1、實驗十二實驗十二 血清肌酸激酶測定與應用血清肌酸激酶測定與應用1 1 實驗目的實驗目的 了解血清肌酸磷酸激酶測定的方法。了解血清肌酸磷酸激酶測定的方法。 掌握其測定的應用與意義。掌握其測定的應用與意義。2 2 實驗原理實驗原理肌酸激酶（肌酸激酶（Creatine phosphokinaseCreatine phosphokinase，簡稱，簡稱CKCK）廣泛存在于骨骼肌、心肌和腦組織中，肝臟和紅廣泛存在于骨骼肌、心肌和腦組織中，肝臟和紅細胞等不含此酶。骨骼肌中含量最豐富，占全身細胞等不含此酶。骨骼肌中含量最豐富，占全身總量的總量的96%96%之多。之多。肌酸磷酸激酶在肌肉收縮中很重要，它催化下

2、列肌酸磷酸激酶在肌肉收縮中很重要，它催化下列反應：反應：上述反應保證肌肉收縮時的能量供應和運動后上述反應保證肌肉收縮時的能量供應和運動后ATPATP和肌酸磷和肌酸磷酸的再合成。正常人血清中肌酸磷酸激酶主要由骨骼肌和酸的再合成。正常人血清中肌酸磷酸激酶主要由骨骼肌和心肌細胞透過細胞膜進入血液的結果，其活力很小。正常心肌細胞透過細胞膜進入血液的結果，其活力很小。正常值每升血液中值每升血液中100100活力單位以下。活力單位以下。運動訓練能使血清肌酸酸磷酸活性升高。其原因一般認為運動訓練能使血清肌酸酸磷酸活性升高。其原因一般認為運動時缺氧運動時缺氧, , 代謝產(chǎn)物積累，供能相對不足等原因，引起代謝產(chǎn)

3、物積累，供能相對不足等原因，引起肌細胞膜通透性升高。或肌細胞膜受到損傷，促使肌細胞膜通透性升高。或肌細胞膜受到損傷，促使CKCK從細從細胞內釋放增加，進入血液循環(huán)，其中以肌肉牽拉的機械性胞內釋放增加，進入血液循環(huán)，其中以肌肉牽拉的機械性損傷或產(chǎn)生血腫等原因最為重要。損傷或產(chǎn)生血腫等原因最為重要。 滑雪運動和馬拉松賽跑后，血清滑雪運動和馬拉松賽跑后，血清CKCK的活性較高，特別是大的活性較高，特別是大強度的馬拉松賽跑最高。在運動后強度的馬拉松賽跑最高。在運動后4 4小時升高，小時升高，8-168-16小時小時達最高值。跳躍、短跑等短時間激烈運動，沖擊性運動，達最高值。跳躍、短跑等短時間激烈運動，

4、沖擊性運動，也易引起也易引起CKCK活性升高。大運動量的訓練和活性升高。大運動量的訓練和100m100m、200m200m跑比跑比賽后，血清中賽后，血清中CKCK活性都顯著升高，尤其是在比賽時，升高活性都顯著升高，尤其是在比賽時，升高更為顯著。更為顯著。應用肌酸磷酸激酶來作機能評定時，一般認為應用肌酸磷酸激酶來作機能評定時，一般認為2-32-3天取血天取血測定一次測定一次, , 在負荷后經(jīng)常處于在負荷后經(jīng)常處于100-200100-200國際活力單位國際活力單位/L/L。如果超過如果超過200200IU/LIU/L，就是運動量過大，身體尚未恢復，此，就是運動量過大，身體尚未恢復，此時應調整運動

5、量。時應調整運動量。3 3 實驗器材與試劑實驗器材與試劑 器材器材 器材器材 試管、分光光度計、分析天平、采血試管、分光光度計、分析天平、采血裝置（注射器）、水浴箱、離心機裝置（注射器）、水浴箱、離心機 試劑試劑 混合底物混合底物pH 7.4 pH 7.4 三羥甲基氨基甲烷三羥甲基氨基甲烷- -鹽酸緩沖液：稱取三羥甲基氨基鹽酸緩沖液：稱取三羥甲基氨基甲烷（甲烷（TrisTris）2.4g2.4g，加蒸餾水至，加蒸餾水至100 ml100 ml，再加入，再加入0.2 N0.2 N鹽酸鹽酸88.8 ml88.8 ml及無水硫酸鎂及無水硫酸鎂0.34g0.34g，調節(jié)，調節(jié)pHpH至至7.47.4。

