1、westernblot原理及步驟Western blot基本原理：在電場的作用下將電泳分離的多肽從SDS-PAGE凝膠轉移至一種固相支持體, 然后用這種多肽的特異抗體來檢測。Western blot 應用：目的蛋白的表達特性分析；目的蛋白與其他蛋白的互作；目的蛋白的組織定位；目的蛋白的表達量分析；蛋白樣品的制備：1水溶液提取法：稀鹽和緩沖系統的水溶液對蛋白質穩定性好、溶解度大,是提取蛋白質最常用的的溶劑，操作相對麻煩，重復性一般；2有機溶劑提取法；3離心管柱提取法：超快速,易用,高產及重復性強；4通過層析或電洗脫法制備目的蛋白。Western blot注意事頂和常見問題：1我的細胞提取液有的有

2、沉淀，有的很清亮，為什么呢？答：有沉淀可能因為你的蛋白沒有變性完全，可以適當提高SDS濃度,同時將 樣品煮沸時間延長；也不排除你的抗原濃度過高，這時再加入適量上樣緩沖液 即可。2我做的蛋白質分子量很小(10 KD ),請問怎么做WB ?答：可以選擇0.2 pm的膜，同時縮短轉移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再 轉移。3最后顯色時用DAB好還是ECM好？答：DAB有毒，但是比較靈敏，是HRP最敏感的底物;ECM結果容易控制， 但被催化時靈敏度差一點，但如果達到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg級蛋白， 具體可以根據你實驗的情況。4要驗證某個細胞上有無該蛋白的存在需要做免疫組化和western blo

3、t試驗 嗎？做這兩個試驗時的一抗和二抗可以共用嗎？答：免疫組化可以用來進行定位，但是不能精確定量,而且有時會有假陽性， 不易與背景區分；Westernblot可以特異性檢測某個蛋白質分子,進行定量,但是不能定位。兩種實驗的一抗有時候不能通用，公司的產品說明一般都會說明可以進行什么 實驗，在免疫組化時，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。5細胞水平要做western blot r多少細胞提的蛋白夠做western blot ?答：一般5x106就足夠了。6同一樣品能同時提RNA又提蛋白么？這樣對western blot有無影響？答：能，沒有問題。7同一蛋白樣品能同時逬行兩種因子的Western Blo

4、t檢測嗎？答：當然可以，有的甚至可以同時測幾十種樣品。8蛋白變性后可以存放多久？答：-80°C ,兩年沒有問題。最關鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細 菌消化掉（也是被酶水解了）。9二抗是生物素化的抗體,三抗是親和素生物素體系,不知采用這樣的方案后, 封閉液是否要作調整,能否再用5%的脫脂奶粉呢？答：不能使用脫脂奶粉,因為脫脂奶粉中含生物素，用B S A代替應該好一點。10做組織樣品的western的時候,怎樣處理樣品？ 答：必須進行硏磨、勻漿、超聲處理，蛋白質溶解度會更好，離心要充分，膜蛋 白需用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提（超速離心）。還有一 點就是組織中的蛋

5、白酶活性更強，需要注意抑制蛋白酶的活性。11免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？答：免疫組化時抗體識別的是未經變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表 位是線性的，而有的屬于構象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮 后的蛋白都含有；構象型表位由于受蛋白空間結構限制，煮后變性會消失。如果 你所用的抗體識別的是蛋白上連續的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗 體可同時用于免疫組化和Western z而如果抗體識別構象形表位，則只能用于 免疫組化。12在做Western Blot時.PVDF膜用甲醇浸泡的目的？答：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團

6、，使它更容易 跟帶負電的蛋白質結合,做小分子的蛋白轉移時多加甲醇也是這個目的。13檢測同一抗體的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一張膜上嗎？答：可以。14蛋白質的分子量跨度很大,如要分離小21KD ,中至66KD ,大至170KD ,可以一次做好嗎？答：這么廣的分布不好轉移,般建議：21kd和66kd可以一起轉，12%SDS-PAGE z濕轉120mA z 45-60min就可以了 z可以根據你實驗室的經驗調節；170kd 用 7% SDS - PAGE , 200mA 90-120mino15細胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時有什么原則嗎？受不受組織來源的影響？ 胞膜和胞漿有區別嗎？答：一般來說提取

7、時加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時保持低溫。若有 特殊要求可以選擇相應的蛋白酶抑制劑。16 PVDF膜和硝酸膜結合蛋白的原理是什么？答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質相聯，這樣的話,反復 洗幾次后，蛋白容易掉下來，結果較差。PVDF膜主要通過它膜上的正電荷和蛋 白接合，同時也有疏水作用，但相對較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢, 不易脫落，結果較好。17 westernblot內參選擇什么合適？答:這與目標抗原的表達位置有關，對于胞漿和全細胞蛋白，可選擇內參P-actin. GAPDH和Tubulin ;線粒體蛋白則可選擇內參VCDAl/Porin和COXIV ;核

8、內 抗原可以選擇內參Lamin Bl、TBP和histoneo18不能很好地將大分子量蛋白轉移到膜上，轉移效率低？答：轉移緩沖液中加入20%甲醇（終濃度），因為甲醇可降低蛋白質洗脫效率z 但可增加蛋白質和NC膜的結合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量 蛋白質可延長轉移時間；轉移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也能增加轉移效率;使用戊二醛交聯；降低凝膠濃度，如低至6-7%或提高轉膜電壓/電流，增加轉 移時間。19轉膜時凝膠腫脹或卷曲？答：可將凝膠在轉膜前放到轉膜緩沖液中浸泡5-10mino20跑膠的條帶歪斜或者漂移？答：電轉儀長期使用導致海綿變薄，"三明治"結構不緊湊

9、導致，可更換或者在 兩塊海綿之間墊上少許普通的草紙。21轉膜后膜上有單個或多個白點？答：轉膜時確保膜和膠塊之間沒有氣泡。轉膜緩沖液過熱？答：緩沖液中離子濃度太低，電流或者電壓過高，轉膜過程中注意降溫。顯影后膠片背景太高？答：轉膜前PVDF膜沒有用100%甲醇完全浸濕;洗膜不充分，可以增加膜洗滌 次數；封閉不完全,選擇合適的封閉液和提高封閉時間；二抗濃度過高，降低二 抗濃度；_抗特異性不強,換用特異性較強的單克隆抗體；曝光時間過長,減少 曝光時間。24結果沒有條帶或者條帶很淺，雜交信號很弱？答：樣品中不含靶蛋白或者含量太低，可増加蛋白上樣量，設置已知標準量蛋白 的對照；抗體稀釋比例太低,孵育時間不夠；轉膜不好,轉膜后可先用麗春紅染 色觀看染色效果；曝光時間過短，增加曝光時間；抗體保存不當，效價降低。25目的條帶位置偏低或者偏高？答：膠濃度不適合Z高分子量要用低濃度膠，小分子蛋白要用高濃度膠。26有非特異性條帶？ 答：目的蛋白有多個修飾位點（磷酸化位點、糖基化位點、乙酰化位點等），本 身可以呈現多條帶；一抗特異性不好，換用特異性較好的單克隆抗體；二抗非特 異性弓I起的結果,可設立一組不加一抗只加二抗的平行對照來檢測二抗是否有非 特異性結合;樣品蛋白質可能降解，提取蛋白時注意冰上操作，加入適當的蛋白 酶抑制劑，避免樣品反復凍融；抗體濃度過高，降低一抗和二抗的