1、星形細胞腫瘤血管內皮生長因子和蛋白酶激活受體-1的表達 作者：劉永軍， 安麗文， 趙憲林， 關一夫【摘要】 目的： 探討血管內皮生長因子（VEGF）和蛋白酶激活受體-1（PAR-1）的表達與星形細胞腫瘤病理分級的關系以及兩者的相關性。方法： 用半定量RT-PCR方法檢測50例星形細胞腫瘤和10例正常腦組織中VEGF和PAR-1的表達水平。結果： 在正常腦組織中VEGF和PAR-1的表達與星形細胞腫瘤比較差異有統計學意義；VEGF和PAR-1在星形細胞腫瘤級、級與級中的表達水平，差別具有統計學意義。經Spearman等級相關分析VEGF和PAR-1兩者的表達指數正相關（r=0.355，P<

2、0.05）。結論： VEGF和PAR-1的表達與星形細胞腫瘤的侵襲性密切相關，可作為臨床判斷膠質瘤惡性程度、侵襲性的重要指標。 【關鍵詞】 星形細胞瘤； 逆轉錄聚合酶鏈反應； 血管內皮生長因子； 蛋白酶激活受體-1 Abstract Objective: To investigate the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) and protease-activated receptor 1(PAR-1) in astrocytoma and their correlation. Methods: Semi-quant

3、itative reverse transcription-polymerase chain reaction was performed to detect the expression of VEGF and PAR-1 in 50 cases of astrocytic tissues and 10 cases of normal brain tissues. Results: The expression indexes of VEGF and PAR-1 between the astrocytic tissues and the normal brain tissues were

4、of statistical difference. Significant differences in the expression indexes of VEGF and PAR-1 were found among the tumor tissues of grade , grade and grade . There existed significant positive correlation between the expression indexes of VEGF and PAR-1 (r0.355, P<0.05). Conclusions: The express

5、ion of VEGF and PAR-1 are closely correlated with the development of the invasive activity of human astrocytoma, which may be helpful in judging the malignancy and invasion of astrocytoma. Key words astrocytoma; reverse transcriptase polymerase chain reaction; vascular endothelial growth factor; pro

6、tease-activated receptor 1 星形細胞腫瘤是最常見的腦膠質瘤之一，約占全部腦膠質瘤的1739.1。由于其侵襲性生長方式，導致手術難以完全切除腫瘤組織，5年生存率為14311。因此，從分子腫瘤學角度研究瘤侵襲性的發生、發展機制，探討有效治療措施十分必要。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和蛋白酶激活受體-1（protease-activated receptor 1，PAR-1）與腫瘤的發生、發展的關系受到廣泛的重視。采用RT-PCR（reverse transcription-polymerase chai

7、n reaction）方法對50例星形細胞腫瘤組織和10例正常腦組織VEGF mRNA和PAR-1 mRNA表達水平進行檢測并行半定量比較，對兩者相關性進行分析，旨在探討VEGF和PAR-1與星形細胞腫瘤侵襲性的關系。 1 材料和方法 1.1 材料 50例不同級別星形細胞腫瘤選自中國醫科大學附屬第四醫院神經外科。按1993年WHO中樞神經系統腫瘤分類標準分類：星形細胞瘤（WHO 級）15例，間變性惡性星形細胞瘤（WHO 級）19例，多形性膠質母細胞瘤（WHO 級）16例。其中，男35例，女15例，年齡2470歲（中位年齡49歲）。所有病例術前均未行化療、放療和其他抗癌治療。取在腦外傷手術內減壓

8、中切除的腦組織10例作為正常對照。在手術間切下標本后馬上投入液氮中冷凍30 min后轉入-80冰箱中保存。Trizol試劑購自Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒（RNA PCR Kit AMV Ver.3.0）、引物均由TaKaRa公司提供。 1.2 方法 1.2.1 提取組織總RNA 采用Trizol一步法提取組織總RNA，用紫外分光光度儀檢測其純度，電泳檢測其完整性，并將RNA稀釋至500 mg/L。 1.2.2 半定量RT-PCR 反應體系依照試劑盒說明，反轉錄得cDNA后行PCR擴增，檢測標本VEGF和PAR-1 mRNA表達水平。PCR反應選擇處于指數生長期的循環數為反應條