6、此液在室溫下。此液在室溫下可保存數(shù)月。可保存數(shù)月。0.012 M0.012 M磷酸肌酸溶液：稱取磷酸肌酸鈉（磷酸肌酸溶液：稱取磷酸肌酸鈉（C C4 4H H8 8O O5 5- -O O4 4PNaPNa3 36H6H2 2O O）4 436 mg36 mg，加蒸餾水至，加蒸餾水至100 ml100 ml，調節(jié)，調節(jié)PHPH至至7.47.4，保存于保存于-25-25或普通冰箱上層冰盒中，可用一個月左右。或普通冰箱上層冰盒中，可用一個月左右。0.001 M ADP0.001 M ADP溶液：稱取溶液：稱取ADPADP鈉鹽鈉鹽0.233g0.233g，加蒸餾水至，加蒸餾水至100 ml100 ml

7、，調節(jié)調節(jié)PHPH至至7.47.4，保存于，保存于-25-25或冰箱上層冰盒中，可用一個月或冰箱上層冰盒中，可用一個月左右。左右。臨用前，取上述（臨用前，取上述（1 1）（）（2 2）（）（3 3）試劑各）試劑各10 ml10 ml混合。混合。在此混合底物液在此混合底物液30 ml30 ml中，加入鹽酸半胱氨酸中，加入鹽酸半胱氨酸0.105g0.105g，調節(jié)，調節(jié)PHPH至至7.47.4。此試劑最好新鮮配制，也可以保存于冰盒中。一般可放。此試劑最好新鮮配制，也可以保存于冰盒中。一般可放5-75-7天，若空白管光密度太高，說明有游離肌酸產(chǎn)生，即不能再用。天，若空白管光密度太高，說明有游離肌酸產(chǎn)

8、生，即不能再用。 0.3 N 0.3 N 氫氧化鋇溶液氫氧化鋇溶液 稱取氫氧化鋇（稱取氫氧化鋇（Ba(OH)Ba(OH)2 28H8H2 2O O）4.73g4.73g，加蒸餾水使之溶解，加蒸餾水使之溶解（可加熱助溶），并稀釋到（可加熱助溶），并稀釋到100 ml100 ml。 5% 5% 硫酸鋅溶液硫酸鋅溶液稱取硫酸鋅（稱取硫酸鋅（ZnSOZnSO4 47H7H2 2O O）8.82g8.82g，加蒸餾水溶解，并稀釋到，加蒸餾水溶解，并稀釋到100 100 mlml。上述上述2 2、3 3兩種溶液配好后，需進行滴定，即吸取兩種溶液配好后，需進行滴定，即吸取5%5%硫酸鋅溶液硫酸鋅溶液5 5

9、mlml，放入，放入50 ml50 ml三角燒瓶中，加入酚酞指示劑三角燒瓶中，加入酚酞指示劑2 2滴，用滴，用0.3 N 0.3 N Ba(OH)Ba(OH)2 2溶液滴定至出現(xiàn)粉紅色溶液滴定至出現(xiàn)粉紅色3030秒鐘不褪色為止。秒鐘不褪色為止。 Ba(OH)Ba(OH)2 2用量用量與與ZnSOZnSO4 4相等，如不相等，可稀釋較濃的溶液。相等，如不相等，可稀釋較濃的溶液。標準肌酸溶液（標準肌酸溶液（1.71.7MM/ml/ml） 準確稱取無水肌酸準確稱取無水肌酸22.3mg22.3mg，置于，置于100ml100ml容量瓶中，加蒸容量瓶中，加蒸餾水使之溶解，并稀釋到刻度，置冰箱中保存，可用

