1、甲基強的松龍對深低溫停循環大鼠腦保護作用的研究(一)作者：顧群，莫緒明，陳鳳，彭衛，何曉敏，戚繼榮，顧海濤 【摘要】 目的 觀察甲基強的松龍（MP）對深低溫停循環（DHCA）大鼠腦N 甲基 D 天門冬氨酸受體R1（NMDAR1）表達的影響，探討MP對DHCA大鼠腦保護作用的機制。 方法 制作大鼠DHCA模型。雄性SD大鼠175只，隨機分為假手術組、DHCA模型組和MP處理組。觀察DHCA 60 min，再灌注2、6、12 h及1、2、3、7 d時NMDAR1蛋白表達的變化以及腦組織超微結構變化。結果 免疫組化結果顯示，DHCA模型組和MP處理組大鼠NMDAR1蛋白表達均升高，于1 d到達高峰，

2、后逐漸降低，于再灌注7 d恢復至正常水平。MP處理組大鼠再灌注后2、6、12 h，1、2 d 5個時間點NMDAR1表 達明顯低于模型組（P0.01）。腦組織超微結構觀察發現MP能抑制DHCA腦細胞凋亡。 結論 MP對DHCA大鼠腦 組織具有保護作用，其作用機制之一可能是與抑制NMDAR1蛋白表達有關。 【關鍵詞】 深低溫停循環;甲基強的松龍;N-甲基-D-天門冬氨酸受體R1;腦保護;蛋白表達深低溫停循環（deep hypothermic circulatory ar- rest，DHCA）技術自上世紀50年代誕生以來，已廣泛應用于復雜和嚴重的先天性心臟病及大血管手術中，但其可能并發腦損傷的問

3、題尚未得到較好解決，DH-CA術后中樞神經系統的發病率高達4%25%。DHCA手術后患者近期不同程度出現手足舞蹈癥、抽搐，遠期出現認知障礙，兒童出現智力發育障礙等神經系統并發癥1。DHCA后腦組織缺血缺氧導致突觸前興奮性氨基酸（EAA）大量釋放和再攝取減少，從而激活突觸后N 甲基D 天門冬氨酸（NMDA）和氨基 3羥基 5甲基4異戊丙酸（AMPA）受體，引起大量K+外流和Na+、Ca2+內流，造成滲透分解和Ca2+相關性損害。本實驗通過觀察甲基強的松龍（MP）對DHCA大鼠腦NMDA受體1（NMDAR1）蛋白表達的影響，以探討其腦保護機制。1 材料與方法 1.1 儀器與試劑早產兒培育箱、自制大

4、鼠冰窩、水合氯醛（南京市兒童醫院提供）、MP（美國輝瑞制藥公司）、NMDA受 體R1 （Santa Cruz公司），羊抗兔即用型SABC免疫組化檢測試劑盒SA1022（武漢博士德公司）、DAB顯色劑（武漢博士德公司）、多聚賴氨酸（美國Sigma公司）、熒光倒置顯微鏡（德國蔡司）、801圖像分析系統（江蘇 捷達）。1.2 動物成年健康雄性普通級SD大鼠（南京醫科大學實驗 動物中心）175只，體重250300 g，隨機分為3組，A組（假手術組）15只;B組（DHCA模型組）和C組（MP處理組）各80只，每組再分為DHCA后2、6、12 h，1、2、3、7 d共7個小組，每小組10只，其中DHCA后

5、6 h、1 d 兩個組為15只。術前6 h 禁食禁水。A組僅暴露雙側頸總動脈，不降溫不阻斷;B組深低溫停循環60min;C組于深低溫停循環前30 min腹腔注射MP，劑 量為30 mg kg-1。1.3 大鼠DHCA模型建立術前30 min肌肉注射阿托品0.02 mgkg-1，5%水合氯醛6 ml kg-1腹腔注射麻醉，大鼠仰臥固定于實驗臺上。溫度計插入肛門3 cm，用膠帶將其與鼠尾相 固定，監測肛溫。頸部正中切口，分別游離兩側頸總動脈及左、右頸外動脈，并雙重過線。游離一側股動脈，動脈置管，取動脈血作血氣分析后，用肝素充滿連接管后接壓力換能器，多功能監護儀監測血壓、心電變化及外周血氧飽和度。最

