1、獸用化學原料藥制備和結構確證研究技術指導原則 （獸藥研究技術指導原則之2） 來源 中國獸藥監察所 中國獸藥信息網 編輯 南寧獸藥科技網Dongy 2010-9-51 獸用化學原料藥制備研究技術指導原則1-1概述獸用化學原料藥的制備是獸藥研究和開發的基礎，是獸藥研發的起始階段，其主要目的是為獸藥研發過程中藥理毒理研究、制劑研究、臨床研究提供合格的原料藥，為質量研究提供詳細的信息，為工業化生產提供穩定、可行的生產工藝，為上市獸藥的生產提供符合要求的原料藥。本指導原則是一個通用的原則，適用于經化學全合成或半合成以及從動、植物中提取的獸用原料藥的研制，包括新獸藥、進口獸藥和已有國家標準的獸藥，經微生物

2、發酵得到的獸藥也可參考該指導原則的要求。因此本指導原則只是給予獸藥研發者原料藥制備研究中應關注的基本問題，可根據原料藥研發的實際情況，采用其他更有效的方法和手段，但是必須符合獸藥研發的規律，能夠科學、合理地解釋和處理獸藥研發中的問題。1-2 原料藥制備研究的一般過程原料藥制備研發過程一般包括以下六個階段：確定目標化合物：通過文獻調研、藥效學篩選實驗或其它有關基礎研究工作，確定所需要進行研發的化合物。設計合成路線：根據目標化合物的結構特性，參考國內外相關文獻，綜合分析，確定一條工藝簡單、成本合理、收率相對較高、終產品易于純化的合成路線。制備目標化合物：通過化學反應、生物發酵或其他方法制備出質量符

3、合要求的目標化合物，為產品進行結構確證、質量控制等藥學方面的研究，以及藥理毒理研究和臨床研究提供合格的樣品。結構確證：經過物理或化學的方法，準確無誤地確證目標化合物的結構（包含立體結構）（參考原料藥結構確證研究的技術指導原則）。工藝優化：綜合考慮工藝路線的反應條件、環保情況、產品精制與純化的可行性、原材料獲得的難易程度等對生產工藝進行優化。中試放大研究、工業化生產：通過對中試、工業化生產工藝路線的研究，確定穩定、可行的工藝，為獸藥的制劑生產提供符合要求的原料藥。1-3 原料藥制備研究的一般內容1-3-1工藝的選擇制備工藝選擇的目的是通過對擬合成的目標化合物的文獻調研，設計或選擇合理的合成路線；

4、對所選擇的路線進行初步分析，對該化合物的國內外研究情況、知識產權狀況有一個總體的認識；對所采用的工藝有一個初步的評價，也為獸藥的評價提供可靠依據，這個階段是原料藥制備工藝研究的必然階段。對于新的化學實體，根據其結構特征，綜合考慮起始原料獲得的難易程度、合成步驟的長短、收率的高低以及反應的后處理、反應條件是否符合工業生產、環保要求等因素后，確定合理的合成路線；或者根據國內外對類似結構化合物的文獻報道，進行綜合分析，確定適宜的合成方法。對于通過微生物發酵獲得的原料藥或者從動、植物中提取獲得的原料藥，經對原材料和工藝過程的可控性分析，綜合考慮成本、環保情況等，確定一條可以確保產品質量可控、收率較高的

5、工藝路線。對于結構已知的獸藥，通過文獻調研，對有關該獸藥制備的研究情況有一個全面的了解；對所選擇的路線從收率、成本、“三廢”處理、起始原料是否易得、是否適合工業化生產等方面進行綜合分析，選擇相對合理的合成路線。若所選擇的路線為創新路線，通過對現有的路線進行分析，與文獻報道路線進行比較，說明采用該路線的理由；若使用文獻報道的路線，也要對文獻報道路線進行全面的比較、分析，這樣有利于研發者對此路線有較深入的理解和認識。1-3-2 起始原料、試劑的選擇原則主要分為起始原料的選擇，溶劑、試劑的選擇，內控標準等三部分。起始原料的選擇：起始原料應質量穩定、可控，應有來源、標準和供貨商的檢驗報告，必要時應根據

