1、微生物學(xué)檢驗(yàn)常用的技術(shù)方法隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)及相關(guān)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，各學(xué)科相互交叉和滲透，醫(yī)學(xué)微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)已深入到細(xì)胞、分子和基因水平，許多新技術(shù)、新方法已在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室得到廣泛應(yīng)用。醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的基本任務(wù)之一是利用微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)，準(zhǔn)確、快速檢驗(yàn)和鑒定臨床標(biāo)本中的微生物，并對(duì)引起感染的微生物進(jìn)行耐藥性監(jiān)測(cè)，為臨床對(duì)感染性疾病診斷、治療、流行病學(xué)調(diào)查及研究等提供科學(xué)依據(jù)。微生物形態(tài)學(xué)檢查細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查是細(xì)菌檢驗(yàn)的重要方法之一，它是細(xì)菌分類和鑒定的基礎(chǔ)，可根據(jù)其形態(tài)、結(jié)構(gòu)和染色反應(yīng)性等，為進(jìn)一步鑒定提供參考依據(jù)。一、顯微鏡檢查由于細(xì)菌個(gè)體微小，肉眼不能看到，必須借助顯微鏡的放大才能看到。一

2、般形態(tài)和結(jié)構(gòu)可用光學(xué)顯微鏡觀察，其內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)則需用電子顯微鏡才能看清楚。常用顯微鏡有如下幾種。1.普通光學(xué)顯微鏡采用自然光或燈光為光源，其波長約為0.4m。顯微鏡的分辨率為波長的二分之一，即0.2m，而肉眼可見的最小形象為0.2mm。故用油(浸)鏡放大1 000倍，能將0.2m的微粒放大成肉眼可見的0.2mm。普通光學(xué)顯微鏡可用于細(xì)菌、放線菌和真菌等的觀察。2.暗視野顯微鏡常用于觀察不染色微生物形態(tài)和運(yùn)動(dòng)。在普通顯微鏡安裝暗視野聚光器后，光線不能從中間直接透入，視野呈暗色，當(dāng)標(biāo)本接受從聚光器邊緣斜射光后可發(fā)生散射，因此可在暗視野背景下觀察到光亮的微生物如細(xì)菌或螺旋體等。3.相差顯微鏡相差顯

3、微鏡利用相差板的光珊作用，改變直射光的光位相和振幅，將光相的差異轉(zhuǎn)換為光強(qiáng)度差。在相差顯微鏡下，當(dāng)光線透過不染色標(biāo)本時(shí)，由于標(biāo)本不同部位的密度不一致而引起光相的差異，可觀察到微生物形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)方式等。4.熒光顯微鏡熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡基本相同，主要區(qū)別在于光源、濾光片和聚光器。目前實(shí)驗(yàn)儀器中大多數(shù)使用的是落射光裝置，常用高壓汞燈作為光源，可發(fā)出紫外光或藍(lán)紫光。濾光片有激發(fā)濾光片和吸收濾光片二種。用藍(lán)光的熒光顯微鏡除可用一般明視野聚光器外，也可用暗視野聚光器，以加強(qiáng)熒光與背景的對(duì)比。本法適用于對(duì)熒光色素染色或與熒光抗體結(jié)合的細(xì)菌的檢測(cè)或鑒定。5.電子顯微鏡用電子流作為光源，波長與可

4、見光相比差幾萬倍，大大提高了分辨力，并用磁性電圈作為光學(xué)放大系統(tǒng)，放大倍數(shù)可達(dá)數(shù)萬倍或幾十萬倍，常用于病毒顆粒和細(xì)菌超微結(jié)構(gòu)的觀察。二、不染色標(biāo)本檢查不染色標(biāo)本一般可用于觀察細(xì)菌形態(tài)、動(dòng)力及運(yùn)動(dòng)情況。細(xì)菌未染色時(shí)無色透明，在顯微鏡下主要靠細(xì)菌的折光率與周圍環(huán)境的不同來進(jìn)行觀察。有鞭毛的細(xì)菌運(yùn)動(dòng)活潑，無鞭毛的細(xì)菌則呈不規(guī)則布朗運(yùn)動(dòng)。梅毒蒼白密螺旋體、鉤端螺旋體、彎曲桿菌等的活菌各有特征鮮明的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)方式，具有診斷意義。常用的方法有壓滴法、懸滴法和毛細(xì)管法等。1.懸滴法在潔凈凹玻片的凹孔四周涂上凡士林，用接種環(huán)取一環(huán)菌懸液放在蓋玻片中央，再將凹玻片的凹孔對(duì)準(zhǔn)蓋玻片中央的液滴并蓋上，然后迅速翻轉(zhuǎn)，