9、件，以確保PCR產物量能夠反映最初的模板量；引物以Primer 3 )進行設計，并行生物信息學比對分析；以無菌雙蒸水為陰性對照，以GAPDH為內對照，以試劑盒提供的對照RNA樣品及其特異性引物的擴增產物為陽性對照。引物序列、擴增產物大小及PCR反應條件見表1。PCR產物經8聚丙烯酰胺凝膠電泳，10 mg/L EB染色，凝膠成像系統（美國 Alpha FluorChem）成像，Image J軟件分析灰度值，計算條帶的積分吸光度（積分吸光度平均吸光度面積）。結果判定：以同一模板VEGF或PAR-1與GAPDH基因產物積分吸光度的比值作為VEGF或PAR-1的表達指數。 1.3 統計學處理 表1 引

10、物序列、擴增產物大小及PCR反應條件所得數據計量資料用xs表示，比較用t檢驗；相關性用Spearman等級相關分析。所有統計均在SPSS10.0統計軟件包中完成，P<0.05為差異有統計學意義。 2 結果 2.1 VEGF在正常腦組織和不同級別星形細胞腫瘤中的表達 見圖1。在正常腦組織中VEGF的表達指數為0.370.04，與星形細胞腫瘤（0.470.07）比較差異有統計學意義（P<0.05）；依照WHO中樞神經系統腫瘤分類，標準分類其級組（0.420.06）與級組（0.470.08）比較差異有統計學意義（P<0.05），與級組（0.520.08）比較差異有統計學意義（P&l

11、t;0.05）；級組（0.470.08）與級組（0.520.08）比較差異無統計學意義（P>0.05）。經Spearman等級相關證實，VEGF表達與病理分級成正相關（r=0.457，P<0.05）。注：1、3、5為星形細胞腫瘤；2、4、6為正常腦組織 2.2 PAR-1在正常腦組織和不同級別星形細胞腫瘤中的表達 見圖1。在正常腦組織中PAR-1的表達指數為0.300.03，與星形細胞腫瘤（0.360.04）比較差異有統計學意義（P<0.05）；依照WHO中樞神經系統腫瘤分類標準分類，其級組（0.330.04）與級組（0.360.04）比較差異有統計學意義（P<0.05

12、），與級組（0.380.06）比較差異有統計學意義（P<0.05）；級組（0.360.04）與級組（0.380.06）比較差異無統計學意義（P>0.05）。經Spearman等級相關證實，PAR-1表達與病理分級成正相關（r=0.376，P<0.05）。 2.3 VEGF和PAR-1在不同級別星形細胞腫瘤表達的相關性 經Spearman等級相關分析表明兩者之間存在顯著相關性（r=0.355，P<0.05）。 3 討論 腫瘤生長與血管生成有密切關系，實體腫瘤超過2 mm必須依靠新生的血管生成，才能與腫瘤宿主的脈管系統保持一定的連續性。在已發現的許多腫瘤血管形成因子中，VE

13、GF是作用強、特異性高的血管生長因子之一，已在多種腫瘤細胞系和組織有相關報道2。VEGF以旁分泌方式作用于細胞上的2種受體flt-1和KDR，調控血管生成，為腫瘤提供充足的血液供應，促使腫瘤細胞惡性增殖和侵襲性生長3。應用RT-PCR方法對星形細胞腫瘤和正常腦組織中VEGF mRNA表達水平進行檢測并行半定量比較，結果顯示，在正常腦組織中VEGF的表達指數（0.370.04）與星形細胞腫瘤（0.470.07）比較差異有統計學意義（P<0.05）；VEGF的表達指數隨星形細胞腫瘤病理分級的增高而增高：級（0.420.06），級（0.470.08），級（0.520.08）；其中級與、級分別比