6、合成工藝的要求建立內控標準。對由起始原料引入的雜質、異構體，必要時應進行相關的研究并提供質量控制方法，對具有手性中心的起始原料，應制訂作為雜質的對映體異構體或非對映異構體的限度，同時應對該起始原料在制備過程中可能引入的雜質有一定的了解。溶劑、試劑的選擇：一般來說應選擇毒性較低的試劑；有機溶劑的選擇一般避免使用一類溶劑，控制使用二類溶劑，同時應對所用試劑、溶劑的毒性進行說明，這樣有利于在生產過程中進行控制，也有利于勞動保護。有機溶劑選擇的詳細內容請參閱化學獸藥有機溶劑殘留量研究的技術指導原則。內控標準：在獸藥的制備工藝中，起始原料、試劑可能存在著某些雜質，若在反應過程中無法將其去除或者參與了副反

7、應，對終產品的質量有一定的影響，因此需要制定相應的內控標準對其進行控制。一般要求對產品質量有一定影響的起始原料、試劑制訂內控標準，同時還應注意在工藝優化和中試放大過程中起始原料和重要試劑規格的改變對產品質量的影響。一般來說內控標準應重點考慮以下幾個方面：（1）對名稱、化學結構、理化性質要有清楚的描述；（2）要有具體的來源，包括生產廠家和簡單的制備工藝；（3）提供證明其含量的數據，對所含雜質情況（包含有毒溶劑）進行定量或定性的描述；（4）如果需要采用起始原料或試劑進行特殊反應，對其質量應有特別的要求，如：對于必須在干燥條件下進行的反應，需要對起始原料或試劑中的水分含量進行嚴格的要求和控制；若起始

8、原料為手性化合物，需要對對映異構體或非對映異構體的限度有一定的要求；（5）對于不符合內控標準的起始原料或試劑，應對其精制方法進行研究，這樣有利于對工藝和終產品的質量進行控制。通常，在工藝路線穩定的條件下，所采用的起始原料、試劑的質量也應相對穩定。1-3-3 工藝數據的積累： 在獸藥研發過程中，原料藥的制備工藝研究是一個不斷探索和完善的動態過程，獸藥研發者需要對制備工藝不斷地進行試驗，反復進行優化，以達到獲得一個可行、穩定、收率較高、成本合理并適合工業化生產的工藝路線。在這個重復完善的過程中，積累充足的實驗數據對判斷工藝路線的可行性、穩定性具有重要意義，同時也可以為質量研究提供有關信息

9、。因此，在獸藥研發過程中，研發者應積極主動收集有關的工藝研究數據，并盡可能提供充分的原料藥制備數據的報告，并對此進行科學的分析，作出合理的結論，充分的數據報告也將有利于藥品評價者對原料藥制備工藝的評價，需要說明的是，數據的積累貫穿獸藥研發的整個過程。工藝數據的報告一般從以下幾個方面考慮：對工藝有重要影響的參數、投料量、產品收率及質量檢驗結果（包括外觀、熔點、沸點、比旋度、晶型、結晶水、有關物質、異構體、含量等），并說明樣品的批號、生產日期、制備地點。工藝數據報告一般分為臨床研究和生產研究兩個階段，可采用表格的形式進行匯總，參考式樣見附件。1-3-4 中間體的研究及質量控制在原料藥制備研究的過程

10、中，中間體的研究和質量控制是不可缺少的部分，其結果對原料藥制備工藝的穩定具有重要意義，也可以為原料藥的質量研究提供重要信息，同時也可以為結構確證研究提供的重要依據，對中間體結構進行確證，可以為終產品的結構確證起輔助作用（詳見原料藥結構確證研究的技術指導原則）。一般來說，由于關鍵中間體對終產品的質量和安全性有一定的影響，因此對其質量進行控制有較大意義。對于新結構中間體，由于沒有文獻報道，因此其結構研究對于認知該化合物的特性、判斷工藝的可行性和對終產品的結構確證具有重要作用。對關鍵中間體、新結構中間體質量進行控制，對工藝的穩定性、終產品的質量研究具有重要的意義。對于一般中間體的質量要求可相對簡單，

11、對其質量可以進行定量控制。有時，因終產品結構確證研究的需要，有必要對已知結構中間體的結構進行研究。1-3-4-1 已知結構的關鍵中間體一般情況下應對其理化常數、質量（定性、定量）進行研究，根據結構確證研究的需要，提供相應的結構研究資料。理化常數研究一般應包括：熔點、沸點、比旋度、溶解性等，并與文獻報道的有關數據進行比較。質量控制一般包括：性狀、異構體（對于具有立體異構的化合物）、有關物質、含量等。結構研究：如果因終產品結構確證的需要，應對其結構進行確證，并應與有關的文獻資料進行比較。1-3-4-2 新結構的中間體一般情況下應對其結構進行確證，并對理化常數、質量控制（定性、定量）進行研究。結構研

