1、急性白血病細(xì)胞凋亡抑制基因Livin表達(dá)及臨床意義【摘要】 目的 觀察 Livin 基因在急性白血病(AL)病人白血病細(xì)胞中的表達(dá)及其臨床意義。方法 采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)方法檢測41例不同時期AL病人白血病細(xì)胞Livin mRNA的表達(dá)水平，以10例健康人作為正常對照。結(jié)果 AL病人白血病細(xì)胞Livin mRNA 陽性表達(dá)率為53.7%。其中急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)和急性非淋巴細(xì)胞白血病(ANLL)病人Livin mRNA 陽性表達(dá)率分別為53.8%、53.6%，二者比較差異無顯著性，但均高于正常對照組(10.0%)(P=0.035、0.017)。初治和復(fù)發(fā)AL病人白

2、血病細(xì)胞Livin mRNA 陽性表達(dá)率分別為52.4%、85.7%，明顯高于對照組(P=0.025、0.004)。緩解組病人Livin mRNA陽性表達(dá)率為15.4%，明顯低于初治組和復(fù)發(fā)組(P=0.004、0.030)，而與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。白細(xì)胞計數(shù)50×109/L的初治白血病病人Livin mRNA的陽性表達(dá)率(77.8%，7/9)明顯高于白細(xì)胞計數(shù)<50×109/L的初治病人(25.0%，3/12)(P=0.022)，其表達(dá)水平也明顯高于后者(T=6.50，P<0.05)。結(jié)論 Livin mRNA過度表達(dá)參與了AL的發(fā)病，可

3、作為AL的診斷、復(fù)發(fā)及預(yù)后判斷的指標(biāo)之一。Livin mRNA表達(dá)在AL細(xì)胞的增殖分化和(或) 抗凋亡過程中發(fā)揮了重要作用，可能是導(dǎo)致AL細(xì)胞對化療藥物不敏感的原因之一，可作為治療的一個潛在靶點。 【關(guān)鍵詞】 Livin 基因;白血病;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) ABSTRACT Objective To explore the correlation between the expression of Livin gene in acute leukemic (AL) cells and its clinical significance. Methods The levels of leukemi

4、c cell Livin mRNA in 41 AL patients and 10 healthy controls were measured by semiquantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RTPCR) technique. Results The positive expression rate of leukemic cell Livin mRNA in the patients was 53.7%, and that of Livin mRNA in ALL cells and ANLL ce

5、lls were 53.8% and 53.6%, respectively, the difference between them was not significant, but higher than that in normal controls (10.0%) (P=0.035,0.017). The expression of Livin mRNA in initiallytreated AL patients and the recurrent was 52.4% and 85.7%, respectively, which was significantly higher t

6、han that in normal controls (P=0.025,0.004). The expression of Livin mRNA in patients at remission was 15.4%, which was lower than that in initiallytreated and recurrent patients (P=0.004,0.030), but there was no statistical significance as compared with normal controls. Besides, the initiallytreate

7、d AL patients with a leukocyte count of at least 50×109 /L had a significantly higher Livin mRNA expression rate (77.8%,7/9) than that with a leukocyte count of less than 50×109 /L (25.0%,3/12) (P=0.022). In addition, the level of Livin mRNA in the former was significantly higher than that

8、 of the latter (T=6.50,P<0.05). Conclusion Overexpression of Livin mRNA involves in the pathogenesis of acute leukemia, which can be used as one of the parameters in the diagnosis, prediction of recurrence and prognosis of the disease. The expression of Livin mRNA plays an important effect on

9、 the proliferation and differentiation of AL cells, which may be one of the reasons leading to insensitive to chemotherapy of AL cells and be used as a potential target for the treatment of the disease. KEY WORDS Livin gene; leukemia; reverse transcriptase polymerase chain reaction 凋亡抑制是腫瘤細(xì)胞的一個普遍特性。

10、近年發(fā)現(xiàn)的凋亡蛋白抑制因子(IAP)是一類重要的抗細(xì)胞凋亡因子，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。目前，人類IAPs家族中已發(fā)現(xiàn)有NIAP、XIAP、clAP1、clAP2、survivin、apollon、ILP2和Livin共8個成員，其抗凋亡功能遠(yuǎn)強于Bc12家族，在腫瘤的發(fā)病機制中起著重要作用。其中clAP1、clAP2、survivin等多個IAP家族成員在白血病細(xì)胞中高表達(dá)，且與預(yù)后相關(guān)13。Livin是IAPs家族中的一個新成員，有2種異構(gòu)體(Livin 和Livin )，特異性表達(dá)于人的胚胎組織及大多數(shù)人類實體瘤組織，在分化成熟的正常組織中無表達(dá)或低表達(dá)46，在腫瘤組織中表達(dá)明顯增高，

