1、免疫增強(qiáng)劑對新城疫-禽流感二聯(lián)三價滅活疫苗抗體水平影響袁野七李守湖I,李浩鵬2,邢小勇I,溫峰琴1,包世俊I,胡永浩”(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.中牧股份(乾元浩生物股份有限公司)，河南鄭州450000)摘要：本研究旨在通過將不同種免疫增強(qiáng)劑與正常杭原含量及減量抗原含量的新城疫(LaSota株)，禽流感(H5N1亞型Rc-6株、Re-7株)5倍濃縮抗原按一定比例混合，制備成新城疫-禽流感二聯(lián)三價滅活疫苗，分別免疫SPF雞。同時用不加免疫增強(qiáng)劑的新城疫-禽流感二聯(lián)三價滅活疫苗免疫SPF雞作為對照組。結(jié)果表明，通過監(jiān)測雞免疫后不同夭數(shù)的血清抗體水平，經(jīng)方差分析得知相比于

2、對照組的抗體水平，其中添加有盤素多肽、黃斐多糖、灰樹花多襦的疫苗免疫雞后產(chǎn)生的抗體水平均呈顯著提高，而香苑多楝與豬苓多柿則與時照組無顯著性差異。結(jié)果提示，在抗原含量正常或戒量的情況下，去素多肽、黃黃多概、灰樹花多糖能起到抗體增強(qiáng)的效果，使其達(dá)到既能增強(qiáng)抗體又能降低成本的實用效果。關(guān)鍵詞：免疫增強(qiáng)劑；新城疫-禽流感；二聯(lián)三價滅活疫苗；抗體滴度中圖分類號：S858.31文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B文章編號：1672-9692(2015)12-0001-06Studyonimmunostimulantsonnewcastlediseaseandavianinfluenzaaffectedtrivalentinac

3、tivatedvaccineantibodylevelsYuanYe1-2,LiShouhu1,LiHaopeng2,XingXiaoyong1,WenFengqin1,BaoShijun1,HuYonghao1*(1.CollegeofVeterinaryMedicine,GansuAgriculturalUniversity,GansuLanzhou730070;2.ChinaAnimalHusbandryIndustryCO.,LTD/QYHBiotechCompanyLimited),HenanZhengzhou450000)Abstract:Thestudywasdesignedby

4、thedifferenttypesofimmuneenhancerandnorma)antigencontentandthereductionoftheantigencontentofNewcastle(LaSotastrain),avianinfluenzaA(H5N1Re-6strainandRe-7strain)fivetimesconcentratedantigenmixedincertainproportionspreparedNewcastleandavianinfluenzatrivalentinactivatedvaccine,SPFchickenswereimmunized.

5、Atthesametime,asacontrolgroupwithNewcastlediseasewithoutimmuneenhancerandavianinfluenzatrivalentinactivatedvaccineSPFchickens.Theresultsshowedthatthescrumantibodylevelsbydifferentdaysafterimmunizatingmonitoringchicken.Analysisofvariancethatcomparingtotheantibodylevelsbetweenthecontrolgroup,theantibo

6、dylevelsofproducedwithvaccineaddBursinpolypeptides,APSandgrifolanshowedasignificantincrease.However,thegroupwithLent!nanandPUPSwasnosignificantdifferencebetweenthecontrolgroup.TheresultssuggeststhatimmunopotentiatorwithBursinpolypeptides,APSandgrifolancanplayanenhancedeffectoftheantibodyinthecaseofr

7、eductionornormalontheantigencontent,itisalsoenhanceantibodybuttoreducethecostofeconomiceffect.Keywords：Immunostimulants;Newcastleandavianinfluenza;Duplextrivalentinactivatedvaccine;Titerofantibody收日期：2015-11-23作者簡介：袁野(1983-),男，河南鄭州人，博士研究生，主要從事生物制品、藥品的研發(fā)與生產(chǎn).通訊作者:胡永浩(1962-),男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事動物傳染病學(xué)及病原分子生

