1、蛋白質定量的五種方法方法一 雙縮脲法測定蛋白質濃度 目的把握雙縮脲法測定蛋白質濃度的原理和標準曲線的繪制。 原理 雙縮脲(NH2CONHCONH2)在堿性溶液中與硫酸銅反應生成紫紅色化合物，稱為雙縮脲反應，蛋白質分子中含有很多肽鍵(-CONH-)在堿性溶液中也能與Cu2+反應產生紫紅色化合物。在肯定范圍內，其顏色的深淺與蛋白質濃度成正比。因此，可以利用比色法測定蛋白質濃度。 雙縮脲法是測定蛋白質濃度的常用方法之一。操作簡便、快速、受蛋白質種類性質的影響較小，但靈敏度較差，而且特異性不高。除-CONH-有此反應外，-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基團也有此反應。 操作 取中試管7支

2、，按下表操作。 各管混勻、放置37水浴中保溫20分鐘。用540nm比色，以空白管調零點，讀取各管光密度值。 計算 (一)在座標紙上以光密度為縱座標，以蛋白質濃度為橫座標繪制標準曲線。 (二)從標準曲線中查出待測血清樣本的蛋白質濃度(gL)，并求出人血清樣本的蛋白質濃度。 (三)再從標準管中選擇一管與測定管光密度相接近者，求出人血清樣本的蛋白質濃度(gL)。 器材 中試管7支，l毫升刻度吸管3支，10毫升刻度吸管1支，水浴箱，721型分光光度計、坐標紙。 試劑 ()6N NaOH：稱取240g氫氧化鈉溶于1000ml水中。 (二)雙縮脲試劑：稱取CuS04·5H2O 3.0克，酒石酸鉀

3、9.0 克和碘化鉀5.0克，分別溶解后混勻，加6N NaOH l00ml，最終加水至1000ml，貯于棕色瓶中，避光，可長期保存。如有暗紅色沉淀消滅，即不能使用。 (三)0.9NaCl。 (四)蛋白質標準液(10mgm1)，稱取干燥的牛血清蛋白100.0mg，以少量生理鹽水溶解后倒入l0ml容量瓶中，淋洗稱量瓶數次，一并倒入容量瓶中，最終加生理鹽水至刻度線，或用凱氏定氮法測定血清蛋白質含量，然后稀釋成l0mgm1作為蛋白質標準液。 (五)待測血清樣本：將人血清或動物血清用生理鹽水稀釋10倍后再測定。方案二 Folin-酚試劑法(Lowry法)測定蛋白質濃度 目的把握Lowry法測定蛋白質濃度的

4、原理。 原理 蛋白質在堿性溶液中其肽鍵與Cu2+螯合，形成蛋白質一銅復合物，此復合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產生藍色化合物，在肯定條件下，利用藍色深淺與蛋白質濃度的線性關系作標準曲線并測定樣品中蛋白質的濃度。 操作 取試管7支、編號、按下表操作：生理鹽水生理鹽水馬上混勻，在2025水浴保溫30分鐘。用660nm比色，測定光密度值。操作留意事項：1 按挨次添加試劑2 試劑乙在酸性條件下穩定，堿性條件下（試劑甲）易被破壞，因此加試劑乙后要馬上混勻，加一管混勻一管，使試劑乙（磷目酸）在破壞前即被還原。 計算 (一)繪制標準曲線。以濃度為橫坐標，光密度值為縱坐標繪制標準曲線。 (二)以測定管光密度值，查

5、找標準曲線，求出待測血清中蛋白質濃度(gL)。 (三)再從標準管中選擇管與測定管光密度相接近者，求出待測血清中蛋白質濃度(gL)。 器材 (一)721型分光光度計 (-)恒溫水浴箱 (三)中試管7支 (四)刻度吸管：1. 0ml二支；0.5ml一支；5.0ml一支。 試劑 (一)試劑甲 (1)4碳酸鈉(Na2CO3)溶液 (2)0.2N氫氧化鈉溶液 (3)1硫酸銅溶液(CuSO4·5H2O) (4)2酒石酸鉀鈉溶液(或酒石酸鉀或鈉) 在使用前(1)與(2)、(3)與(4)等體積混合，再將兩混合液按50：1比例混合，即為試劑甲。該試劑只能用一天，過期失效。(一)試劑乙： (1)市售酚試