11、與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，可能成為腫瘤基因診斷和治療的新靶點7。本研究旨在觀察Livin 基因在各類急性白血病(AL)病人中表達(dá)水平的變化，并探討其臨床應(yīng)用價值。 1 對象與方法 1.1 研究對象 AL病人41例，男16例，女25例;年齡1980 歲，中位年齡52 歲。其中急性非淋巴細(xì)胞白血病(ANLL) 28例(M2者10例，M3者4例，M4者6例，M5者8例)，急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL) 13例(L1型 5例,L2型 8例)。初治病人21例，復(fù)發(fā)7例，緩解13例。緩解病人中2例系由初診病人轉(zhuǎn)化而來。所有初診ALL 病人采用VDP(長春新堿、柔紅霉素、潑尼松) 或VDCP(長春新堿、柔紅霉素、

12、環(huán)磷酰胺、潑尼松) 化療方案誘導(dǎo)治療;ANLL病人采用HA (高三尖杉酯堿、阿糖胞苷) 或DA (柔紅霉素、阿糖胞苷) 化療方案治療，M3 病人采用全反式維甲酸(atRA) 或atRA與三氧化二砷(As2O3)合用，或以atRA 為主，聯(lián)合應(yīng)用小劑量DA 或HA 方案誘導(dǎo)分化治療。以上所有病人的診斷及治療均參照張之南等8主編的血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)。選擇10例健康人作為正常對照，男4例，女6例;年齡2157 歲，中位年齡41.5 歲。 1.2 標(biāo)本處理 無菌操作取EDTA抗凝的骨髓液2 mL，F(xiàn)icol液(相對密度1.077) 分離單個核細(xì)胞，細(xì)胞比例大于80%，錐蟲藍(lán)拒染率大于99%，取約6

13、×106個細(xì)胞，用PBS液洗滌2次，加Trizol 液1 mL，混勻后-20 保存，待提取RNA。 1.3 細(xì)胞總RNA提取 按Invitrogen 公司試劑盒說明書的步驟操作。紫外線分光光度計測定RNA 純度(A260/A280>1.6)，同時進行RNA 定量測定。在15 g/L瓊脂糖凝膠上電泳可見3條清晰亮帶，說明所提取RNA完整。 1.4 cDNA合成 取RNA 5 g，OLigo (dT) primer(0.5 g/L)1 L，用DEPC 處理水補至12 L，于70 下放置5 min。冰上驟冷后，加5×緩沖液4 L，RNA 酶抑制劑20 U，10 mm

14、oL/L dNTPs 2 L，37 5 min后加入RevertAid MMuLV逆轉(zhuǎn)錄酶 200 U，反應(yīng)體系20 L，42 反應(yīng)1 h，70 下放置10 min終止反應(yīng)。 1.5 PCR 擴增 1.5.1 引物設(shè)計 實驗中所用引物根據(jù)GenBank 提供的Livin mRNA 序列(Livin NM_139317.1;Livin NM_022161.2)，由上海生工公司設(shè)計合成。Livin 正義鏈： 5TGTCAGTTCCTGCTCCGGTCAA3，反義鏈：5CGCACGGCACAAAGACGATG3，其目的基因的長度為298 bp。Livin 正義鏈：5TGGGAAGAACCGGAAGA

15、C3，反義鏈：5CACGGCACAAAGACGATG3，其目的基因的長度為263 bp。actin正義鏈： 5CTGGGACGACATGGAGAAAA3，反義鏈： 5AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC3，目的基因長度為500 bp。 1.5.2 PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)體系包括：20 mol/L的Livin 正、反義鏈引物各0.5 L，10 mmol/L的dNTPs 1.6 L，10 ×緩沖液2 L，Taq DNA 聚合酶1 U，RT 產(chǎn)物1 L，其余以DEPC水補足至20 L。預(yù)實驗確定產(chǎn)物與循環(huán)之間呈線性關(guān)系。PCR 條件：95 預(yù)變性5 min，1個循環(huán);然后94 變性30