12、究：一般來說應進行紅外、紫外、核磁共振（碳譜、氫譜，必要時進行二維相關譜研究）和質譜（包括高分辨質譜）等的研究，以確證該中間體的結構。理化常數研究一般包括：熔點、沸點、比旋度、溶解性等。質量研究一般包括：性狀、異構體（對于具有立體異構的化合物）、有關物質、含量等。1-3-4-3 已知結構的一般中間體一般情況下應對其理化常數進行研究，并與文獻資料進行比較，同時還應對其質量進行研究，并根據結構確證研究的需要，提供相應的結構研究資料。理化常數研究一般包括：熔點、沸點、比旋度、溶解性等。質量研究一般包括：采用TLC、HPLC 、GC 等方法，對其在反應過程中進行定量或定性控制。結構研究：如果由于終產品

13、結構確證研究的需要，應對其結構進行確證，并應與有關的文獻資料進行比較。1-3-4-4 中間體的再精制對于不符合標準的中間體，應對其再精制的方法進行研究。1-3-4-5 工藝的優化與中試放大在原料藥的工藝研究中，工藝的優化與中試放大是原料藥制備從實驗室階段過渡到工業化階段不可缺少的環節，也是該工藝能否工業化的關鍵，同時對評價工藝路線的可行性、穩定性具有重要的意義。原料藥制備工藝優化與中試放大的主要任務是：（1）考核實驗室提供的工藝路線在工藝條件、設備、原材料等方面是否有特殊的要求，是否適合工業化生產；（2）確定所用起始原料、試劑或有機溶劑的規格或標準；（3）驗證小試工藝是否成熟合理，主要經濟指標

14、是否接近生產要求；（4）進一步考核和完善工藝條件，對每一步反應和單元操作均應取得基本穩定的數據；（5）根據中試研究資料制訂或修訂中間體和成品的質量標準、分析方法；（6）根據原材料、動力消耗和工時等進行初步的技術經濟指標核算；（7）提出“三廢”的處理方案；（8）提出整個合成路線的工藝流程，各個單元操作的工藝規程。一般來說，中試所采用的原料、試劑的規格應與工業化生產時一致。通過動、植物中提取的有效單體、通過微生物發酵得到的原料藥的實驗室研究、中試與合成獸藥基本相似，僅用提取、分離、純化等工序代替各步化學反應。在工藝優化和放大過程中，中試規模的工藝在獸藥評價中具有非常重要的意義，該階段是連接實驗室研

15、究和工業化生產的重要部分，是評價原料藥制備工藝可行性、真實性的關鍵，是質量研究的基礎，獸藥研發者應特別重視原料藥的中試放大研究，需要說明的是中試規模工藝的設備、流程應與工業化生產一致。原料藥的中試的規模問題一直存在爭議，主要是因為不同獸藥規模的要求應該是不同的。應根據不同獸藥（創新獸藥、發酵獸藥、提取獸藥以及劑量較小的獸藥等）的特點，可分別采用下述之一為中試規模的要求：（a）單劑量的10000 倍以上；（b）終產品達到公斤級；（c）單元反應器體積不小于20 升。一般來說，對于創新獸藥、劑量較小的獸藥（如：單劑量為微克級的獸藥）可采用（a）的要求；對于發酵、提取的獸藥可采用（b）的要求；一般的合

16、成獸藥可采用（b）或（c）的要求。原料藥的工藝優化過程是一個動態的過程，隨著工藝路線的不斷優化，反應條件、所使用的起始原料、試劑或溶劑的規格等會發生改變，研發者應注意這些改變對產品的晶型或者質量的影響，因此應對重要的變化，如：所使用的起始原料、關鍵試劑的種類或規格、重要的反應條件、產品的精制方法等發生改變前后對產品晶型的影響以及可能引入新的雜質情況進行說明，并對變化前后產品的質量進行比較。1-3-4-6 雜質的分析原料藥制備過程中產生的雜質是原料藥雜質的主要來源，該方面的工作是質量研究的基礎。通過對工藝過程中產生的雜質進行詳細的研究、分析，獸藥研發者可以對工藝過程中產生的雜質有一個全面的認識，