6、后將大鼠放入特制的冰窩，物理降溫，每隔5 min記錄體溫、心率、血壓以及血氧飽和度，調整降溫速度。當肛溫降至21 時，將大鼠取出，取動脈血做血氣分析后，經左股動脈進行肝素化（肝素鈉300 IU kg-1）。隨后用24G靜脈留置針順行穿刺左頸外靜脈，扎線固定后與三通相連。接著阻斷兩側頸總動脈，最后用24G靜脈留置針逆行穿刺頸外動脈，扎線固定 留置針，與左側頸外靜脈的靜脈留置針相連，開始轉流。轉流后，將體溫維持在（211）之間，并記錄體溫、心率、血壓以及血氧飽和度。停循環60 min后，拔出頸外動脈處留置針并結扎，回收其管道內血液，經左側頸外靜脈輸入，再退出其管內留置針并結扎。最后 松開兩側頸總動

7、脈處動脈夾，恢復頸總動脈血流，檢查穿刺處無出血后，逐層縫閉切口。然后將大鼠放入35 早產兒培育箱復溫，恢復正常體溫4 h后放置室溫下正常飼養。 1.4 免疫組化方法檢測NMDAR1蛋白表達各組取10只大鼠于DHCA后相應時間點，用含4%多聚甲醛的0.1 molL-1磷酸緩沖液經心臟升主動脈灌流固定，斷頭置于冰盒玻璃板上取出全腦，放入同樣固定液中再固定約24 h，常規脫水石蠟包埋切片，厚度4m，取4張連續切片，操作步驟按SABC試劑盒 操作說明進行，陰性對照以PBS代替一抗。應用捷達801分析軟件測定陽性細胞的灰度值，每張切片隨機選擇4個高倍視野（400）觀察并取其平均值，以灰度值來表示NMDA

8、R1的表達水平，灰度值越高，免疫組化染色越淺，NMDAR1表達越低。1.5 腦組織超微結構觀察于DHCA再灌注后6 h和1 d，各組取5只大鼠處死，每只大鼠于海馬區取1 mm1 mm1 mm的小塊 組織，于2.5%戊二醛固定后，經0.1 molL-1的磷酸 緩沖液沖洗，1%鋨酸固定，丙酮脫水，純樹脂浸透包 埋，固化后切片。切片厚度為5060 nm，醋酸鈾與枸緣酸鉛染色，透射電鏡下觀察神經元及神經膠質細胞超微結構的變化。1.6 統計學處理 所有數據以x-s 表示，用SPSS 11.0軟件進行分析，組間比較采用單因素方差分析并以LSD法比較兩兩差異，P 0.05 為差異有統計學意義。2 結 果 2

9、.1 免疫組化表達見表1。DHCA模型組和MP處理組大鼠腦 NMDAR1蛋白從再灌注2 h起開始升高，于24 h到達高峰（ P 0.01），后逐漸下降，于7 d后基本恢復正常 水平。同時在2、6、12 h，1、2 d 5個時間點，MP組大鼠 腦NMDAR1蛋白表達明顯低于DHCA模型組（P0.01 ）。表1 各組大鼠各時間點腦NMDAR1蛋白表達（略）2.2 腦組織電鏡超微結構觀察DHCA模型組和MP處理組大鼠腦組織在DH-CA后6 h腦組織超微結構未見明顯區別，基本正常; DHCA 后1 d模型組出現神經膠質細胞凋亡（圖1），MP處理組未見明顯異常（圖2）。3 討 論 NMDAR是中樞神經系

10、統內一類重要的EAA受體，廣泛存在于中樞和外周神經系統。NMDA受體由NR1、NR2、NR3A三部分組成。對NMDA受體來說NR1是不變的2，它是NMDAR藥理學和電生理學特 性的基礎，而NR2A、B、C、D亞型單獨存在時并不表現受體活性，只是在與NMDAR1結合后決定離子通道開放的時間，并調節受體興奮劑及拮抗劑的作用。因此，DHCA再灌注后腦NMDAR1表達的變化即可反映NMDAR在DHCA再灌注后的變化。DHCA對大腦的損傷機制有許多假說，其中Kris-tian等3認為EAA在DHCA腦損傷中起主要作用，DHCA期間，腦組織缺血缺氧導致突觸前EAA大量釋放和再攝取減少，從而激活突觸后NMD