5、輕壓蓋玻片，使其與凹孔邊緣的凡士林粘緊封閉后置高倍鏡下(或暗視野)觀察。2.壓滴法用接種環(huán)取一環(huán)菌懸液置于潔凈玻片的中央，在菌懸液上輕輕蓋上一蓋玻片，注意避免產(chǎn)生氣泡并防止菌懸液外溢，靜止數(shù)秒鐘后置高倍鏡下明視野(或暗視野)觀察。3.毛細(xì)管法三、染色標(biāo)本檢查細(xì)菌標(biāo)本經(jīng)染色后，由于細(xì)菌與周圍環(huán)境間在顏色上形成鮮明對(duì)比，故在普通光學(xué)顯微鏡下可清楚地觀察到細(xì)菌的形態(tài)特征(如細(xì)菌的大小、形狀、排列等)和某些特殊結(jié)構(gòu)(如莢膜、鞭毛、芽孢等)，并可根據(jù)染色反應(yīng)性對(duì)細(xì)菌加以分類鑒定。(一)細(xì)菌染色的一般程序細(xì)菌染色的一般程序是：涂片(干燥)固定染色(媒染)(脫色)(復(fù)染)。1.涂片制備血液、分泌物、排泄物、

6、穿刺液和液體培養(yǎng)物，直接在載玻片上作薄膜涂片;尸檢或感染動(dòng)物組織，病變局部涂抹采樣的棉拭子直接涂片。固體培養(yǎng)基上的菌落或菌苔的制片，先用接種環(huán)取一環(huán)生理鹽水置載玻片中央，再用無菌接種環(huán)取少量的培養(yǎng)物在生理鹽水中磨勻，涂布成1cm2大小的涂面，置室溫下自然干燥或遠(yuǎn)火慢慢烘干。2.固定目的是殺死細(xì)菌，凝固細(xì)菌蛋白及結(jié)構(gòu)，便于染色;促使細(xì)菌粘附在載玻片上，避免在水洗過程中被水沖掉;改變細(xì)菌對(duì)染料的通透性，有利于菌細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的染色。通常用火焰加熱固定，將已干燥的涂片在火焰中迅速通過3次，以手背皮膚接觸玻片不燙為佳。3.染色根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康牟煌x擇不同的染色方法進(jìn)行染色。染色時(shí)滴加染液，以復(fù)蓋標(biāo)本為度。4

7、.媒染凡能增強(qiáng)染料和被染物的親和力，使染料固定于被染物及能引起細(xì)胞膜通透性改變的物質(zhì)，稱媒染劑。常用的有明礬、鞣酸、金屬鹽和碘等，也有用加熱法促進(jìn)著色。媒染劑可用于初染與復(fù)染之間，也可用于固定之后或含于固定液、染色中。5.脫色凡能使已著色的被染物脫去顏色的化學(xué)試劑稱為脫色劑。常用乙醇、丙酮等作為脫色劑。脫色劑可以查出細(xì)菌與染料結(jié)合的穩(wěn)定程度，作為鑒別染色之用。6.復(fù)染已脫色處理的細(xì)菌或其結(jié)構(gòu)常以復(fù)染液作復(fù)染以便于觀察。復(fù)染液與初染液的顏色不同而成一鮮明對(duì)比。復(fù)染不宜太強(qiáng)，以免掩蓋初染的顏色。主要用于厭養(yǎng)菌動(dòng)力的檢查。通常選用6070mm長。0.51.0mm孔徑的毛細(xì)管虹吸厭養(yǎng)菌懸液后，用火焰將毛細(xì)管兩端熔封。并用塑膠紙將毛細(xì)管固定在載玻