17、為終產品的質量研究可以提供十分有用的信息。需要說明的是，這里所述的雜質是指原料藥制備過程中由于副反應產生的雜質、所用的起始原料引入的雜質以及有機溶劑等，不包括降解產物。雜質的研究可參閱獸用化學藥物雜質研究的技術指導原則。制備過程中產生的雜質一般要從以下幾個方面考慮：起始原料引入的雜質；副反應產生的雜質；異構體；殘留溶劑、試劑、中間體；痕跡量的催化劑；無機雜質。1-3-4-7 “三廢”處理在原料藥制備研究的過程中，“三廢”的處理應符合國家對環境保護的要求。在工藝研究中需對工藝過程中可能產生的“三廢”問題進行考慮，盡可能避免使用有毒、污染環境的溶劑或試劑，在確定合成路線時盡可能避免采用可能會對環境

18、造成污染的路線，并需要結合生產工藝制訂合理的“三廢”處理方案。1-1-3-8 工藝的綜合分析在原料藥制備研究的過程中，工藝的綜合分析也是一個重要的方面，通過綜合分析可以使獸藥研發者對整個工藝的利弊有一個明確的認識，同時也有利于藥品評價工作。獸藥研發者在以上研究的基礎上，經對實驗室工藝、中試工藝、工業化生產工藝這三個階段的深入研究，應對整個工藝有一個全面的認識，對原料藥的制備工藝從工藝路線、反應條件、產品質量、經濟效益、環境保護、勞動保護等方面進行綜合評價。1-4 名詞解釋起始原料: 起始原料是指穩定的、批量生產的化合物，其質量應是可控的。中間體：在原料藥化學合成中產生的、需要進一步的結構改造才

19、能生成原料藥的化合物。關鍵中間體：對終產品的質量或安全性有影響的物質，其中也包括對產品質量、安全性有影響的試劑或起始原料。已知結構中間體：是指已有文獻報道的中間體。新結構中間體：是指尚沒有文獻報道的中間體。試劑：一種與起始物或溶劑不同的物質，在原料藥的制備中使用。溶劑：在原料藥制備中用于制備溶液或混懸液的無機或有機液體。雜質：是在合成或發酵工藝中由于原料、試劑、溶劑或副反應引入的與終產品結構不一樣的任何一種成分。內控標準：是指根據工藝路線的要求，生產企業或研發單位制訂的某一化合物的質量控制標準。1-5 參考文獻1 ICH Q3a Impurities In New Drug Substance

20、s2 FDA Guidance for Industry Drug Product Chemistry，Manufacturing，and Controls Information3 EMEA Note For Guidance On Chemistry of The New Active Substance4化學藥物原料藥制備研究的技術指導原則2 獸用化學原料藥結構確證研究技術指導原則2-1 原料藥結構確證的一般過程結構確證的一般過程：根據化合物的結構特征制訂科學、合理、可行的結構確證研究方案，制備符合研究要求的樣品，進行有關的研究，對各個研究結果進行綜合分析，確證測試品的結構（包括立體結構

21、）。主要包括了藥物的命名，理化常數研究，樣品的制備，樣品的測試，常用的分析測試方法有紫外可見吸收光譜（簡稱：紫外光譜）（Ultraviolet-Visible Absorption Spectra ，UV）、紅外吸收光譜（Infrared Absorption Spectrum，IR）、核磁共振譜（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）、質譜（Mass Spectrum，MS）、比旋度（D）、X-射線單晶衍射（簡稱：單晶X-衍射）（X-ray Single Crystal Diffraction，XRSD）或/和X-射線粉末衍射（簡稱：粉末X-衍射）(X-ray Pow

22、der Diffraction，XRPD)、熱分析法（Differential Scanning Calorimetry，DSC）、熱重（Thermo-Gravimetry，TG）等，同時可根據化合物結構特征而增加其它測試方法，進行綜合解析等。2-2 原料藥結構確證研究的基本內容2-2-1研究方案的制訂獸藥結構千差萬別，制備（獲得）方法也各不相同，因此根據獸藥的自身結構特征和制備（獲得）方法制訂出合理、可行、有效的結構確證方案，才能有效地進行獸藥的結構研究。結構確證的方案應根據獸藥自身的結構特點制訂，以下是對不同結構類型獸藥的測試方案作一簡要概述。一般獸藥：采用常規方法如元素分析（必要時采用高

23、分辨質譜）、UV、IR、NMR、MS、熱分析（差熱或熱重）、粉末X-衍射(XRPD )等即可確證藥物的結構。對于結構比較特殊的獸藥，也可采用制備衍生物的方法間接證明藥物的結構。對于存在順反異構的獸藥，尤其是因順反結構不同而導致獸藥穩定性、理化性質、藥效及安全性等不同的獸藥，在一般結構確證的基礎上，應增加順反結構確證的研究。手性獸藥：除進行上述各項化學結構確證和比旋度測定工作外，還應增加其它有效的測試方法進行研究。單一對映體  其絕對構型（或通過衍生物的構型）確證常用的方法為：比旋度測定、手性柱色譜（Chiral High Pressure Liquid Chromatography