14、較差異有統計學意義（P<0.05），級與級比較差異無統計學意義（P>0.05）。且經Spearman等級相關證實，VEGF表達與病理分級成正相關（r=0.457，P<0.05）。證實VEGF的表達與星形細胞腫瘤惡性程度密切相關，其研究結果與報道相似4。因此，VEGF可作為星形細胞腫瘤惡性程度的參考指標。 PAR-1是典型的7次跨膜G蛋白偶聯受體，是第一個發現的凝血酶受體。PAR-1在血栓形成、炎癥反應等過程中發揮多方面作用。新近PAR-1在腫瘤侵襲、轉移中的作用日益受到關注5。Granovsky-Grisaru S等6利用原位雜交和免疫組織化學方法研究74例子宮內膜癌組織標本

15、PAR-1 mRNA和蛋白表達水平發現，PAR-1的表達水平與病理分級相關，與組織類型無關，在正常、分化不良、低級別子宮內膜癌中表達陰性。Kaushal V等7利用實時定量RT-PCR和免疫印跡方法檢測PAR-1表達水平，結果顯示與早期前列腺癌組織相比，進展期前列腺癌中PAR-1 mRNA的表達增加2.39倍，蛋白水平增加2.75倍，且PAR-1的表達與術前PSA表達顯著正相關，免疫組織化學結果PAR-1在腫瘤血管呈強陽性表達，提示PAR-1在腫瘤血管生成中可能有重要作用，有望成為診斷治療的新靶點。應用RT-PCR方法對星形細胞腫瘤和正常腦組織中PAR-1 mRNA表達水平進行檢測并行半定量比

16、較，結果顯示，在正常腦組織中PAR-1的表達指數（0.300.03）與星形細胞腫瘤（0.360.04）比較差異有統計學意義（P<0.05）；PAR-1的表達指數隨星形細胞腫瘤病理分級的增高而增高：級（0.330.04），級（0.360.04），級（0.380.06）；其中級分別與、級比較差異有統計學意義（P<0.05），級與級比較差異無統計學意義（P>0.05）。且經Spearman等級相關證實，PAR-1表達與病理分級成正相關（r=0.376，P<0.05）。證實PAR-1的表達與星形細胞腫瘤惡性程度密切相關，其研究結果與子宮內膜癌、前列腺癌、黑色素瘤報道相似68。因

17、此，PAR-1可作為判斷星形細胞腫瘤進展的參考指標。 目前PAR-1與腫瘤血管生成的關系報道較少，且多局限于細胞系和動物模型實驗。在前列腺癌細胞DU145中研究顯示：用PAR-1的siRNA或ERK和PI3K的抑制劑均能減弱凝血酶誘導后VEGF和IL-8表達增加的作用，提示在前列腺癌細胞系中凝血酶PAR-1系統通過上調與腫瘤血管生成有關的細胞因子從而促進腫瘤進展9。Sarker KP等10在視網膜母細胞瘤NB-1細胞系中的研究顯示，凝血酶和PAR-1的激動劑可增加VEGF的分泌，凝血酶抑制劑阿加曲班可有效減少該作用。通過對50例不同級別星形細胞腫瘤臨床標本研究發現，經Spearman等級相關分

18、析，VEGF和PAR-1兩者的表達指數正相關（r0.355，P<0.05），提示兩者在星形細胞瘤血管生成、腫瘤侵襲進展過程中具有協同作用，這為進一步探討VEGF和PAR-1作用機制提供臨床基礎。 綜上所述，VEGF和PAR-1的表達水平與星形膠質細胞瘤病理分級正相關，與侵襲性生物學行為密切相關，VEGF和PAR-1有可能成為反映星形細胞腫瘤惡性程度和病理分級的有效指標。【參考文獻】 1 吳承遠，劉玉光. 臨床神經外科學M.北京: 人民衛生出版社, 2001: 249-254. 2 Pradeep CR, Sunila ES, Kuttan G.Expression of vascular

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20、rn HM, et al. Functional significance of vascular endothelial growth factor receptor expression on human glioma cells J. J Neurooncol，2004(1-2): 9-18. 5 Arora P, Ricks TK, Trejo J. Protease-activated receptor signalling, endocytic sorting and dysregulation in cancer J. J Cell Sci， 2001(6):921-928. 6 Granovsky-Grisaru S, Zaidoun S, Grisaru D, et al. The pattern of protease activated receptor 1 (PAR1) expression in endometrial carcinoma J. Gynecol Oncol， 2006(3): 802-806. 7 Kaushal V, Kohli M, Denn