8、物學(xué)的研究.新城疫（Newcastledisease,D）和禽流感（Avianinfluenza）是危害禽類的重大疾病，其病原分別是新城疫病毒和禽流感病毒，都屬于高度接觸性傳染病，給世界養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失“七目前，新城疫和禽流感的預(yù)防主要是接種疫敝頑,雞新城疫疫苗主要有弱毒疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗、基因工程苗（山，而弱毒疫苗為目前市場上最常見的疫苗。禽流感現(xiàn)階段常見的疫苗為全病推滅活疫苗、亞單位疫苗、核酸疫苗、重組活載體疫苗2。雖然使用常規(guī)疫苗免疫接種可以防制新城疫、禽流感，但在實際情況下常規(guī)單苗存在免疫繁瑣、免疫效果不盡理想、成本高等缺點，針對市場的需求，進(jìn)而研制出既廿約成本乂增強(qiáng)

9、免疫效果的免疫增強(qiáng)劑。免疫增強(qiáng)劑即廣義上的佐劑，都是通過調(diào)動免疫系統(tǒng)的功能，提高機(jī)體的病原微生物的特異性反應(yīng)米發(fā)揮其作用，是治療和預(yù)防疾病的重要物質(zhì)，特別是對疫苗發(fā)揮保護(hù)性作用起獨特的效果，能有效影響免疫反應(yīng)的質(zhì)量（型的控制、財部免疫以及細(xì)胞類型的控制），穩(wěn)定、便宜而旦容易生產(chǎn)和保/fl,0,lo本研究所用到的多種免疫增強(qiáng)劑，涉及小分子多恥類、多糖類等免疫增強(qiáng)劑能顯著提高機(jī)體免疫系統(tǒng)功能，增戲疫苗的免疫效果，減少疾病發(fā)生七探討各種免疫增強(qiáng)劑對雞體感染新城疫，禽流感的免疫調(diào)節(jié)作用，為應(yīng)對新城疫、禽流感能夠認(rèn)到更加理想的免疫預(yù)防奠定了理論依據(jù)。1材料與方法1.1抗原及試驗動物抗原由乾元浩生物股份有

10、限公司鄭州生物藥廠提供,包括新城疫（LaSota株）5倍濃縮抗原HA為11log2,禽流感R7株5倍濃縮抗原HA為10log2,禽流感Re6株5倍濃縮抗原HA為10log。125只SPF雞（28日齡）均由乾元浩生物股份曲限公司鄭州生.物藥廠動物房SPF種蛋孵化。1.2主要試劑及儀器囊素三肽購自上海洵普生物科技有限公刊。黃茂多糖、香菇多糖、豬苓多糖、灰樹花多糖均購自浙江方格藥業(yè)有限公司。注射用II油山法國MARC0L52注射白油提供。硬脂酸鋁購白上海遠(yuǎn)航試劑廣。司本-80和吐溫-80均購自廣東省拳慶山超能實業(yè)有限公司。無菌檢驗培養(yǎng)基由乾元浩牛物股份有限公.（鄭州生物藥廠提供。臺式微型剪切機(jī)TT8

11、型購自德國1KA公。LS900激光顆粒粒度分析儀購自青島歐美克公司。八道移液器購自德國艾本德公司。1.3水相的制備將1組事先配制好的囊素三肽溶液加入事先配置好的水相中：使?jié)舛冗_(dá)到每1000mL疫苗中含囊素三肽10mg,囊素三肽含量達(dá)到1%。將2組黃茂多糖、3組灰樹花多糖、4紐香菇多糖、5組豬苓多糖原粉按一定比例溶于注射用水中制成相對應(yīng)的黃茂多糖、灰樹花多糖、香菇多糖、豬苓多糖溶液加入事先配置好的水相中，使其濃度達(dá)到疫苗總量的3%。1.4油相的制備將注射用白油、司苯-80、硬脂酸鋁按一定比例經(jīng)高壓滅菌混勻制成油相。1.5乳化將配制好的油相先與含有囊素三肽的水相用德國IKAT18型高速剪切機(jī)先進(jìn)行