24、和Gas Chromatography ，手性HPLC 和GC）、核磁共振（NMR）、單晶X-衍射（XRSD）以及旋光色散（Optical Rotatory Dispersion，ORD）、圓二色譜（Circular Dichroism，CD）等，其中單晶X-衍射為直接方法，可提供最直接的信息。也可采用間接的方法，如：在說明化合物（獸藥）在反應過程中構型沒有變化的情況下，根據已知的起始原料構型、化學合成方法的立體選擇性以及中間體的結構也可間接獲得終產品（獸藥）的構型信息。獸藥分子中含有多個不對稱因素應對其絕對構型、對映體純度（非對映體純度）進行相關的研究，并盡可能提供更多的構型確證信息。立體異

25、構混合物增補各立體異構體比例的確證研究。對于已有實驗證據或文獻報道不同立體異構體在藥效、藥代或毒理等方面有明顯不同或有相互作用的獸藥，其混合物中各組分的構型確證和比例測定更有必要。外消旋或富集對映體  可通過測定比旋度或采用手性柱色譜（Chiral HPLC、Chiral GC）及核磁共振譜等方法闡明其對映體的比例。不含金屬元素的有機鹽類或復合物：根據結構確證的需要，可提供成鹽前后的兩套波譜和試驗數據。對于某些波譜測定有困難或不易說明獸藥結構的鹽或復合物，測定藥物的有機酸根或有機堿基的波譜，并結合其它試驗項目亦可對其結構確證提供有效的信息。金屬鹽類和絡合物：在進行一般要求的各項測試基

26、礎上，考慮以適當手段反映獸藥中金屬元素的種類、存在形式和含量的確證試驗；不適于或不能測試金屬鹽本身的項目，可考慮以成鹽前的酸分子或配位體的相應測試結果進行佐證。半合成獸藥：分子中母核的結構為已知并在可提供明確證據證明原分子母核結構在半合成全過程中未發生改變的前提下，適當簡化對母核部分結構的確證工作，僅對新引入的基團結構進行確證。多晶型獸藥：在進行一般要求的各項測試基礎上，應以適宜方法獲得獸藥晶型數據。藥物晶型測定常用方法為粉末X-衍射(XRPD)、紅外吸收光譜法、熔點、熱分析、光學顯微鏡等。該類獸藥一般可分為以下幾種情況：創新獸藥：  應進行獸藥在不同結晶條件下（溶劑、溫度、結晶速度

27、等）是否存在多種晶型的研究。已有文獻報道存在多晶型的獸藥  應明確藥物晶型的類型和純度。對于混晶獸藥，應測試其晶型組成（種類、比例），并與文獻數據比較。對于因晶型影響其溶解性、穩定性、生物利用度和活性的獸藥，在無相應藥理、藥效等研究證明該晶型的安全性和有效性時，應確證自制品與國外上市藥用晶型的一致性。含有結晶水或結晶溶劑的獸藥：該類獸藥在進行一般分析時，熱分析研究已經提供了獸藥中的結晶水或結晶溶劑的信息，如果結合干燥失重、水分或單晶X-衍射(XRSD)等方法的測定結果，基本上可以達到對獸藥中結晶水/溶劑以及吸附水/溶劑進行定性、定量的目的。合成多肽獸藥和多糖類獸藥：合成的多肽獸藥&#

28、160; 通過氨基酸分析、質譜測定、序列分析以及肽圖測繪（含有20 個以上的氨基酸殘基獸藥）等實驗可基本獲得合成多肽獸藥的結構信息。獸藥結構中如有半胱氨酸，應明確其狀態（氧化態或還原態），對含有多個半胱氨酸的多肽獸藥，應明確二硫鍵正確連接位點。如各步中間體均進行了質譜測定，可根據相關中間體的結構信息，推測出進行反應的氨基酸的種類。質譜是多肽獸藥結構確證的重要手段，紫外、紅外、核磁共振、多種流動相HPLC、比旋度測定等方法亦可對的結構確證提供幫助。對于多肽獸藥，應對目標物的化學純度和對映體或非對映體純度進行研究。多糖類獸藥  通過對單糖組成、分子量、糖苷鍵連接方法和連接位置等的分析，可

