1、熒光定量PCR檢測結直腸癌腹腔CEA水平及其臨床意義的研究 08-07-26 17:02:00 作者：李德川編輯：studa20【摘要】 目的：應用實時熒光定量PCR技術檢測結直腸癌腹腔內CEA水平并探討其臨床意義。方法：2003年5月至2004年3月，收集在日本愛知癌癥中心手術107例結直腸癌病例的腹腔沖洗液，每個樣本的cDNA應用隨機引物合成，并在羅氏的實時熒光定量PCR（LightCycler）上進行定量分析。每個樣本同時進行常規細胞學檢查。所有病例術后經過平均為1年的隨訪。結果：CEA mRNA的陽性率和水平均與腫瘤的侵潤度（T），分期以及淋巴結轉移相關。在一個合理界定值上，CEA 和

2、CK20檢測的敏感度與特異度均為100%和100%,而常規的細胞學檢查則為33%和100%。結論：CEA定量分析是檢測結直腸癌腹腔微轉移的敏感和特異的方法，CEA mRNA水平的異常與術后的無瘤生存率顯著相關。其臨床意義有待于更長期的隨訪結果。 【關鍵詞】 結直腸癌 CEA 實時熒光定量RTPCR Abstract Objective:The purpose of this study is to detect CEA level in peritoneal cavity of colorectal cancer patients by quantitative Realtime RT PCR

3、 method and investigate its clinical significance. Methods: From May 2003 to Mar. 2004, peritoneal wash was obtained from 107 patients with colorectal cancer in Aichi cancer center. cDNA was synthesized from mRNA extracted from peritoneal washes by Random primers. Quantification of CEA mRNA was perf

4、ormed on a LightCycler instrument (Roche) with hybridization probe. A part of each peritoneal wash was also examined by conventional cytology. All patients were followed up for a median period of at least 12 months. Results: Both CEA mRNA positive rates and values were significantly correlated with

5、depth of tumor invasion, tumor stage, lymph node status. Sensitivity and specificity of CEA and CK20 realtime RTPCR with an appropriate cutoff value were 100%, 100%, and 100%, 100%, respectively, whereas those of conventional cytology were 33%, and 100%, respectively. Conclusion: CEA mRNA quantifica

6、tions is sensitive and specific method for detection of micrometastases in the peritoneal washes of colorectal cancer patients. Abnormality of CEA mRNA level in peritoneal washes is correlated with disease free survival for colorectal cancer patients. Further followup study is needed to demonstrate

7、the clinical significance of CEA mRNA in peritoneal washes. Key words Colorectal carcinoma;CEA; Realtime RTPCR 結直腸癌為常見多發的消化道惡性腫瘤，隨著生活水平的提高和飲食習慣的改變，結直腸癌的人群患病率有所上升，并有年輕化趨向。全國每年約有新發結直腸癌病例13萬。已經躍居我國惡性腫瘤死亡率的第四位。長江下游與東南沿海的江蘇、浙江、上海、福建、臺灣和香港地區是結直腸癌高發區。浙江省腫瘤醫院資料顯示，近9年來收治率增加98%，平均每年增加10.9%。與90年代初相比，收治率則增加515%

8、。 目前，結直腸癌患者盡管接受了以手術為主的根治術，但臨床上仍有50的結直腸癌患者死于術后的腫瘤局部復發和轉移, 成為手術治療失敗的主要原因1,2。因此應用先進的分子生物學技術、建立定量熒光RTPCR方法檢測結直腸癌腫瘤標志物、術后轉移的早期診斷受到高度重視。癌胚抗原（Carcinoembryonic Antigen,CEA）是分子量為180000的細胞表面糖蛋白，是結直腸癌細胞去分化過程中表達的一個重要標志，是最有價值的腫瘤標志物之一。90的結直腸癌、胃癌、胰腺癌有CEA的高表達。自1965年應用于臨床以來已作為胃腸道腫瘤的診斷和判斷預后的監測指標。CEAmRNA指標可確定結腸癌及直腸癌是否