10、數(shù)日。餾水使之溶解，并稀釋到刻度，置冰箱中保存，可用數(shù)日。雙乙酰液雙乙酰液 先配成先配成1%1%溶液，置棕色瓶中放冰箱保存。臨用時用蒸餾溶液，置棕色瓶中放冰箱保存。臨用時用蒸餾水稀釋水稀釋2020倍。倍。貯存堿溶液貯存堿溶液 稱取稱取30g 30g NaOHNaOH，無水碳酸鈉（，無水碳酸鈉（Na2CO3Na2CO3）64g64g，加蒸餾水，加蒸餾水使溶解并稀釋至使溶解并稀釋至500 ml500 ml，室溫低時可析出沉淀，此時應放，室溫低時可析出沉淀，此時應放于于3737水浴中待沉淀溶解后再使用。水浴中待沉淀溶解后再使用。-萘酚溶液萘酚溶液 稱取稱取-萘酚萘酚1g1g，用上述貯存堿液使溶解，并

11、稀釋到，用上述貯存堿液使溶解，并稀釋到100 ml100 ml，此液必須新鮮配制，否則空白管光密度讀數(shù)增高。，此液必須新鮮配制，否則空白管光密度讀數(shù)增高。4 4 實驗方法與步驟實驗方法與步驟肌酸磷酸激酶顯色法肌酸磷酸激酶顯色法肌酸磷酸激酶顯色法。肌酸磷酸激酶顯色法。測定測定CKCK活性原理：利用上述反應所生成的肌酸與活性原理：利用上述反應所生成的肌酸與-萘酚萘酚和雙乙酸反應，生成紅色化合物。在一定范圍內，紅色深和雙乙酸反應，生成紅色化合物。在一定范圍內，紅色深淺與肌酸含量成正比，與同樣處理的肌酸標準液比色，求淺與肌酸含量成正比，與同樣處理的肌酸標準液比色，求得酶的活力。得酶的活力。加入物（加入

12、物（mlml）空白管空白管標準管標準管測定管測定管混合底物混合底物0.750.750.750.750.750.75血清血清0.10.1標準肌酸標準肌酸（1.7M/ml1.7M/ml）0.10.1蒸餾水蒸餾水0.10.1 置置3737水浴保溫水浴保溫30 min 30 min Ba(OH)Ba(OH)2 2溶液溶液0.50.50.50.50.50.5ZnSOZnSO4 4溶液溶液0.50.50.50.50.50.5蒸餾水蒸餾水0.50.50.50.50.50.5 混勻，離心混勻，離心5-10 min 5-10 min 測定操作步驟（如下表測定操作步驟（如下表3-143-14）：）： 表表3-14

13、 3-14 單位：單位： mlml上清液上清液1.1.0.50.51.1.0.50.51.1.0.50.5-萘酚溶液萘酚溶液1.1.1 11.1.1 11.1.1 1雙乙酰液雙乙酰液1.1.0.50.51.1.0.50.51.1.0.50.5置置3737水浴保溫水浴保溫15 min 15 min 蒸餾水蒸餾水1.1.3 31.1.3 31.1.3 3離心離心35min35min， 520nm520nm波長處進行比色波長處進行比色 讀取各管的光密度讀取各管的光密度 計算： 肌酸磷酸激酶檢測試劑盒法：肌酸磷酸激酶檢測試劑盒法： 原理原理ATP+ATP+葡萄糖葡萄糖 葡萄糖葡萄糖-6-6-磷酸磷酸+

14、ADP +ADP 為作用酶為作用酶葡萄糖葡萄糖-6-6-磷酸磷酸+NADP+NADP+ + 6- 6-磷酸磷酸- -葡萄糖葡萄糖+NADPH+H+NADPH+H+ + 為作用酶為作用酶 器材與試劑：試管、可見光分光光度計、電子分析天器材與試劑：試管、可見光分光光度計、電子分析天平、采血裝置（注射器）、水浴鍋、離心機、試劑盒測平、采血裝置（注射器）、水浴鍋、離心機、試劑盒測定法。定法。 如：采用中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn)的肌酸磷如：采用中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn)的肌酸磷酸激酶檢測試劑盒，該試劑盒適用于全自動，半自動生酸激酶檢測試劑盒，該試劑盒適用于全自動，半自動生化分析儀及分光光度計