29、獲得多糖類獸藥的基本結構信息。單糖的分離和鑒定可采用紙色譜法、薄層色譜法、高效液相色譜法、氣質聯用等技術；多糖的相對分子量及分子量分布測定可用凝膠色譜等方法。紅外光譜、核磁共振、化學反應后產物的分析等實驗，可幫助確定糖苷鍵的連接方式及糖苷鍵的位置。多組份獸藥  應明確各組份的組成比例，對其主要成分應進行結構確證，具體方法可參照本指導原則的相關要求。其它對于上述未提及的具有特殊結構，需特殊方法進行說明、確證的獸藥：可根據其結構特征，制訂能反映獸藥自身結構特征的方法進行結構研究。2-2-2 測試樣品的要求在結構確證的研究中，供試樣品的純度需要進行一定的控制，只有使用符合要求的供試品進行結

30、構研究，才能獲得獸藥正確的結構信息一般情況下，采用原料藥制備工藝中產品的精制方法對樣品進行精制，并采用質量標準中的方法測其純度、雜質，供試樣品的純度應大于99.0%，雜質含量應小于0.5%。2-2-3 結構確證研究的一般內容2-2-3-1 一般獸藥的結構確證獸藥元素組成  通常采用元素分析法。這種方法可獲得組成獸藥的元素種類及含量，比較測試結果與理論結果差值的大小（一般要求誤差不超過0.3），即可初步判定供試品與目標化合物（獸藥）的分子組成是否一致。對于因獸藥自身結構特征而難于進行元素分析時，在保證高純度情況下可采用高分辨質譜方法獲得獸藥元素組成的相關信息。紫外吸收光譜（UV）

31、60; 通過對獸藥溶液在可見-紫外區域內在不同波長處吸收度的測定和吸收系數（尤其是摩爾吸收系數）的計算，以及對主要吸收譜帶進行歸屬（如K 帶、R 帶、E 帶、B 帶），可獲得獸藥結構中可能含有的發色團、助色團種類以及初步的連接方式等信息，同時對獸藥的鑒別亦有指導意義。對于發色團上存在酸性或堿性基團的獸藥，通過在酸或堿溶液中（常用0.1mol/L HCl溶液或0.1mol/L NaOH溶液）最大吸收波長的測試，觀察其紫移或紅移現象，可為上述酸性或堿性基團的存在提供進一步的支持。紅外吸收光譜（IR）  通過對獸藥進行紅外吸收光譜測試，可推測出獸藥中可能存在的化學鍵、所含的官能團及其初步的

32、連接方式，獲得獸藥可能的幾何構型、晶型、立體構象等信息。固態獸藥紅外測試可分為壓片法、糊狀法、薄膜法，液態獸藥可采用液膜法測試，氣態獸藥則可采用氣體池測定。應注意的是，部分含多晶型的獸藥在研磨和壓片過程中，其晶型也可能發生變化，此時可改用糊法等方法測定。由于糊劑自身有吸收，因此應根據獸藥的結構特點對糊劑的種類進行選擇。另外值得注意的是鹽酸鹽藥物在采用KBr 壓片時可能會發生離子交換現象，應分別對氯化鉀壓片和溴化鉀壓片法測得的結果進行比較，并根據結果選擇適宜的壓片基質核磁共振譜（NMR）  本項測試可獲得獸藥中的組成元素類型、數目、相互連接方式、周圍化學環境、甚至空間排列等信息，進而推

33、測出化合物相應官能團的連接狀況及其初步的結構。常用的有氫核磁共振譜（1H-NMR）和碳核磁共振譜（13C-NMR）等。核磁共振測試的重要參數有：化學位移（）、偶合常數（J 值）、峰形、積分面積等。溶劑峰或部分溶劑中的溶劑化水峰可能會對獸藥部分信號有干擾，因此測試時應選擇適宜的溶劑或方法，以使獸藥所有信號得到充分顯示。氫核磁共振譜（1H-NMR） 該項測試可提供供試品中氫原子數目、周圍化學環境、可能相互間關系、空間排列等信息。此外屬于1H-NMR測試的NOESY或NOE（Nuclear Overhauser Effect）試驗，還可給出某些官能團在分子中位置、優勢構象及構型。氘代實驗可

