1、實驗1：大腸桿菌的培養(yǎng)和分離一、教學要求基本要求1進行大腸桿菌的擴增，利用液體培養(yǎng)基進行細菌培養(yǎng)的操作2進行大腸桿菌的分離，用固體平面培養(yǎng)基本進行細菌的劃線培養(yǎng)。 發(fā)展要求說明大腸桿菌培養(yǎng)的條件和實驗原理。說明 二、基本內(nèi)容微生物的實驗室培養(yǎng)培養(yǎng)基無菌技術分離、純化大腸桿菌培養(yǎng)基的配制配制培養(yǎng)基的原則配制培養(yǎng)基的方法計算稱量溶化調(diào)pH分裝加棉塞滅菌倒平板平板劃線法稀釋涂布法系列稀釋平板涂布1培養(yǎng)基的種類和化學成份培養(yǎng)基的種類有很多劃分標準，按物理性質(zhì)分：固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基（加入瓊脂多少）。液體培養(yǎng)基用于擴大培養(yǎng)和工業(yè)生產(chǎn)，固體培養(yǎng)基用于菌種分離，鑒定，計數(shù)（菌落數(shù)量）。培養(yǎng)基的化學成分包括

2、 水 、 無機鹽 、 碳源 、 氮源 、生長因子等。按照微生物的同化作用類型是自養(yǎng)還是異養(yǎng)，碳源不同，自養(yǎng)微生物為無機碳源，如硝化細菌是二氧化碳或碳酸鹽，異養(yǎng)微生物為有機碳源，如大腸桿菌是葡萄糖等有機物。2常見微生物類群原核生物（如細菌大腸桿菌二分裂、革蘭氏陰性、異養(yǎng)兼性厭氧性腸道桿菌、藍藻、支原體、衣原體、放線菌等）、原生生物（草履蟲、變形蟲等）、真菌（酵母菌出芽生殖.異養(yǎng)兼性厭氧性微生物、霉菌、食用菌）、病毒等。細菌是單細胞的原核生物，有細胞壁（肽聚糖）、細胞膜、細胞質(zhì)，無成型的細胞核，只有一環(huán)狀DNA分子（擬核）。以分裂（二分裂）的方式繁殖，分裂速度很快。用革蘭氏染色法將細菌分為革蘭氏陽

3、性菌（革蘭氏染液染色后，再脫色處理，細菌仍保留染色液的顏色）和革蘭氏陰性菌兩大類，區(qū)別在細胞壁的成分不同。大腸桿菌是革蘭氏陰性（細胞壁薄，有莢膜）、兼性厭氧的腸道桿菌。3無菌技術對實驗操作空間、操作者的衣著和手進行清潔和消毒；將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進行滅菌；為避免周圍微生物污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近旁進行；避免已滅菌處理的材料用具與周圍物品相接觸。比較理化因素的作用強度消滅微生物的數(shù)量芽孢和孢子能否被消滅消毒較為溫和部分生活狀態(tài)的微生物不能滅菌強烈全部微生物能滅菌方法：接種環(huán)、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法。玻璃器皿、金屬用具等使用干熱滅菌法，所用器械是干熱滅菌箱。 培養(yǎng)基、

4、無菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋。表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈。4培養(yǎng)基的配制原則目的要明確：根據(jù)培養(yǎng)的微生物種類、培養(yǎng)的目的等確定培養(yǎng)基的類型和配制量。營養(yǎng)要協(xié)調(diào)：培養(yǎng)基中各種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度和比例要適宜。pH要適宜：細菌培養(yǎng)基pH中性或偏堿性，霉菌培養(yǎng)基呈酸性。5實驗操作步驟（1）配制培養(yǎng)基：計算稱量溶化調(diào)pH分裝加棉塞滅菌倒平板（形成斜面是為增大接種面積）。我們一般用LB液體培養(yǎng)基來擴大培養(yǎng)大腸桿菌，培養(yǎng)后可在LB固體培養(yǎng)基上劃線分離。以下為本實驗中培養(yǎng)基配置步驟： 稱量：準確稱取各成分。蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化鈉0.5g，加