12、預(yù)乳化，待將水相加入完全后，按一定轉(zhuǎn)速、時間乳化結(jié)束，分裝于100mL瓶中備用動物試驗。分別將預(yù)先配置好的含有黃度多糖的水相、灰樹花多糖水相、豬苓多糖水相、香姑多糖水相溶液經(jīng)高壓火菌后按一缶比例加入5倍濃縮火活抗原充分混勻后，緩緩加入油相，用德國IKAT18型高速剪切機(jī)預(yù)乳，待將水相加入后，按-定轉(zhuǎn)速，時間乳化結(jié)束，分裝于100mL瓶中備用動物試驗。1.6劑型取1清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，應(yīng)呈油滴狀不擴(kuò)散。1.7穩(wěn)定性取lOmL疫苗于離心管中，經(jīng)3500r/min15min,應(yīng)不出現(xiàn)分層現(xiàn)象；疫苗在37C左右條件，放置21d不應(yīng)有破乳現(xiàn)象。1.8黏度用下口內(nèi)徑為1.2mm、上口內(nèi)徑為2

13、.7mni的1mL移液吸管在25C左右的條件下吸取疫苗1mL,令其垂直流出，記滎流出0.4mL所需的時間。1.9顆粒度取5uL疫苗混勻于10mL白油中，置于LS900激光粒度分析儀中檢測。1.10無菌檢驗疫苗抽樣，分別取硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基2支，瓊脂培養(yǎng)基2支，匍萄糖培養(yǎng)基1支，每支接種疫苗0.2mL分別放置于37C、25C培養(yǎng)箱中做無菌檢驗。1.11效力檢驗28日齡SPF雞125只分為12組，每組10只；第15組免疫添加含免疫增強(qiáng)劑及含有正常抗原含量的新城疫-禽流感二聯(lián)三價滅活疫苗0.3mL；第6組免疫添加不含免疫增強(qiáng)劑及含有正常抗原含量的新城疫-禽流感二聯(lián)三價滅活疫苗0.3mL；第711組免疫

14、添加含免疫增強(qiáng)劑及含有1/5正常抗原含量的新城疫-禽流感二聯(lián)三價滅活疫苗0.3mL；第12組免疫添加不含免疫增強(qiáng)劑及含有1/5正常抗原含量的新城疫-禽流感二聯(lián)三價滅活疫苗0.3mL；另取5只作為空白對照。分別在免疫后的第14、21、28天采血收集血清，檢測抗體，經(jīng)spss對各個數(shù)據(jù)的方差分析統(tǒng)計。2結(jié)果2.1檢驗結(jié)果2.1.1疫苗物理性狀及無菌檢檢2.1.2抗體檢測結(jié)果見表1。1疫苗物理性狀及無菌檢驗結(jié)果TablelsterilitytestresultsandphysicalpropertiesofVaccine樣品劑型顏色粘稠度離心37C放28C放25C放顆粒度無曲(25C)結(jié)果置結(jié)果置結(jié)

15、果置結(jié)果(D50,Mm)結(jié)果囊素多肽W/0乳白色1.78不分層不破乳不破乳不破乳1.53無偏黃芷多糖W/0黃福色1.88少量沉淀不破乳不破乳不破乳1.54無偶灰樹花多糖W/0灰黑色1.98少財沉淀不破乳不破乳不破乳1.78無萌香蒞多糖W/0紅掠色1.51少量沉淀不破乳不破乳不破乳1.01無函豬苓多糖W/0紅棕色1.87少量沉淀不破乳不破乳不破乳1.64無兩對照組W/0乳白色1.84不分層不破乳不破乳不破乳1.69無的囊素多肽W/0乳白色1.99不分層不破乳不破乳不破乳1.94無菌黃筷多鞘W/0黃渴色1.45少蟄沉淀不破乳不破乳不破乳1.21無慵灰樹花多精W/0灰黑色1.79少最沉淀不破乳不破乳

