1、IL-18在系統性紅斑狼瘡腎損害患者外周血中過度表達 作者：米向斌， 譚國珍， 曾凡欽 【摘要】 【目的】 探討IL-18在系統性紅斑狼(SLE)腎損害發生發展中的作用。 【方法】 采用RT-PCR及ELISA法測定了20例SLE患者(其中10例伴有腎損、10例無腎損)及10例健康人的外周血單個核細胞(PBMC)表達IL-18 mRNA和血清IL-18蛋白水平?！窘Y果】 SLE腎損組和非腎損組、健康對照組PBMC的IL-18 mRNA表達分別為1.350.30、0.910.27、0.690.17。 SLE腎損組和非腎損組、健康對照組血清IL-18蛋白水平分別為：(799237) pg/mL、(

2、16353) pg/mL、(11439) pg/mL。SLE腎損患者血清IL-18蛋白、PBMC的IL-18 mRNA平均表達水平較健康人、非腎損SLE患者顯著增高；SLE非腎損患者血清IL-18蛋白、PBMC的IL-18 mRNA表達水平也高于健康對照組，差異有統計學意義(P 0.05)?！窘Y論】 IL-18的過度表達可能在SLE特別是狼瘡性腎損害過程中起著一定作用。 【關鍵詞】 系統性紅斑狼瘡； 白細胞介素-18； 外周血單個核細胞 Abstract:【Objective】 To study the crucial role of IL-18 in systemic lupus eryth

3、ematosus (SLE) patients with renal damage. 【Methods】 The levels of serum IL-18 and expression of IL-18 mRNA in peripheral blood mononuclear cell (PBMC) from 20 SLE patients (10 SLE patients with renal damage, 10 SLE patients without renal damage) and 10 healthy controls were evaluated by ELIZA and R

4、T-PCR. 【Results】 The levels of IL-18 mRNA of PBMC from SLE patients with and without renal damage, healthy control were: 1.350.30, 0.910.27， and 0.690.17. The serum IL-18 levels of SLE patients with and without renal damage, healthy control were: (799237) pg/mL, (16353) pg/mL and (11439) pg/mL. The

5、levels of serum IL-18 and expression of IL-18 mRNA in PBMC from SLE with renal damage were several times of the levels in healthy controls and SLE without renal damage, compared with healthy controls, it also significantly increased in SLE patients without renal damage (respectively, P0.05). 【Conclu

6、sions】 Increased expression and secretion of IL-18 in peripheral blood may play a role in the pathogenesis of SLE patients, especially SLE patients with renal damage. Key words: systemic lupus erythematosus； interleukin-18； peripheral blood mononuclear cell 系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是

7、免疫紊亂引起的經典的自身免疫疾病。細胞因子分泌和復雜網絡的調控異常在SLE免疫紊亂發生和病理損傷中起著重要作用1。作為T細胞炎癥介質的強有力的誘導者，白細胞介素18（interleukin 18，IL-18）通過同時刺激Th1 和Th2反應、誘導嚴重免疫紊亂，從而參與一些免疫疾病的發生發展2。但是，IL-18 在 SLE 的疾病進程和系統損傷中的作用還沒有得到清楚的了解。本實驗從基因表達和蛋白水平兩個層次研究 IL-18 在 SLE，特別是伴有腎損害的SLE患者外周血中的表達，旨在探討 IL-18 在 SLE 的系統損害，特別是腎損害中的作用。 1 材料和方法 1.1 研究對象 本科2005年

8、10月至2006年2月收治的 SLE 患者20例，均符合美國風濕學會1997年修訂的 SLE診斷標準。其中，臨床出現蛋白尿者稱為 SLE 腎損患者，反之為 SLE 非腎損患者。共檢測了 SLE 腎損患者10例，為我科住院患者，女性9例，男性1例；SLE 非腎損患者10例，為我科門診隨訪患者，均為女性；健康對照組10例，皆為我院體檢中心健康體檢者，家族中無自身免疫疾病史，女性8例，男性2例。各組在性別和年齡構成上差別無統計學意義。 1.2 單個核細胞總 RNA 的提取 收集晨間空腹無抗凝血4 mL、肝素抗凝血6 mL。收集血清于-20 保存待測?？鼓毎脺缇鶳BS重懸后用Ficoll密度梯度

9、分離液分離單個核細胞(PBMC)。PBMC 的RNA提取采用Trizol Reagent ( Invitrogen公司), 紫外分光光度計測定RNA濃度及純度。 1.3 cDNA的逆轉錄合成 取RNA 2 g逆轉錄，Oligo(DT 18)10 L,加DEPC水至30 L,70 5 min,立即冰浴。再加入5逆轉錄緩沖溶液2.5 L，dNTP 2.0 L, RNA酶抑制劑1 L，逆轉錄酶M-MLV（Promega公司）2 L,加DEPC水至總體積50 L。42 60 min,70 10 min, 立即冰浴，得到產物為cDNA. 1.4 引物的合成 IL-18：上游引物序列ATGGC TGAAC

10、 CAGTA G，下游引物序列TCTAC AGTCA GAATC AGTCA T，產物片斷大小為225 bp；-肌動蛋白：上游引物序列GATGA GATTG GCATG GCTTT，下游引物序列CTCAA GTTGG GGGAC AAAAA，產物片斷大小為431 bp。所有引物均由上海英俊生物工程公司合成。 1.5 PCR擴增 PCR反應總體積25 L，包括:10PCR緩沖液2.5 L，2.5 mmol/L dNTP 2.0 L,上游引物0.5 L，下游引物0.5 L，TaqDNA聚合酶（Takara公司）0.25 L，cDNA 3 L,加滅菌水至總體積25 L。 1.6 IL-18 mRNA