11、A和AM-PA受體，使位于離子通道內起阻斷作用的鎂離子釋放，NMDA 受體介導的鈣通道及電壓敏感的鈣通道開放。一方面使Ca2+、Na+、水進入細胞內，K+大量流出 細胞膜，引起水鈉潴留導致神經元急性腫脹壞死;另一方面鈣離子大量內流導致細胞內鈣超載，鈣離子激活一系列與細胞毒性有關的酶，如蛋白激酶C、磷脂酶等，經過這些酶的共同作用，最終引發神經細胞膜降解、細胞骨架解體、DNA 斷裂，直至細胞死亡。 MP腦保護作用機制復雜，包括抗炎、阻斷氧自由基誘導的脂質過氧化、維持組織血流量和有氧能量代謝等。Langley等4研究發現MP處理組DHCA后大腦氧代謝率、腦血流量明顯高于對照組，表明DHCA前MP預處

12、理能有效地保護腦組織。Baumgartner等5通過以狗為模型DHCA2 h后，發現谷氨酸等興奮性氨基酸大量釋放引起較嚴重的腦損害。較多研究表明，MP對DHCA大腦具有保護作用，但并沒有探討其保護機制4，6。大量研究表明，具有神經保護作用的干預方法不僅可以減輕腦缺血再灌注病理損傷過程，同時可使NMDAR的表達下調。本研究發現，DHCA模型組大鼠腦NMDAR1蛋白表達從再灌注2 h起開始升高，于24 h到達高峰，其機制可能是DHCA后腦釋放大量谷氨酸作用于突觸后膜NMDAR1的谷氨酸結合位點，使神經細胞處于興奮狀態，NMDA受體轉錄和翻譯活性增大，對表達起上調作用。另外在DHCA再灌注后期NMD

13、AR1表達明顯降低，其機制可能與早期細胞壞死和凋亡、細胞功能被抑制、健存細胞大量減少以及NMDAR基因轉錄和翻譯功能下降等因素有關;也可能與受體內化有關。大鼠DHCA后腦組織 因缺血釋放大量谷氨酸，致NMDAR1過度激活，使大量NMDAR1發生內化，其結果不僅增加了NMDAR1自身的代謝過程，減少胞膜表面NMDAR1的密度，同時還可能發揮某種信號作用（包括下調NMDAR mR-NA 的轉錄）7。另外，在DHCA后2、6、12 h，1、2 d 5個時間點，MP處理組大鼠腦NMDAR1蛋白表達明顯低于DHCA模型組，說明MP能明顯抑制DHCA后腦NMDAR1蛋白的表達，減少NMDA受體介導的鈣通道

14、開放，從而起到腦保護作用。從組織超微結構發現，DHCA模型組和MP處理組大鼠在DHCA后6 h腦組織超微結構未見明顯區別，屬基本正常;DHCA 后24 h模型組大鼠腦組織出現神經膠質細胞凋亡，MP處理組未見異常，說明MP能明顯抑制DHCA后腦細胞凋亡，起到腦保護作用。基于已有的實驗結果推測，MP對DHCA的腦保護作用機制可能是通過多途徑實現的，并不能僅用單純抑制NMDAR1 蛋白表達解釋，或許還與其他非NMDA 受體有關系。另外本研究結果僅僅提示MP可能是通過調控EAA NMDAR1 Ca2+通路而產生腦保護作用，但是其對NMDAR1的抑制作用是直接作用于NMDAR1還是通過其他途徑間接影響N

15、MDAR1，這些問題還有待于更進一步的研究。【參考文獻】1DeLeon S Y，Thomas C，Roughneen P T，et al.Experimental evidence of cerebral injury from profound hypothermia dur-ing cardiopulmonary bypassJ.Pediatr Cardiol，1998，19 （5）:398-403. 2Meldrum B S.Glutamate as a neurotransmitter in the brain: review of physiology and pathologyJ.

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