5、水50ml。配置LB固體培養(yǎng)基時還需加1g瓊脂。 溶化：加熱熔化，用蒸餾水定容到50mL。配置LB固體培養(yǎng)基時還需加瓊脂，整個過程不斷用玻棒攪拌，目的是防止瓊脂糊底而導致燒杯破裂。 調(diào)pH：用1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至偏堿性。 滅菌：在兩個250ml的三角瓶中分別裝入50ml LB液體培養(yǎng)基和50ml LB固體培養(yǎng)基，加上棉塞。將培養(yǎng)皿用牛皮紙包好，放入滅菌鍋內(nèi)，1kg壓力滅菌15min。 倒平板：滅菌后，待固體培養(yǎng)基冷卻至60左右時在酒精燈火焰附近操作進行。其過程是：將滅過菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁，右手拿裝有培養(yǎng)基的三角瓶，左手拔出棉塞；右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通過火焰；用左手

6、將培養(yǎng)皿打開一條稍大于三角瓶口的縫隙，右手將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，立刻蓋上皿蓋；待平板冷卻凝固后，將平板倒過來放置。 倒過來放置的目的是防止培養(yǎng)基冷卻過程中形成的水滴落到培養(yǎng)基表面。向培養(yǎng)皿中轉移已滅菌的培養(yǎng)基時，也不要把培養(yǎng)基沾在皿壁上。否則，空氣中雜菌會在這些粘附培養(yǎng)基上繁殖，并污染皿內(nèi)培養(yǎng)基。 （2）接種微生物接種的最常用方法是平板劃線法和稀釋涂布法。平板劃線法（方法簡單，考試的主要考查點）：通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面（也是分離純化的方法）。在第一次劃線后都從上次劃線末端開始的目的是獲得由單個細菌形成的標準菌落。稀釋涂布平板法（操作復雜

7、，單菌落更易分開）：將菌液進行一系列梯度稀釋，并將不同稀釋度菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。當稀釋倍數(shù)足夠高時，即可獲得單個細菌形成的標準菌落。1劃線分離法：用接種環(huán)蘸菌液后在含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿平板上劃線，在劃線過程中菌液逐漸減少，細菌也逐漸減少。劃線到最后，可使細菌間的距離加大。在培養(yǎng)1020h后，可由一個細菌產(chǎn)生單菌落，菌落不會重疊。如果再將每個菌落分別接種至含有固體培養(yǎng)基的試管斜面上，在斜面上劃線，則每個斜面的菌群就是由一個細菌產(chǎn)生的后代。 其操作步驟是：將培養(yǎng)皿底部用拇指和無名指固定成傾斜狀態(tài)，在火焰旁將培養(yǎng)皿稍微打開。在此同時，用環(huán)狀接種針在火焰旁取少許菌懸液，迅速送入培

8、養(yǎng)皿內(nèi)，在平板培養(yǎng)基的一邊，作第1次平行劃線 35條，轉動培養(yǎng)皿約70°角，用燒過冷卻的接種針，通過第1次劃線部分作第2次平行劃線，然后再用同樣方法，通過第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。劃線時，接種針應與平板表面成30°角左右。不要使接種針碰到培養(yǎng)皿邊緣，也不要將培養(yǎng)基劃破。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于恒溫箱培養(yǎng)。 取菌種前灼燒接種環(huán)的目的是消滅接種環(huán)上的微生物；除第一次劃線外，其余劃線前都要灼燒接種環(huán)的目的是消滅接種環(huán)上殘留菌種；取菌種和劃線前都要求接種環(huán)冷卻后進行，其目的是防止高溫殺死菌種；最后灼燒接種環(huán)的目的是防止細菌污染環(huán)

9、境和操作者。 2涂布分離法：先將培養(yǎng)的菌液稀釋，通常稀釋到105 107之間，然后取0.1ml不同稀釋度的稀釋菌液放在培養(yǎng)皿的固體培養(yǎng)基上，用玻璃刮刀涂布在培養(yǎng)基平面上進行培養(yǎng)，在適當?shù)南♂尪认拢僧a(chǎn)生相互分開的菌落。通常每個培養(yǎng)皿有20個以內(nèi)的單菌落最為適合。將每個菌落分別接種在斜面上擴增培養(yǎng)后，再做功能性實驗。 （3）培養(yǎng)平板倒置放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)是為了使水分蒸發(fā)形成的水蒸氣凝結成的水滴滴留在蓋上，同時防止水滴入培養(yǎng)基并擴散開，已形成的菌落隨水擴散，相互影響。（4）觀察結果（菌落數(shù)量、特征等）并分析、評價1.微生物是指結構簡單、形體微小的單細胞、多細胞或沒有細胞結構的低等生物，包括病毒、原核

