計擴增子位于靠近模板的3區(qū)域 。實時熒光定量PCR技術的原理及應用(圖)點擊次數(shù)： 2258  發(fā)表于：2008-07-21 01:57轉載請注明來自丁香園 來源：互聯(lián)網(wǎng) 一、實時熒光定量PCR原理（一）定義：在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒

12、光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法 。（二）實時原理1、常規(guī)PCR技術：對PCR擴增反應的終點產(chǎn)物進行定量和定性分析無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應實時檢測。2、實時定量PCR技術：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析3、如何對起始模板定量？ 通過Ct值和標準曲線對起始模板進行定量分析.4、幾個概念：（1）擴增曲線 ：（2） 熒光閾值：（3）Ct值：     CT值的重現(xiàn)性：5、定量原理：理想的PCR反應

13、：   X=X0*2n非理想的PCR反應：  X=X0 (1+Ex)n      n：擴增反應的循環(huán)次數(shù)      X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量      X0：初始模板量      Ex：擴增效率5、標準曲線6、絕對定量1）確定未知樣品的 C(t)值 2）通過標準曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量7、DNA的熒光標記：分頁: 1   2   3

14、   實時熒光定量PCR技術的原理及應用(圖)點擊次數(shù)： 2258  發(fā)表于：2008-07-21 01:57轉載請注明來自丁香園 來源：互聯(lián)網(wǎng) 二、實時熒光定量PCR的幾種方法介紹方法一：SYBR Green法（一）工作原理1、SYBR Green  能結合到雙鏈DNA的小溝部位     2、SYBR Green  只有和雙鏈DNA結合后才發(fā)熒光3、變性時，DNA雙鏈分開，無熒光4、復性和延伸時，形成雙鏈DNA， SYBR Green 發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號。PCR反應體系的建立及優(yōu)化:

15、 1、SYBR Green 使用濃度:太高抑制Taq酶活性，太低，熒光信號太弱，不易檢測 2、Primer：引物的特異性高，否則擴增有雜帶，定量不準 3、MgCl2的濃度:可以降低到1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)物4、反應Buffer 體系的優(yōu)化5、反應溫度和時間參數(shù):由酶和引物決定 6、其他與常規(guī)PCR相同（二）應用范圍1、起始模板的測定；2、 基因型的分析；3、 融解曲線分析：可以優(yōu)化PCR反應的條件，對常規(guī)PCR有指導意義，如對primer的評價；可以區(qū)分單一引物、引物二聚體、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物。（三）優(yōu)點及缺點優(yōu)點：對DNA模板沒有選擇性；適用于任

16、何DNA； 使用方便；不必設計復雜探針；非常靈敏； 便宜。 缺點：容易與非特異性雙鏈DNA結合，產(chǎn)生假陽性；但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反應條件；   對引物特異性要求較高。方法二：TaqMan-水解型雜交探針 *5端標記有報告基團(Reporter, R)  ，如FAM、VIC等 *3端標記有熒光淬滅基團 (Quencher, Q)* 探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收 ，無熒光， R與Q分開，發(fā)熒光*Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探針（一）工作原理注意：每擴增一條DNA分子，釋放一個熒光信號，可以在循環(huán)過程中任一點

17、檢測熒光PCR反應的建立：1、引物、探針的設計： 探針Tm為68-70 ，<30 bp, 5不能有G，G可能會淬滅熒光素，引物盡量靠近探針，擴增片段<400 bp，引物Tm為59-602、反應參數(shù)的確定：一般為：94 ，10-20S 60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高） 也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度72 ，45 S，3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，信號/背景比值的最大值  引物濃度：50-900nM 探針濃度：50-250nM4、其他與常規(guī)PCR相同（二）優(yōu)缺點優(yōu)點：對目標序列的高特異性 &

18、#160;      -陰性結果確定設計相對簡單       -與目標序列某一區(qū)域互補重復性比較好缺點：只適合一個特定的目標;委托公司標記，價格較高;不易找到本底低的探針定量PCR常見問題及對策點擊次數(shù)： 417  發(fā)表于：2008-07-20 19:35轉載請注明來自丁香園 來源：丁香園 Q1無CT值（信號）出現(xiàn)1.反應循環(huán)數(shù)不夠。一般都要在35個循環(huán)以上，可根據(jù)實驗情況增加循環(huán)（如至45cycles），但高于45個循環(huán)會增加過多的背景信號。 2.檢測熒光信號的步

19、驟有誤。一般SG法采用72延伸時采集，Taqman法則一般在退火結束時或延伸結束采集信號。 3.引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測其完整性。 4.引物或探針的設計，如探針高于引物的溫度不夠，造成探針未雜交上而產(chǎn)物已延伸的情況。 5.模板量不足。對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。 6.模板降解。避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復凍融的情況。 Q2CT值出現(xiàn)過晚1.擴增效率低，反應條件不夠優(yōu)化。設計更好的引物或探針；改用三步法進行反應；適當降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。 2.PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足。 3.PCR產(chǎn)物太長。一般采用80-150bp的產(chǎn)物長度。 Q3標準

20、曲線的線性關系不佳1.加樣存在誤差，使得標準品不呈梯度。 2.標準品出現(xiàn)降解。應避免標準品反復凍融，或重新制備并稀釋標準品。 3.引物或探針不佳。重新設計更好的引物和探針 4模板中存在抑制物，或模板濃度過高 Q4陰性對照也出現(xiàn)明顯的起飛1.應mix或水被污染。 2.引物二聚體的出現(xiàn)。用SG法在35cycles以后陰性出現(xiàn)起飛屬正常情況，可配合熔解曲線進行分析。 3.反應過程中探針的降解。用PAGE電泳對探針進行檢測。 4.如果使用了ROX校正，則可能是ROX的降解所造成。 Q5在溶解曲線前是否插入一個同溶解程序初始溫度相同的一個保溫過程如果在熔解曲線前沒有一個保溫過程，則曲線會在前幾個循環(huán)非常

21、陡峭，使真正的熔解峰型幾乎看不到。 Q6熔解曲線不止一個主峰1引物設計不夠優(yōu)化。應避免引物二聚體和發(fā)夾結構的出現(xiàn)。 2.引物濃度不佳。適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。 3.鎂離子濃度過高。適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。 4.模板有基因組的污染。RNA提取過程中避免DNA的引入，或通過引物設計避免非特異擴增。Q7擴增效率低1.反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解。 2.反應條件不夠優(yōu)化，可適當降低退火溫度或改為三步擴增法。 3.反應體系中有PCR反應抑制物。一般是加入模板時所引入，應先把模板適度稀釋，再加入反應體系中，減少抑制物的影響。 Q8實驗重復性不好1.加樣不準確。 2.儀器在樣品上溫度條件有差異，即溫度