11、 表達的半定量分析 PCR產物5 L，6Loading Buffer 1 L以及Syber Green 0.5 L混勻后，20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，紫外線下用UVI凝膠成像系統成像，用UVI凝膠圖像分析軟件分析各個目的片段的亮度。以-肌動蛋白作為內參照半定量，各樣本目的基因表達強度=樣本亮度值/-肌動蛋白亮度值。 1.7 IL-18蛋白水平用ELISA法檢測 人IL-18ELISA定量試劑盒為美國R&D公司產品，靈敏度為pg/mL。操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。 1.8 統計分析 應用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析。數據用表示，多組間差異采用One-Way ANOVA方法

12、。P0.05為差異有統計學意義。 2 結 果 2.1 SLE患者和健康人外周血單個核細胞的IL-18 mRNA的表達水平 SLE 腎損組、SLE 非腎損組、健康對照組外周血 PBMC 的 IL-18 mRNA的表達水平分別為：1.350.30、0.910.27、0.690.17。SLE 腎損患者IL-18 mRNA平均表達水平顯著高于 SLE 非腎損患者和健康人；SLE非腎損組較健康對照組 IL-18 mRNA表達也有所升高，差異有統計學意義(F =11.749，P =0.003)。 2.2 SLE患者和健康人血漿的IL-18蛋白分泌水平 SLE 腎損組、SLE 非腎損組、健康對照組血漿 IL

13、-18 蛋白水平分別為：(799237) pg/mL、(16353) pg/mL、(11439) pg/mL。SLE 腎損患者血漿 IL-18 蛋白水平較健康人以及 SLE 非腎損組明顯增高達36倍；SLE 非腎損組較健康人血漿 IL-18 水平也有增高，差異有統計意義(F =18.644，P =0.000)。 3 討 論 3.1 IL-18誘導的免疫紊亂參與了SLE的疾病進程和系統損傷 IL-18 是 IL-1 細胞因子家族的一個成員。它可以在多種不同的細胞表達，包括：巨噬細胞、樹突狀細胞、角質形成細胞、成骨細胞、腸上皮細胞。在人和鼠，IL-18 可以促進 Th1、CD8+ 和 NK 細胞的

14、增殖和 IFN- 的產生。作為 Th1 細胞活化的共刺激信號，它可以誘導 IL-12R 表達和協同 IL-12 的刺激 IFN- 的產生。在缺乏 IL-12 時，IL-18 對T細胞的介導效應不僅限于 Th1 分化，還可以促進Th2細胞因子的產生3。近年來的資料顯示IL-18通過同時誘導Th1、Th2的免疫紊亂，特別是強烈的誘導 IFN- 作用，參與了 SLE 的疾病進程和系統損傷4。 動物試驗發現： 與野生型 MRL 鼠相比，MRL/lpr狼瘡鼠血清 IL-18 明顯升高； 用 IL-18 單獨處理或者是 IL-18 和 IL-12 共同處理的 MRL/l r 鼠出現蛋白尿升高、腎小球腎炎和

15、脈管炎。這些效應同時伴有抗 ds-DNA 抗體和炎性細胞因子的產生增加。 此外，IL-18 處理鼠出現了面部炎性蝴蝶斑、凋亡加速和皮疹中 Ig 沉積5。這提示IL-18 可能在 SLE 各系統免疫損傷中起著一定作用。本試驗也發現 SLE 腎損害以及無腎損害的 SLE 患者血清 IL-18 分泌和PBMC表達IL-18 mRNA 水平較正常人均明顯升高；Amerio等6,7也發現活動期SLE患者血清中 IL-18 水平升高約是正常人的 67 倍，是非活動期 SLE 患者的兩倍；而且在患者疾病動態過程中，IL-18 水平的變化與 SLE DAI、抗 ds-DNA 抗體滴度的變化有很好的相關性6,7

16、。這說明 IL-18 參與了 SLE 的疾病進程和系統損傷。 3.2 IL-18在SLE的腎臟損害過程中起著一定作用 本試驗結果顯示：SLE 伴腎損患者外周血 PBMC 表達 IL-18 和血清 IL-18 分泌較無腎損害 SLE 患者顯著增高。這部分結果和學者們發現狼瘡性腎炎患者外周血單個核細胞上調IL-18 的表達相吻合8。而且，體外培養伴腎損狼瘡患者外周血單個核細胞發現，不僅較無腎損狼瘡患者和健康人相比上調表達 IL-18，而且 IL-18 的過度表達和腎臟腎小球炎癥分級有關9。腎臟腎小球局部 IL-18 的過剩也進一步支持了細胞因子 IL-18 在SLE 腎損害中起著潛在致病性作用10

17、。這可能提示 IL-18 在 SLE 的系統損傷，特別是腎臟損害的過程中發揮一定作用。 Bossu等用IL-18 cDNA 疫苗對幼齡 lpr 鼠進行了重復多次免疫后，免疫過的鼠產生了針對 IL-18 的自身抗體，并且淋巴細胞的活化增殖、IFN- 產生以及腎臟損害明顯減少。同時這些接受 IL-18 疫苗接種鼠的死亡率也明顯下降11。這些研究進一步支持了 IL-18 在 SLE 的免疫紊亂和各系統損傷中（特別是腎損害）起著一定的作用；也提示我們減少IL-18 產生和活性可能是 SLE 治療，尤其是狼瘡性腎損害治療的一個策略和方向?！緟⒖嘉墨I】 KYTTARIS V C, JUANG Y T, T

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