6、劑在使用前用NaOH滴定，以酚肽為指標劑，依據試劑酸度將其稀釋，使最終酸度為1N。 (2)或取Na2WoO42H2O l00g和Na2MOO3 25g。溶于蒸餾水700ml中，再加85 H3PO4 50ml和HCl(濃)100ml，將上物混合后，置1000ml圓底燒瓶中溫存地回流十小時，再加硫酸鋰(Li2SO4H2O)150g，水50ml及溴水數滴。連續沸騰15分鐘后以除去剩余的溴，冷卻后稀釋至1000ml然后過濾，溶液應呈黃色或金黃色(如帶綠色者不能用)，置于棕色瓶中保存，使用時用標準NaOH滴定，以酚酞為指示劑，而后稀釋約一倍，使最終酸度為1N。 (三)標準蛋白質溶液 用結晶牛血清白蛋白，

7、依據其純度用蒸餾水配制成0.25mgml的蛋白質溶液。(純度可經凱氏定氮法測定蛋白質含量而確定)。 (四)待測樣品：精確取血清0.1ml，置于50ml容量瓶中，再加0.9NaCl溶液至刻度，充分混勻，也可以用尿液為樣品。方案三 紫外分光光度法測定蛋白質濃度目的：把握紫外分光光度法測定蛋白質含量的原理，生疏紫外分光光度計的使用。原理 蛋白質分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸。它們具有吸取紫外光的性質，其吸取高峰在280nm波特長，且在此波長內吸取峰的光密度值與其濃度成正比關系，故可作為蛋白質定量測定的依據，但由于各種蛋白質的酪氨酸和色氨酸的含量不同，故要精確定量，必需要有待測蛋白質

8、的純品作為標準來比較，或且已經知道其消光系數作為參考。另外，不少雜質在280nm波長下也有定吸取力量，可能發生干擾。其中尤以核酸(嘌呤和嘧啶堿)的影響更為嚴峻。然而核酸的最大吸取峰是在260nm。因此溶液中同時存在核酸時，必需同時測定OD260nm，與OD280nm。，然后依據兩種波長的吸取度的比值，通過閱歷公式校正，以消退核酸的影響而推算出蛋白質的真實含量。 本法操作簡便快速，且不消耗樣品(可以回收)，多用于純化之蛋白質的微量測定。主要缺點：當待測的蛋白質與標準蛋白質中的酪氨酸和色氨酸含量差異較大時，則產生定誤差，混有核酸時必需分別測定280nm和260nm兩處的OD值，再按公式推算蛋白質含

9、量。操作 取試管7支，按下表操作：0.43.6 各管混勻，盛于石英杯中，用紫外分光光度計，以空白管調整零點，分別于280nm、260nm波長下測定各管光密度，計算(一) 直接依據標準液與待測液的光密度值(OD280nm)，或從標準曲線，求得樣本蛋白質含量。以標準管各管光密度值為縱坐標，以蛋白質濃度為橫坐標繪制標準曲線，然后依據測定管光密度值，直接查標準曲線求得樣本中蛋白質的含量。1 選一種與待測樣本蛋白質氨基酸組成相近似的蛋白質純品，用生理鹽水稀釋至濃度為 lmgm1，作為稀釋標準蛋白質溶液。2用生理鹽水稀釋待測樣本蛋白質至濃度約為lmgm1，即為稀釋樣本蛋白質溶液。(二)利用閱歷公式直接計算

10、樣本蛋白質含量， 精確吸取血清樣本0.1ml，置于50ml容量瓶中，用生理鹽水稀釋至刻度，即500倍稀釋，在280nm和260nm兩處波長分別測得光密度值、再按下列公式計算。 1、OD2800D2601.5時，用Lowry-Kalokar公式： 樣本蛋白質含量(mgm1)1.45OD280一0.74OD2602、OD280OD2601.5時，用Lamber-Beer定律計算：樣本蛋白質含量(mgm1) = OD280K×L（OD2806.3×1）×10gL本試驗樣品：牛血清白蛋白E1%cm6.3（100mlcm.g）K：克分子消光系數；E1%cm：百分比吸光度的吸

11、光系數；注：不同蛋白質中的酪氨酸和色氨酸含量有差異，故標準管與測定管的蛋白質氨基酸組成應相像，以減小誤差。器材 (一)UV-9200紫外分光光度計 (二)50ml容量瓶試劑(一) 生理鹽水(二) 清蛋白(人或牛)純晶(三) 待測樣本蛋白質：用雙縮脲法測定蛋白質的樣品用生理鹽水稀釋而成。方案四 考馬斯（Comessie)亮蘭結合法測定蛋白質濃度 考馬斯亮蘭結合法是近年來進展起來的蛋白質定量測定法。本方法具有操作便利、快速、干擾因素少的特點。 【原理】 考馬斯亮蘭能與蛋白質的疏水微區相結合，這種結合具有高敏感性，考馬斯亮蘭G-250 的最大光吸取峰在465nm，當它與蛋白質結合形成復合物時，其最大