10、生物、原生生物和某些真菌。細菌是單細胞的原核生物，有細胞壁（肽聚糖）、細胞膜、細胞質(zhì)，無成型的細胞核，只有一環(huán)狀DNA分子（擬核）。以分裂（二分裂）的方式繁殖，分裂速度很快。用革蘭氏染色法將細菌分為革蘭氏陽性菌（革蘭氏染液染色后，再脫色處理，細菌仍保留染色液的顏色）和革蘭氏陰性菌兩大類，區(qū)別在細胞壁的成分不同。大腸桿菌是革蘭氏陰性（細胞壁薄，有莢膜）、兼性厭氧的腸道桿菌。2.細菌的分離方法有兩種：劃線分離法和涂布分離法。是消除污染雜菌的通用方法，也是用于篩選高表達量菌株的最簡便方法之一。劃線分離就是用接種環(huán)蘸菌液后在含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿平板上劃線，在劃線的過程中菌液逐漸減少，細菌也逐漸減少，

11、。劃線最后，可使細菌間的距離加大。將接種后的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)1020小時后，一個細菌細胞就會繁殖成許多細菌細胞，形成菌落，不會重疊。在斜面上劃線，則每個斜面的菌群就是有一個細菌產(chǎn)生的后代。用于基因工程的大腸桿菌的工程菌，可以用劃線分離法獲得產(chǎn)物表達能力高的菌株。由于工程菌的質(zhì)粒中通常有抗性基因（如抗氨芐青霉素基因），如在培養(yǎng)基中加入一定量的氨芐青霉素，由于非工程菌的其他雜菌都沒有抗性基因，所以在劃線后只有存在抗性基因的工程菌能生存下來。涂布分離時，需要先將培養(yǎng)的菌液稀釋，通常稀釋到10-510-7之間，然后去0.1ml不同稀釋度的稀釋菌液放在培養(yǎng)皿的固體培養(yǎng)基上，用玻璃刮刀涂布在培養(yǎng)基平面上進行

12、培養(yǎng)，在適當?shù)南♂尪认拢僧a(chǎn)生相互分開的菌落。通常每個培養(yǎng)皿中有20個以內(nèi)的單菌落為最合適。將每個菌落分別接種在斜面上擴增培養(yǎng)后，再做功能性實驗。劃線分離法，方法簡單；涂布分離法，單菌落更易分開，但操作復雜。3.在培養(yǎng)微生物時，必須進行無菌操作。其首要條件是各種器皿必須是無菌的，各種培養(yǎng)基也必須是無菌的，轉移培養(yǎng)基、倒平板、接種、平板劃線、平板稀釋涂布等操作中的每一步都要做到無菌（防止雜菌污染）。進行恒溫培養(yǎng)時，要將培養(yǎng)皿倒置，是因為培養(yǎng)基中的水分會以水蒸氣的形式蒸發(fā)，倒放培養(yǎng)皿會使水蒸氣凝結成水滴后，落入培養(yǎng)基的表面并且擴散，菌落中的細菌也會隨水擴散，菌落見相互影響，很難在分成單菌落，達不到

13、分離的目的。4.細菌擴大培養(yǎng)要用LB液體培養(yǎng)基（通用培養(yǎng)基、常用于做生理學研究和發(fā)酵工業(yè)），劃線分離要用LB固體培養(yǎng)基（常用于微生物分離、鑒定、計數(shù)和菌種保存）。“細菌喜葷，霉菌喜素”，通常細菌培養(yǎng)基要用蛋白胨和酵母提取物來配制，還要加入一定的氯化鈉，以維持一定的滲透壓；霉菌培養(yǎng)基一般用無機物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可。盡管培養(yǎng)基的配方各不相同，但其基本成分都一樣（五類）。人及動物的營養(yǎng)物質(zhì)：水、無機鹽、糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、維生素六類；植物的營養(yǎng)物質(zhì)：礦質(zhì)元素、水、二氧化碳等三類；微生物的營養(yǎng)物質(zhì)：水、無機鹽、碳源、氮源及生長因子等五類。4.無菌技術（1）獲得純凈培養(yǎng)物的關鍵是防止外來雜菌的入