34、以提供活潑氫的存在以及種類的信息。碳核磁共振譜（13C-NMR）  該項測試可提供供試品中不同碳原子的類型以及所處的化學環境信息，便于對化合物進行初步的結構解析。DEPT（Distortionless Enhancement by Polarization Transfer）譜可進一步明確碳原子屬于伯碳、仲碳、叔碳或季碳。二維核磁共振譜  目前常用的二維核磁共振譜包括1H-1H相關譜、13C-1H相關譜、13C-1H遠程相關譜等。對于結構復雜或用一維NMR方法難以進行結構確證的化合物，進行二維核磁共振譜的測試可更有效地確證獸藥的結構。其它核磁共振譜  對于分子式中

35、含F、P 等元素的獸藥，進行相應的F、P 譜測試，除可提供相應元素的種類、在分子中所處的化學環境等信息外，對獸藥元素組成確定亦有重要的佐證作用。質譜（MS）  用于原子量和分子量的測定、同位素的分析、定性或定量的化學分析，重要參數有分子離子峰、碎片峰、豐度等。分子離子峰是確證獸藥分子式的有力證據，應根據藥物自身結構特性選擇適宜的離子源，同時盡可能地獲得分子離子峰和較多的、可反映出獸藥結構特征的碎片峰。對含有特殊同位素元素（如Cl、Br 等）的獸藥，利用分子離子峰及其同位素峰豐度間的關系，可以判斷獸藥中這些組成元素的種類、數量。高分辨質譜是通過精確測定分子量確定獸藥分子式，但它不能反映

36、獸藥的純度和結晶水、結晶溶劑、殘留溶劑、無機酸根等情況。隨著科學的發展，GC-MS、MS-MS、LC-MS等方法也用于獸藥研究中，研發者應根據獸藥的組成和結構特征選擇適宜的方法。粉末X-衍射（PXRD）  可用于固態單一化合物的鑒別與晶型確定，晶態與非晶態物質的判斷，多種化合物組成的多項（組分）體系中的組分（物相）分析（定性或定量），原料藥（晶型）的穩定性研究等。2-2-3-2 手性獸藥的結構確證手性獸藥的結構（或通過生成其衍生物）確證應在上述一般研究的基礎上，采用特殊手段對其絕對構型進行確證，特別是對于創新獸藥，絕對構型的確定具有非常重要的意義。常用方法為單晶X-衍射（XRSD）、

37、核磁共振譜（NMR）、圓二色譜（CD）、旋光光譜（ORD）以及上述的NOESY 或NOE 差譜（主要適用于具有剛性結構的獸藥）等。其中單晶X衍射（XRSD）為直接方法，后三種為間接方法。單晶X-衍射（XRSD）  可獲得有關獸藥晶型的相關信息、獸藥的相對或絕對構型以及與獸藥以結晶形式存在的水/溶劑及含量等一系列信息。手性獸藥絕對構型的測試，建議采用單晶X 射線四園衍射儀，CuK靶，衍射實驗的角范圍不低于57°。圓二色譜（CD ） 該項測試通過測定光學活性物質（獸藥）在圓偏振光下的Cotton 效應，根據Cotton 效應的符號獲得獸藥結構中發色團周圍環境的立體化學

38、信息，并與一個絕對構型已知的與待測獸藥結構相似化合物（獸藥）的Cotton 效應相比較，即可能推導出待測物（獸藥）的絕對構型。此外對于一般具有剛性結構的環體系的羰基獸藥，通過比較其Cotton 效應的符號并結合經驗規律“八區律”，亦可能預言某些羰基獸藥的絕對構型。旋光光譜 通過比較相關獸藥的旋光性，可得到手性獸藥的相對構型信息。如能得知獸藥旋光的可測范圍，則在一系列反應后，獸藥絕對構型可從用于制備該獸藥的底物構型推導得到。應注意的是，在采用該方法測定獸藥絕對構型時，要在相同的溶劑中以相同的濃度和近乎相同的溫度測定旋光，以保證比較的可靠性。NOESY 或NOE  差譜通過對具

39、有剛性結構（或優勢構象）獸藥官能團上質子的選擇性照射，致使與其相關質子峰強度的增減和相互間偶合作用的消失，從而推測出鄰近官能團的空間構象，進而可獲得獸藥構型的信息。其他方法  例如化學比較法、核磁共振法等。2-3 獸藥晶型的研究在獸藥研發過程中，多晶型現象是普遍存在的，其中有部分獸藥因晶型不同具有不同的生物利用度和/或生物活性，特別是水溶性差的口服固體獸藥。創新獸藥研究中，應對不同結晶條件下（溶劑、溫度、結晶速率等）的晶型進行研究；通過不同晶型對獸藥活性和毒性等影響的研究，可為其臨床應用晶型的選擇提供依據。對于仿制已上市的獸藥，應進行自制獸藥的晶型與已上市獸藥晶型比較的研究，以保證自