16、 s，59 復(fù)性30 s，72 延伸30 s，35個循環(huán);最后72 延伸10 min。同時行actin 測定作為內(nèi)參照。 1.6 PCR 產(chǎn)物分析 取PCR 產(chǎn)物10 L 與Loading Buffer 2 L混合，在15 g/L 瓊脂糖凝膠中電泳，80 V、25 min。陽性結(jié)果可見500、298和263 bp 處各有一條亮帶，分別為actin、Livin 和Livin 。紫外線透射儀觀察并照相，照片經(jīng)Metamorph Imaging Sight軟件進行分析并讀取吸光度值，取Livin/actin 吸光度比值進行半定量，代表mRNA表達(dá)水平。各標(biāo)本重復(fù)2 次，取平均值。 1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

17、 用SPSS 11.5 和PPMS 1.59統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。實驗數(shù)據(jù)以率和中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，組間比較采用2檢驗、Fishers精確概率檢驗或秩和檢驗。 2 結(jié) 果 2.1 AL細(xì)胞中Livin mRNA的表達(dá) 41例AL病人白血病細(xì)胞Livin mRNA 陽性表達(dá)率為53.7%(22/41)。其中ALL 病人的陽性表達(dá)率為53.8%(7/13)，ANLL病人陽性表達(dá)率為53.6%(15/28)，二者均高于對照組的10% (1/10)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.035、 0.017)。但ALL與ANLL 比較無統(tǒng)計學(xué)差異。ALL、ANLL病人及對照組Livin/actin的半定

18、量結(jié)果分別為0.171(0.102)、0.087(0.117)、0.010(0.007)，ALL與ANLL 病人Livin mRNA 表達(dá)水平均高于對照組(H=20.22，d=14.25、14.61，P<0.05)。圖1為部分病人的電泳結(jié)果。 M：Marker;、同一初治病人Livin 、;、同一緩解病人Livin 、;、同一復(fù)發(fā)病人Livin 、;、正常對照。 圖1 不同階段白血病病人Livin mRNA的表達(dá) 2.2 AL病人不同時期Livin mRNA的表達(dá) 初治組和復(fù)發(fā)組病人Livin陽性表達(dá)率分別為52.4%(11/21)、85.7%(6/7)，均高于對照組(P=0.0

19、25、0.004)。緩解組病人Livin陽性表達(dá)率為15.4%(2/13)，明顯低于初治組和復(fù)發(fā)組病人(P=0.004、0.030)，緩解組與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 2.3 Livin mRNA 表達(dá)與外周血白細(xì)胞計數(shù)關(guān)系 將初治白血病病人按白細(xì)胞計數(shù)分為兩組，白細(xì)胞計數(shù)50×109/L的白血病病人Livin mRNA陽性表達(dá)率(77.8%，7/9)，明顯高于白細(xì)胞計數(shù)<50×109/L的病人(25.0%，3/12)(P=0.022);兩組Livin/actin 半定量結(jié)果分別為0.086(0.389)、0.038(0.298)，前者表達(dá)水平也明顯高于后

20、者(T=6.50，P<0.05)。 3 討 論 IAPs家族已發(fā)現(xiàn)8個成員，是獨立于Bcl2的抗凋亡蛋白。IAPs的抗凋亡作用主要通過抑制凋亡蛋白酶的活性而實現(xiàn)。 Livin是LIN等6根據(jù)IAPs同源序列，采用含有BIR序列的EST克隆，在人胚腎cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)的一個IAPs 家族的新成員。2001年 ASHHAB等5明確了Livin存在2個不同的異構(gòu)體Livin 和Livin ，分別由298和280個氨基酸組成。基因定位于染色體20q13.3。Livin主要存在于細(xì)胞質(zhì)中56。 Livin抑制細(xì)胞凋亡作用主要通過其BIR區(qū)與半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspases)結(jié)合，抑

21、制Caspases3/7和Caspases9的活性，達(dá)到阻斷凋亡受體及以線粒體為基礎(chǔ)的凋亡途徑而起作用6。有研究報道Livin 還可能通過分解Smac，阻止其對XIAP的拮抗作用，從而間接抑制Caspase來調(diào)控凋亡10。由于Livin 和Livin 兩種亞型結(jié)構(gòu)上的差異，體外研究發(fā)現(xiàn)它們表現(xiàn)出不同的抗凋亡活性，雖然兩者都能阻斷TNF與抗CD95抗體所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，但在阻斷依托泊甙等降解DNA的抗癌藥物所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中，Livin 比Livin 有更強的阻斷能力1113。 Livin在胎兒發(fā)育過程中的多種組織高表達(dá)，在正常成人的大多數(shù)終末組織中(除胎盤)低表達(dá)或不表達(dá)45， 而在如黑色素瘤