15、測定人血清中化分析儀及分光光度計測定人血清中CKCK的酶活濃度。的酶活濃度。基本參數(shù)：波長：基本參數(shù)：波長：340 nm340 nm，溫度：，溫度：25,30,3725,30,37，比，比色杯光徑：色杯光徑：1cm1cm。試劑試劑主要成分主要成分實驗濃度實驗濃度R1 R1 己糖激酶己糖激酶(HK)(HK)3000 U/L3000 U/L葡萄糖葡萄糖-6-6-磷酸脫氫酶磷酸脫氫酶( G6PDH)( G6PDH)2000 U/L2000 U/LADPADP2 mmol/L2 mmol/LAMPAMP5 mmol/L5 mmol/LAp5AAp5A10 mol/L10 mol/LNADPNADP2

16、mmol/L2 mmol/LNACNAC20 mmol/L20 mmol/L磷酸肌酸磷酸肌酸30 mmol/L30 mmol/LR2R2咪唑緩沖液咪唑緩沖液(pH 6.7(pH 6.7，25)25)100mmol/L100mmol/L葡萄糖葡萄糖20mmol/L20mmol/L原裝試劑雜原裝試劑雜2-8避光保存，有效期避光保存，有效期12個月。復溶后在個月。復溶后在2-8可穩(wěn)定可穩(wěn)定7天，在天，在15-25可穩(wěn)定可穩(wěn)定12小時。小時。試劑盒主要成分與濃度，見表試劑盒主要成分與濃度，見表3-153-15： 表表3-15 3-15 肌酸磷酸激酶檢測試劑盒成分與濃度肌酸磷酸激酶檢測試劑盒成分與濃度加

17、入物（加入物（mlml）空白管空白管樣品管樣品管工作液工作液2.502.500.500.50蒸餾水蒸餾水2.502.50樣品樣品0.500.50混合均勻，在混合均勻，在3737溫育溫育2 2分鐘后，讀取初始吸光度，然后在精分鐘后，讀取初始吸光度，然后在精確確1 1分鐘，分鐘，2 2分鐘，分鐘，3 3分鐘時分別讀取吸光度，確定每分鐘平均分鐘時分別讀取吸光度，確定每分鐘平均吸光度變化吸光度變化A A。表表3-16 3-16 肌酸磷酸激酶檢測試劑盒的操作肌酸磷酸激酶檢測試劑盒的操作 操作步驟：取一定量操作步驟：取一定量R2R2（參看（參看R1R1瓶簽）復溶瓶簽）復溶1 1瓶瓶R1R1，溶解后即為工作

18、液。工作液預先保溫至測試溫度。溶解后即為工作液。工作液預先保溫至測試溫度。 計算：計算： CKCK（U/LU/L）= =（A A樣品樣品/ /分分AA空白空白/ /分）分）F F F=(Vt/Vs F=(Vt/Vs消光系數(shù)消光系數(shù)) ) 1000=80951000=8095（3737） Vt=Vt=反應總體積反應總體積 Vs=Vs=樣品體積樣品體積 NADPHNADPH在在340 nm340 nm波長下毫克分子消光系數(shù)波長下毫克分子消光系數(shù)=6.3=6.3 參考值：男：參考值：男：24-195 U/L24-195 U/L；女：；女：24-170 U/L24-170 U/L 線性上限：線性上限：CKCK活力可達活力可達1500U/L1500U/L（3737） 注意事項：當注意事項：當A/A/分大于分大于0.03600.0360（F=4127F=4127），），0.01900.0190（F=8095F=8095）時，樣品用生理鹽水稀釋后重新測定，）時，樣品用生理鹽水稀釋后重新測定， 結果結果乘以稀釋倍數(shù)；試劑空白吸光度大于乘以稀釋倍數(shù)；試劑空白吸光度大于0.60.6時時, ,勿用；血清勿用；血清CKCK不穩(wěn)定，樣品收集后要盡快分析，在室溫不穩(wěn)定，樣品收集后要盡快分析，在室溫4