16、不破乳2.01無慎香姑多精W/0紅棕色1.81少堂沉淀不破乳不破乳不破乳【.99無曲豬冬多糖W/0紅棕色1.85少量沉淀不破乳不破乳不破乳2.23無筋對照組W/0乳白色1.42不分層不破乳不破乳不破乳0.98無曲2.2數(shù)據(jù)分析2.2.1抗原正常含量的情況下（Re-6株）在14d、21d時相比于對照組的抗體水平，黃芷多糖組與灰樹花多糖組均極顯著提高，囊素多肽組顯著提高，而香姥多糖組與豬苓多糖組則與對照組無顯著性差異。在28d時相比于對照組的抗體水平，囊素多肽組、灰樹花多糖組均極顯著提高，黃茂多糖組顯著提高，香菇多糖組、豬苓多糖組均與對照組無顯著性差異。2.2.2抗原含量為正常含量1/5的精況下（

17、Re-6株）在14d時相比于對照組的抗體水平，囊素多肽組，黃茂多糖組與灰樹花多糖組均極顯著提高，而香菇多糖組與豬苓多糖組姻與對照組無顯著性差異。在21d、28d時相比于對照組的抗體水平，黃芷多糖組與灰樹花多糖組均極顯著提高，囊素多肽組顯著提高，而香菇多糖組與豬苓多糖組則與對照組無顯Table2Analysisc表2免疫后各組的Re-6HI抗體水平方差分析表varianceonRe-6HIantibodycaseofeachgroupafterimmunizating14d21d28d組別Re-6l/5Re-6Re-6l/5Re-6Re-6l/5Re-6K素多肽5.8+1.75*4.82.44”

18、7.91.IO*6.41.78*9.21.148.50.97-黃茂多精6.40.97-5.02.548.20.79-6.5+1.35-8.31.348.l0.99灰樹花多糖6.40.84“5.32.26-8.20.79”7.21.40”9.00.82-8.21.87-香菇多糖4.6+1.072.62.127.Oil.255.4土1.968.00.94-7.91.97豬冬多精4.61.072.22.397.11.455.31.957.61.077.92.88對照組4.81.811.21.997.01.495.4+1.967.71.497.7+1.25注：顯著性水平a=0.05,*表示差異顯著(P

19、V0.05),*表示差異極顯著(PV0.01).表3免疫后各組的Re-7HI抗體水平方菱分析表Table3AnalysisofvarianceonRe-7HIantibodycaseofeachgroupafterimmunizating組別14d21d28dRe-7l/5Re-7Re-7l/5Re-7Re-7l/5Re-7真素多肽5.71.954.7+1.57-8.0l.05-6.51.27-8.80.82”8.61.17-黃花多糖6.30.95-4.72.16-8.40.70“6.40.70”9.30.92-8.70.79-灰樹花多糖6.21.03w5.41.54”8.00.94,7.00

20、.67”9.00.67-8.00.82.香姑多械4.30.822.61.846.91.205.2土1.408.00.497.4+1.07豬琴多糖4.61.072.51.817.i0.745.11.217.70.737.41.96對照組4.8+0.922.51.647.00.675.3+1.067.90.887.51.65注：顯著性水平。=0.05,*表示差異顯著(PV0.05),*表示差異極顯著(PV0.0D.著性差異。2.23在抗原正常含量的情況下(Re-7株)在14d時相比于對照組的抗體水平，黃茂多糖組與灰樹花多糖組均極顯著提高，囊素多肽組顯著提高，而香菇多糖組與豬苓多糖組則與對照組無顯著

21、性差異。在21d時相比于對照組的抗體水平，黃茂多糖極顯著提高，囊素多肽組與灰樹花多糖組均顯著提高,而香菇多糖與豬苓多糖組則與對照組無顯著性差異。在28d時相比于對照組的抗體水平，囊素多肽組、黃佐多糖組與灰樹花多糖組均極顯著提高，而衰4免疫后各組的LaSotaHI抗體情況水平方差分析Table4AnalysisofvarianceonLaSotaHIantibodycaseofeachgroupafterimmunizating組別14d21d28dLaSota1/5LaSotaLaSota1/5LaSotaLaSota1/5LaSota囊素多肢5.90.574.31.64“8.l0.99-6.