22、、乳癌、宮頸癌、膀胱癌、前列腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)1112。 ABE 等13的研究顯示，Livin 在骨髓增生異常綜合征(MDS) 及初治急性髓系白血病(AML) 中表達(dá)均明顯高于正常對照組，提示Livin在初治白血病中可抑制凋亡。本文結(jié)果表明，大部分AL 病人表達(dá)Livin mRNA，而且Livin mRNA表達(dá)陽性率和表達(dá)水平在AL病人中均明顯高于正常對照組，認(rèn)為Livin的異常高表達(dá)與AL的發(fā)病有密切關(guān)系，與有關(guān)文獻報道一致13。本研究還對不同類型AL進行分析，結(jié)果顯示ALL 和 ANLL中Livin mRNA的表達(dá)均高于正常對照組，各個亞型之間并無明顯差異，推測L

23、ivin mRNA的過表達(dá)有可能是各類AL的共同發(fā)病機制。本文結(jié)果還顯示，初治及復(fù)發(fā)白血病病人Livin mRNA表達(dá)率高于對照組，而緩解組與對照組無差別，說明Livin 表達(dá)在AL細(xì)胞的增殖分化和(或) 抗凋亡過程中發(fā)揮了重要作用。本研究還顯示，Livin的表達(dá)水平在外周血白細(xì)胞數(shù)50×109/L的病人中高表達(dá)，而外周血白細(xì)胞數(shù)升高是AL預(yù)后不良的重要因素。因此，Livin可以作為判斷預(yù)后的重要指標(biāo)之一。Livin的高表達(dá)是造成白血病細(xì)胞耐藥的又一重要因素，具體作用機制有待于進一步研究。 有研究結(jié)果顯示，Livin過表達(dá)是白血病細(xì)胞耐藥的根本原因14。本文結(jié)果也顯示，Livin m

24、RNA 在初治AL病人表達(dá)率明顯高于正常對照組，治療緩解后其表達(dá)率明顯下降，復(fù)發(fā)后表達(dá)率又再次升高，其原因可能與Livin高表達(dá)后造成白血病細(xì)胞對化療藥物的敏感性下降有關(guān)。目前已有研究結(jié)果顯示，采用RNA干擾技術(shù)對Livin基因表達(dá)進行干預(yù)后，細(xì)胞對誘導(dǎo)凋亡的藥物和射線的敏感性增加11。由此可見，Livin基因有可能成為白血病治療的一個潛在靶點。 【參考文獻】 1王艷,林鳳茹,陳靜,等. 凋亡抑制蛋白基因在白血病患者中的表達(dá)及臨床意義J. 中華血液學(xué)雜志, 2005,26：697698. 2劉建剛,管洪在,盧偉. 急性白血病病人白血病細(xì)胞Survivin基因的表達(dá)及其臨床意義J. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)

25、院學(xué)報, 2007,43(4)：302304. 3林茂芳,孟小莉,蔡真,等. 抗凋亡基因survivin在急性白血病細(xì)胞表達(dá)及臨床意義J. 中華血液學(xué)雜志, 2002,5：251253. 4GAZZANIGA P, GRADILONE A, GIULIANI L, et al. Expression and prognostic significance of LIVIN, SURVIVIN and other apoptosisrelated genes in the progression of superficial bladder cancerJ. Ann Oncol, 2003,14

26、(1): 8590. 5ASHHAB Y, ALIAN A, POLLIACK A, et al. Two splicing variants of a new inhibitor of apoptosis gene with different biological properties and tissue distribution pattern J. FEBS Lett, 2001,495(12):5660. 6LIN J H, DENG G, HUANG Q, et al. KIAP, a novel member of the inhibitor of apoptosis prot

27、ein familyJ. Biochem Biophys Res Commun, 2000,279(3):820831. 7SCHMOLLINGER J C, VONDERHEIDE R H, HOAR K M, et al. Melanoma inhibitor of apoptosis protein (MLIAP) is a target for immunemediated tumor destruction J. Proc Natl Acad Sic USA, 2003,100(6):33983403. 8張之南,沈悌. 血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)M. 3版. 北京：科學(xué)出版社, 2008：219228. 9周曉彬,紀(jì)新強,徐莉. 醫(yī)用統(tǒng)計學(xué)軟件PPMS 1.5的組成和應(yīng)用特點J. 齊魯醫(yī)學(xué)雜志, 2009,24(1): 2932. 10MA L, HUANG Y,