1、 CRISPR/Cas9系統系統第三小組第三小組 找資料：李瑤找資料：李瑤 王辰尹王辰尹 鄭小云鄭小云 整理資料：王桂玉整理資料：王桂玉 段林菲段林菲 劉成鳳劉成鳳 PPT PPT制作：張龍制作：張龍 勉惠勉惠 龍歡龍歡 匯報：辛國琴匯報：辛國琴目錄1簡介簡介 作用作用過程過程 應用應用與前景與前景32一、簡介一、簡介 1、引入：、引入： 基因定點修飾基因定點修飾是研究基因功能的重要手段之一也可被用于人類遺傳性疾病的治療，因此這類技術成為現代分子生物學的研究熱點。早期僅基于同源重組的基因打靶技術效率極低效率極低，應用受到限制。直到人工核酸內切酶出現人工核酸內切酶出現，將這一現狀徹底改變。一、簡

2、介一、簡介 2、簡介：、簡介： 人工核酸酶的原理是一樣的，都是由DNA結合蛋白與核酸內切酶融合而成。 2013年初，一種全新的人工核酸內切酶 CRISPR/Cas9 它主要是基于細菌的一種獲得性免疫系統改造而成，其特點是制作簡單、成本低、作用高效。一、簡介一、簡介CRISPR全名：全名：clustered regularly interspaced short palindromic repeats 即成簇的、規律間隔的短回文重復序列，是基因組中一個含有多個短重復序列的位點，這種位點在細菌和古細菌胞內起到了一種獲得性免疫（acquired immunity）的作用。CRISPR系統主要依賴cr

3、RNA和tracrRNA來對外源DNA進行序列特異性降解。目前已經發現了3種 CRISPR/Cas系統， TypeI，TypeII，Type3 ，其中TypeII系統是目前改造最為成功的人工核酸酶，因為其只需一個Cas9蛋白就能夠發揮CRISPR系統的免疫作用3、該、該系統系統的工作的工作原理原理：crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通過堿基配對與 tracrRNA （trans-activating RNA ）結合形成 tracrRNA/crRNA 復合物此復合物引導核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配對的序列靶位點剪切雙鏈 DNA。一、簡介一、簡介一、簡介一、簡介二

4、、作用二、作用過程過程獲得獲得CRISPR的間隔的間隔區區CRIPSR基因座的表基因座的表達與達與crRNA 的成熟的成熟CRISPR/Cas系統對系統對外源遺傳物質的切割外源遺傳物質的切割二、作用過程二、作用過程 獲得獲得CRISPR的的間隔區間隔區 細菌通過將入侵的噬菌體或質粒的一小段DNA序列整合到自身基因組的重復序列之間，即CRISPR 5端的兩個重復序列之間，從而獲得高度可變的間隔區域 因此，CRISPR基因座中的間隔序列從5到3的排列也記錄了外源遺傳物質入侵的時間順序。 噬菌體或是質粒上與間隔序列對應的序列被稱為protospacer，通常protospacer的5或是3端延伸幾個

5、堿基序列很保守，被稱為PAM，它的長度一般為25堿基，一般與protospacer相隔14堿基。二、作用過程二、作用過程 CRIPSR基因座的表達與基因座的表達與crRNA 的成熟的成熟 CRISPR基因座首先被轉錄成前體前體CRISPR RNA，然后在Cas9和核酸酶的作用下被剪切成成熟的成熟的crRNA基因座基因座結構結構 CRISPR/Cas的基因座結構相對的基因座結構相對簡簡單單 以產膿鏈球菌的典型TypeIICRISPR/Cas為例5端 tracrRNA基因中間 一系列Cas蛋 白 編 碼 基 因3端 CRISPR基因座二、作用過程二、作用過程 CRISPR/Cas系統對外源遺傳物質

6、的切割系統對外源遺傳物質的切割 成熟的tracrRNA、crRNA和Cas9形成核糖核蛋白復合物，crRNA識別外源匹配的DNA序列并與之結合，從而介導核糖核蛋白復合物對外源遺傳物質的切割.三三、應用與前景、應用與前景雖然CRISPR/Cas的研究還處于初始階段，但是其已經被應用在工業、學術和醫療領域。 工業工業上：上：利用該系統構建出具有噬菌體抗性的菌株以提高奶制品發酵的產量。也能把它的這種特性用于菌株分類，以及防止某些特殊質粒的擴散，防止基因污染，以保存菌株。 研究研究上：上：CRISPR/Cas系統不僅可以用來進行基因敲除，還可以敲入基因?？梢栽贑RISPR/Cas系統切割目的基因的同時

7、，通過同源重組修復斷點的原理引入特定突變或者插入目的基因片段。該技術已經成功應用于細菌、斑馬 魚、果蠅、線蟲、酵母、小鼠、人類細胞以及水稻等。 醫療上：醫療上：還可以用在細胞水平建立疾病模型，治療遺傳疾病以及進行細胞替代治療。HIV-1病毒有時能以休眠狀態存在于人類宿主細胞中，如果將LTR-targeting CRISPR/Cas9復合物導入HIV病毒或者已經誘導的T細胞中，可以使HIV失去致病性。更重要的是，該復合物甚至能夠剪切己經插入宿主染色體上的病毒基因。三三、應用、應用與前景與前景三三、應用、應用與前景與前景CRISPR/Cas9作為第三代人工核酸酶成為目前研究的熱點，相對于ZFN和TALEN有其獨特的優勢：有其獨特的優勢：a構建簡單方便快捷，適用于任何分子生物實驗室；b用于基因組的點突變編輯優于ZFN或TALEN；cCRISPR/Cas9精確的切口酶活性用于基因治療安全性高于ZFN或TZLEN。 CRISPR/Cas系統作為一種新型的基因組定點修飾技術，它的出現大大推動了對基因功能的研究。但作為一種新興的技術，它的基礎理論研究還遠遠不夠，很多分子機制尚不明確，技術也不夠成熟。盡管現在