40、制品晶型的正確性。進行連續多批樣品晶型一致性的研究，是判斷工藝是否穩定的依據之一。獸藥晶型測定方法通常有粉末X-衍射、紅外光譜、熱分析、熔點、光學顯微鏡法等。粉末X-衍射（XRPD ）  粉末X射線衍射測試是判斷研制獸藥與其對照品晶型是否一致的首選方法。紅外光譜（IR）  某些結構相同但晶型不同的獸藥，它們的紅外光譜在某些區域可能存在一定的差異，因此比較獸藥的紅外光譜，可用于區分獸藥的晶型。但應注意在研磨、壓片的過程中，藥物的晶型可能會改變。熔點（mp） 結構相同但不同晶型的獸藥其熔點可能存在一定的差異，熔點也可以用于晶型研究。熱分析  用于獸藥的物理常

41、數、熔點和沸點的確定，并作為鑒別和純度檢查的方法。晶型不同的獸藥其熱分析圖譜有一定的差異，常用熱分析方法有差示掃描量熱法（DSC）和差熱分析法（DTA）。光學顯微鏡法2-4 獸藥結晶水或結晶溶劑的分析對于含有結晶水或結晶溶劑的獸藥，應對獸藥中的水分/溶劑進行分析。常用分析方法為熱重、差熱分析、干燥失重、水分測定、核磁共振以及單晶X-衍射（XRSD）。熱重  可獲得測試獸藥的吸附水溶劑、結晶水/溶劑及初步的分解溫度等信息，結合差熱分析的信息，還可判斷測試獸藥在熔融時是否分解。差熱分析  該項測試可推測出測試獸藥的吸附水/溶劑、結晶水/溶劑以及熔點、有無多晶型存在和熱焓值等信息

42、。干燥失重  該方法可獲得測試獸藥中結晶水或溶劑、吸附水或溶劑的信息。水分測定  可以獲得測試獸藥中總含水量的信息（吸附水或結晶水）。單晶X-衍射（XRSD）  單晶X-衍射在提供獸藥元素組成、分子量及結構信息的同時，還可提供獸藥中以結晶形式存在的水或溶劑的信息，包括結晶水或溶劑的種類、數量、存在方式等。核磁共振測試 有可能獲得獸藥中含有的部分結晶溶劑的信息。以上分析方法均有各自的優、缺點，在獸藥的結構確證研究中應根據獸藥的結構特征，選擇適宜的方法，同時也可利用不同方法所得結果進行相互補充、佐證，以確定存在于獸藥中水或溶劑的種類、數量和形式。其它具有特殊元素獸藥的

43、結構確證  對于結構中含有金屬離子以及P、F 等元素的獸藥，進行相應金屬原子吸收測定以及F、P 等元素的測定結果，對其結構確證有重要意義。原子發射光譜法、原子吸收分光光度法（ Atomic Emission Spectrophotometry、Atomic Absorption Spectrophotometry，AES 、AAS）可用含有多種金屬離子的獸藥中無機微量元素的含量分析。AES常用于金屬元素的定性研究， AAS 可用于金屬元素的定量研究。絡合金屬離子存在方式的檢測  可采用單晶X-衍射等方法進行檢測。2-5 參考文獻和對照品對結構確證的意義及要求在結構確證研究中

44、，參考文獻和結構確證用對照品對結構確證具有重要的佐證意義，但不是獸藥結構確證研究的必要條件。（1） 參考文獻對結構確證的意義和要求參考文獻對獸藥的結構確證具有重要的佐證作用，所用的參考文獻應引自國內外權威雜志或專利，但應注意的是不同的測試條件所得到的測試結果亦可能有所差異。獸藥不同研發階段的參考文獻對獸藥結構確證所起到的佐證作用可能不同。（2） 對照品對結構確證的意義和要求結構確證用對照品的結構信息對獸藥的結構確證亦具有重要的佐證作用，不同來源的結構確證用對照品對獸藥結構確證的佐證程度不同。對于從制劑中提取、精制所得的結構確證用對照品，如未能驗證在提取過程中晶型是否變化，此結構確證用對照品不能作為晶型測定和與晶型有關的其它圖譜（如IR、粉末X射線衍射）以及理化性質（如熔點、差熱分析、熱重分析）檢測的對照依據。結構確證用對照品和測試樣品應在同一儀器上采用相同的測試條件進行測試，