14、侵，要注意以下幾個方面：對實驗操作的空間、操作者的衣著和手，進行清潔和消毒。將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進行滅菌。為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近進行。實驗操作時應避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。（2）消毒與滅菌的區(qū)別消毒指使用較為溫和的物理或化學方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法，還有化學藥劑（如酒精、氯氣、石炭酸等）消毒、紅外線消毒。滅菌則是指使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。滅菌方法有灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌。5.培養(yǎng)基（1）培養(yǎng)基可分為液體

15、培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基（按照物理性質(zhì)）。在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑瓊脂后，制成瓊脂固體培養(yǎng)基。微生物在固體培養(yǎng)基表面生長，可以形成肉眼可見的菌落。根據(jù)菌落的特征可以判斷是哪一種菌。（2）各種培養(yǎng)基一般都含有水、碳源、氮源和無機鹽四種營養(yǎng)物質(zhì)。滿足微生物生長還需要適宜的pH、氧氣的要求（根據(jù)微生物的需求提供有氧或無氧環(huán)境）、特殊營養(yǎng)物質(zhì)等。碳源：能為微生物的代謝提供碳元素的物質(zhì)。如CO2、NaHCO3等無機碳源；糖類、蛋白質(zhì)、脂肪等有機碳源。異養(yǎng)微生物只能利用有機碳源。單質(zhì)碳不能作為碳源。氮源：能為微生物的代謝提供氮元素的物質(zhì)。如N2、NH3、NO3-、蛋白質(zhì)、氨基酸等。只有固氮微生物才能利用N2。（

16、3）培養(yǎng)基配制的原則：目的要明確、PH值要適宜、營養(yǎng)要協(xié)調(diào)和要經(jīng)濟節(jié)約。實驗2 分離以尿素為氮源的微生物尿素又稱脲,是蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)物,哺乳動物的尿液中含有,植物不能直接吸收尿素,因此,大量尿素的存在對環(huán)境造成污染.有些細菌可產(chǎn)生脲酶,以尿素為氮源,脲酶可將尿素分解為氨,被植物吸收.1、 實驗原理用選擇培養(yǎng)基可分離出以尿素為氮源的微生物，這些微生物可產(chǎn)生脲酶，脲酶可將尿素分解為能被植物吸收的氨，因此這類微生物具有一定的生態(tài)學價值。稀釋涂布平板法統(tǒng)計土壤樣品中含有的這種微生物的數(shù)目細菌 尿素 NH3 中性 堿性 酚紅顏色： 黃色 紫紅色二、實驗目的: 1.使用以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基分離細菌(有

17、脲酶) 2.通過指示劑（酚紅）顏色的變化檢知培養(yǎng)基pH的變化(脲酶催化的化學反應) 3.統(tǒng)計被檢測的土壤中含有的以尿素為氮源的微生物的數(shù)量3、 實驗中涉及到的一些問題：（1） 哪些土壤中含有這種以尿素為氮源的微生物多？（選材的問題） 沒硬化，腐殖質(zhì)豐富的土壤 (二)此實驗用到的選擇培養(yǎng)基必需含有哪些物質(zhì)？ 碳源、尿素、無機鹽、水、酚紅（3） 可用什么指標認定不同土壤中選擇出的微生物對尿素分解能力的高低？ 培養(yǎng)基紅色的深淺（四）統(tǒng)計微生物的數(shù)量可用哪些方法？ 稀釋涂布平板法，顯微鏡直接記數(shù)法三、實驗中涉及到的一些問題：（五）用稀釋涂布平板法計數(shù)時，菌落數(shù)在30-300（20以內(nèi)）計數(shù)。 做一系列濃度梯度實驗，探究合適的稀釋度 在設計實驗時，一定要涂布至少3個平板，作為重復組，才能增強實驗的說服力與準確性 （六）實驗設計要遵循的原則： 重復性原則 對照原則（排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響，提高實驗的可信度）四、實驗用品和材料：五、操作步驟：、制備無菌的固體培養(yǎng)基和尿素固體培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基LB培養(yǎng)