9、發生肝轉移。本研究應用實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈式反應（RTPCR）技術，檢測結直腸癌患者手術腹腔沖洗液中游離細胞的癌胚抗原(CEA)mRNA特異性標志物，并檢測3磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)mRNA為內參因子3。結合術后對患者隨訪，研究結果將正確診斷腫瘤侵潤程度和復發可能性，對結直腸癌術后轉移的早期診斷有重要意義。同時為腫瘤患者術后放療、化療方案確定提供參考依據，以提高患者生活質量和患者生存率。 1 病例和方法 1.1 細胞株:人結腸癌肝轉移表達CEA中分化腺癌細胞株，由日本愛知癌癥中心癌癥研究所腫瘤病理實驗室建立，并培養于加入10%小牛血清（GIBCO BRL,Gaithersburg）

10、,100 unit/mL青霉素和100 ug/mL鏈霉素的DMEM培養基（Nissui Pharmaceutical, Tokyo, Japan）中。 1.2 病例收集:收集從2003年5月至2004年4月在愛知癌癥中心手術的107例結直腸癌病例，其中包括60例結腸癌，45例直腸癌，以及2例結直腸雙發癌。病例分期根據2001版UICC分期：10例0期，21例I期，34例期，31例期，11例期。病理類型為：高分化腺癌 4例，中分化腺癌 89例，低分化腺癌8例，黏液腺癌4例，未分化癌1例。 1.3 腹腔沖洗液的收集和保存:手術開始進腹后，立刻分別用100 mL生理鹽水沖洗盆底，和膈下，輕微攪拌后回

11、收沖洗液。離心（1800 r/min，5 min），PBS重新沖洗游離細胞沉淀，溶解于Isogen溶液中(Nippon Gene, Tokyo, Japan)，-80度保存至使用。其中一部分沖洗液同時常規Papnicolaou染色，以進行細胞學檢查。 1.4 實時RTPCR檢測：應用隨機引物和寡核苷酸引物檢測腹腔沖洗液游離細胞CEA mRNA,CK20 mRNA 和GAPDH mRNA，經細胞總RNA提取cDNA合成實時熒光定量RTPCR步驟。寡核苷酸引物為： CEA引物： 5AACTTCTCCTGGTCTCTCAGCT,5GCAAATGCTTTAAGGAAGAAG; 熒光探針：5TGAAAT

12、GAAGAAACTACACCAGG,5CTGCTATATCAGAGCAACCCCAA GAPDH引物：5TGAACGGGAAGCTCACTGG,5TCCACCACCCTGTTGCTGTA 熒光探針： 5TCAACAGCGACACCCACTCCT,5CACCTTTGACGCTGGGGCT PCR 的擴增使用Roche的LightCycler擴增儀，總反應體積為10 ul包括：Taq DNA聚合酶，dNTP混合物和緩沖，(LightCycler DNA Master hybridization probes, Roche), 4.0 mM MgCl2, 0.25 uM引物D和E, 0.4 uM的探

13、針，1 ul的模板cDNA,于Roche的毛細管中。95(10 秒)變性，50 -55 (10 s)淬火，72 (10 s)延伸，共50次循環，每次試驗包括6個外對照管，1個陰性對照管，和未知濃度患者樣品管。mRNA的定量可在LightCycler上與標準曲線對照后由軟件自動計算得出。 1.5 統計分析:根據腫瘤浸潤深度T，腫瘤分期，淋巴結轉移，應用卡方檢驗進行組間CEA mRNA 值顯著性的差異。無瘤生存率用KaplanMeier方法計算。 1.6 術后隨訪：所有病例均入全日本結直腸癌病例庫并按照愛知癌癥中心術后隨訪程序隨訪，無失訪。隨訪截至日期到2005年12月31日。 2 結 果 2.1