12、吸取峰轉變為595nm。考馬斯亮蘭G250-蛋白質定量測定的高敏性度。 在肯定范圍內，考馬斯亮蘭G250-蛋白質復合物呈青色。在595nm下，光密度與蛋白質 含量呈線性關系。故可以用于蛋白質含量的測定。 【操作】(常量法) (一)標準曲線制備： 配制lmgml的標準蛋白溶液。制備系列稀釋液，其濃度分別為1000gml，500gml， 250gml，125gml ，62.5gml和31.25gml。按下表操作： 搖勻，室溫靜置3分鐘。在第一管為對比管，在721型分光光度計于波長595nm處比色-讀取光密度。以各管光密度為縱座標，各標準樣品濃度(gml)作為橫座標作圖得標準曲線。 (二)未知樣品測

13、定： 取血清0.25ml直接置于50ml容量瓶中，加生理鹽水至刻度，搖勻。(此法樣品稀釋200倍)。取試管二只，按下表操作：搖勻，靜置3分鐘，在721型分光光度計亡波長595nm比色，讀取光密度，查標準曲線，求得稀釋樣品蛋白質濃度。【計算】 未知樣品蛋白質濃度gml稀釋樣品濃度×稀釋倍數 【優缺點】 ()操作簡便、快速；檢測靈敏；重復性好。 (二)顯色快速。約于2分鐘內完成染料與蛋白質的結合。所現顏色至少在l小時內是穩定的。 (三)與改良Lowry氏法相比，干擾物質較少。 (四)當樣品中存在較大量的十二烷磺酸鈉(SDS)、TritonX-100等去垢劑時，顯色反應會受到干擾。如樣品緩

14、沖液呈強堿性時也會影響顯色，故必需預先處理樣品。 (五)考馬斯亮蘭G250染液不宜久存，以1-2月為宜。 (六)微量法測定蛋白含量范圍為1-10g；常量法測以檢測范圍10-100g為宜。 【器材】 (一)試管l0支 (二)吸管10ml、l5ml、lml、O.1ml各1支。 （三）721分光光度法，一般比色杯4只。 【試劑】 (一)O.9NaCl (二)待測血清 (三)標準血清 (四)染液：考馬斯亮蘭G250 0.1克溶于0.5 m1 95%乙醇。再加入100m1 85(WV)磷酸。然后加蒸餾水定容到1000ml。此時溶液為0.0l考馬斯亮蘭G2504.7(WV)乙醇8.5%(WV)磷酸。方案五

15、 BCA法測定蛋白質濃度【目的】：把握BCA法測定蛋白質濃度的原理。【原理】： BCA(bicinchonininc acid)與二價銅離子的硫酸銅等其他試劑組成的試劑，混合一起即成為蘋果綠，即BCA工作試劑。在堿性條件下，BCA與蛋白質結合時，蛋白質將Cu2+還原為Cu+，一個Cu+螯合二個BCA分子，工作試劑由原來的蘋果綠形成紫色復合物，最大光吸取強度與蛋白質濃度成正比。【操作】標準曲線的繪制：取試管七支、編號【計算】（一）        繪制標準曲線。（二）     &

16、#160;  以測定管吸光度值，查找標準曲線，求出待測血清中蛋白質濃度(g/L)。（三）        再從標準管中選擇一管與測定管光密度相接近者，求出待測血清中蛋白質濃度(g/L)。【優缺點】(一) 操作簡潔，快速，45分鐘內完成測定，比經典的Lowary法快4倍且更加便利；(二) 精確靈敏，試劑穩定性好，BCA試劑的蛋白質測定范圍是20-200g/ml，微量BCA測定范圍在0.5-10g/ml。(三) 經濟有用，除試管外，測定可在微板孔中就進行，大大節省樣品和試劑用量；(四) 抗試劑干擾力量比較強，如去垢劑，尿素等均無影響。【器材】（一）   7220型分光光度計（二）   恒溫水浴箱（三）   中試管7支（四）   槍式移液管【試劑】1、 試劑A：1BCA二鈉鹽 2無水碳酸鈉 0.16%酒石酸鈉 0.4氫氧