22、30.82“9.50.97-7.50.85黃芷多精6.20.79-4.21.75-8.l0.996.20.79-9.l0.887.70.67灰樹花多精6.30.67-4.7+1.70-8.30.95-6.70.67-9.20.63-7.51.35香菇多糖4.2+0.632.62.017.11.104.81.757.90.746.91.29豬苓多糖4.41.172.12.027.31.065.01.417.90.747.32.26對照組4.7+1.421.4L587.3i.165.01.058.21.407.41.20注：顯著性水平a=0.05,*表示差異顯著（PV0.05）,*表示差異極蟲著（

23、P0.01）.香菇多糖組與豬苓多糖組則與對照組無顯著性差異。2.2.4在抗原含量為正常含量1/5的情況下（Re-7株）在14d、21d時相比于對照組的抗體水平，黃茂多糖組與灰樹花多糖組均極顯著提高，囊素多肽組顯著提高，而香菇多糖組與豬苓多糖組則與對照組無顯著性差異。在28d時相比于對照組的抗體水平，囊素多肽組與黃芷多糖組均顯著提高，灰樹花多糖組顯著提高，香菇多糖組與豬苓多糖均無顯著提機(jī)2.2.5在抗原正常含量的情況下（LaSota株）在14d時相比于對照組的抗體水平，囊素多肽組、黃黃多糖組與灰樹花多糖組均極顯著提高，而香菇多糖與豬苓多糖組則與對照組無顯著性差異。在21d時相比于對照組的抗體水平

24、，灰樹花多糖組極顯著提高，囊素多肽組與黃茂多糖組顯著提高，香菇多糖組與豬苓多糖組均無顯著提高；在28d時囊素多肽組、黃黃多糖組與灰樹花多糖組均極顯著提高，而香菇多糖組與豬苓多糖組則與對照組無顯著性差異。2.2.6在抗原含量為正常含量1/5的情況下（LaSota株）在14d、21d時相比于對照組的抗體水平，囊素多肽組、黃茂多糖組與灰樹花多糖組均極顯著提高，而香菇多糖組與豬苓多糖組則與對照組無顯著性差異。在28d時囊素多肽組、黃茂多糖組、灰樹花多糖組、香菇多糖組與豬苓多糖組均無顯著提高。3討論疫苗物理性狀方面，囊素三肽組疫苗的顏色無改變，呈乳白色，無分層現(xiàn)象，黏度、顆粒度也和普通疫苗無明顯差異，但

25、黃茂多糖、灰樹花多糖、香菇多糖、豬苓多糖組疫苗顏色均有不同程度的改變，黏度、顆粒度也有不同程度的增加，并且在高速離心后穩(wěn)定性不理想，并且伴有沉淀析出。相比于對照組的抗體水平，在抗原含量正常情況下，其中，添加有囊素多肽、黃黃多糖、灰樹花多糖的疫苗免疫雞后產(chǎn)生的抗體水平均呈顯著提高，而香菇多糖組與豬苓多糖組則與對照組無顯著性差異。且在抗原含量減最的情況下其中添加有囊素多肽、黃茂多糖、灰樹花多糖的疫苗免疫雞后產(chǎn)生的抗體水平相比于添加香菇多糖、豬苓多糖及未添加免疫增強(qiáng)劑的抗體水平呈顯著提高，使其達(dá)到既能增強(qiáng)抗體又能降低成本的實用效果。綜合以上疫苗物理性狀與抗體水平的分析結(jié)果來看，囊素三肽比較適合做新城

26、疫-禽流感二聯(lián)三價滅活疫苗的免疫增強(qiáng)劑。參考文獻(xiàn)ALEXANDERDJ,ALDOUSEW,FULLERCM.Thelongview:aselectivereviewof40yearsofNewcastlediseaseresearchJ.AvianPathol,2012,41(4):329-335.1 ALEXANDERDJ.NewcastlediseaseintheEuropeanUnion2000to2009J.AvianPathol,2011,40(6):547-558.2 GuoYJ,WangM,KawaokaY,etal.Characterizationofanewavianlike

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