14、 常規細胞學檢查:所有107例病例均做常規術中脫落學檢查，只有2例（1.9%）診斷為陽性。 2.2 結直腸癌腹腔沖洗液中CEA水平:利用引物合成CEA mRNA在10個黏膜層和黏膜下層的早期癌中均未能檢出。 根據以往在愛知癌癥研究所的研究中，將界定值定在1.0。 大于1.0定為陽性，小于1.0定為陰性。從盆底和膈下收集的標本只要有一處CEA mRNA值為陽性，該病例定為陽性。 應用實時熒光定量PCR, 共檢測了107例腹腔沖洗液標本，RTPCR陽性率為22.4%（24/107）。在pTis1, pT2, pT3 和 pT4各組病例中，陽性率分別為0%, 0%, 26.8%（11/41），76.

15、5%（13/17），(P0.05)，各組病例的平均值分別為：0，0，700.2, 1125.8。CEA mRNA平均值與淋巴結轉移關系：CEA mRNA平均值在淋巴結轉移陰性，淋巴結轉移陽性病例中陽性率分別為7.7%（5/65），45.2%（19/42）(P0.05),平均值為65.03，1687.05(P0.01)。CEA mRNA與腫瘤分期關系：在1，2，3，4期各組病例中，陽性率分別為0%, 14.7%(5/34),32.2%(10/31)，81.8%(9/11)，(P0.05)，各組病例的平均值分別為：0，124.32，776.36,1119.74(P0.01)。腹腔轉移陽性病例的CE

16、A mRNA平均值（1196.90）顯著高于腹腔轉移陰性病例（36.32）(P0.01)。 5例有腹膜轉移陽性的病例在鏡下均診斷為pT3pT4，其中只有一例常規細胞學檢查結果為陽性（敏感度為20%）。而實時熒光定量PCR結果為陽性（敏感度為100%）。各種病理學因素，與CEA的關系見表1。表1 CEA和各種病理學因素關系 2.4 初步隨訪結果：隨訪時間平均為12個月（范圍為620個月），共有6例患者出現復發和轉移，其中包括腹腔內轉移2例，肝轉移3例，肺轉移1例。其中5例患者為CEA陽性，復發轉移率為26.3%（5/19）（剔除5例陽性對照）。其中有一例，手術時未發現腹膜轉移，但CEA和CK20

17、均為陽性，3月后再手術行肝轉移在切除時，探查確認腹膜轉移。CEA陽性患者與陰性患者相比較，無瘤生存率有顯著差異（P0.01）。 3 討 論 3.1 結直腸癌治療失敗的原因之一即是腹腔轉移。常規細胞學檢查一直以來作為腫瘤腹膜轉移的金標準，是腫瘤TNM分期以外的又一腫瘤預后因素，但Wind等4報道，常規細胞學檢查并不能為結直腸癌提供預后信息。腫瘤在進行根治手術后病例仍出現復發，原因通常被認為是手術時腹腔內即已存在從腫瘤漿膜面脫落的癌細胞，而這些脫落細胞通過常規細胞學檢查未被發現。本研究中，5例陽性對照病例（腹膜轉移）病理學診斷為pT3, 其中只有一例常規細胞學為陽性，敏感度為20%，提示建立一種新型的能檢出腫瘤微小轉移，具備高度敏感和特異方法的必要性。以往有利用常規RTPCR方法來檢測脫落癌細胞，Aoki等5報道（2002）以CEA為標記物應用常規RTPCR方法來檢測脫落癌細胞，結果提示RTPCR的結果與腫瘤的浸潤深度有關。但常規RTPCR方法有以下缺點3：（1）它是定性而不是定量的方法，因而缺少對于腹膜轉移風險的定量預測。（2）基因擴增和隨后的分析時間長，難以馬上獲得結果。（3）有一定的假陽性的