1、    Cystatin F在中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘動物模型中的表達Cystatin F在中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘動物模型中的表達李菲菲范凱張艷麗宋大為馬堅妹*(大連醫(yī)科大學解剖學教研室, 大連 116044)摘要:神經(jīng)脫髓鞘疾病是中樞神經(jīng)系統(tǒng)難治性疾病,髓鞘脫失后伴有各種基因表達的異常。明確這些基因的表達形式對脫髓鞘疾病的治療具有重要意義。本研究利用0.2%cuprizone飼育C57BL/6小鼠6周制備中樞神經(jīng)脫髓鞘模型，采用原位雜交技術對組織蛋白酶抑制劑cystatin F的mRNA表達進行研究。結果發(fā)現(xiàn)，正常野生型小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中未見cystatin F

2、 mRNA的表達，而大量表達于脫髓鞘模型小鼠白質(zhì)內(nèi)。通過小膠質(zhì)細胞標志物Iba1抗體免疫組化和cfms的原位雜交研究發(fā)現(xiàn)，脫髓鞘模型小鼠白質(zhì)內(nèi)有大量激活的小膠質(zhì)細胞。為進一步確定表達cystatin F的細胞類型，通過cystatin F原位雜交后Iba1免疫雙染技術，確定cystatin F在中樞神經(jīng)主要由激活的小膠質(zhì)細胞表達，提示其表達與小膠質(zhì)細胞活化和崩解髓鞘殘骸清除有關。關鍵詞 脫髓鞘Cystatin F小膠質(zhì)細胞Expression of cystatin F in central nervous system of demyelinated animal modelLi Feife

3、i, Fan Kai, Zhang Yanli, Song Dawei, Ma Jianmei（Department of  Anatomy， Dalian Medical University， Dalian 116044）AbstractDemyelination disease is a refractoriness neurological disease in the central nervous system (CNS). Accompanying demyelination, numerous genes expression has been found chang

4、ed. Investigation into the expression pattern of these genes is important for the treatment of demyelination disease. In this study, 0.2% cuprizone diet C57BL/6 mice were used to establish acutely demyelinated model. Using these model mice, the expression of cystatin F, which is an inhibitor of cath

5、epsin protease, was analyzed by in situ hybridization method. The results showed that no expression of cystatin F could be detected in the CNS in wild type mice; however, significant cystatin F expression was observed in white matter in model mice. Futhermore, considerable activated microglia was fo

6、und by using Iba1 antibody and cfms probe as the marker of activated microglia. In order to clarify which type of cells expressed cystatin F, Iba1 immunostaining and cystatin F in situ hybridization were carried out. The results showed that cystatin F was expressed by activated microglia. These resu

7、lts indicate that the expression of cystatin F is correlated with the activation of micrglia and cleaning of myelin debris.Key wordsdemyelination, cystatin F, microglia cells髓鞘是包繞在大多數(shù)神經(jīng)元軸突表面的一層絕緣脂肪層，少突膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘形成細胞，它們易在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中受損，發(fā)生髓鞘變性，如多發(fā)性硬化（multiple sclerosis, MS）。在髓鞘損傷時，少突膠質(zhì)細胞的前體細胞（oligode

8、ndrocyte progenitor cells, OPCs）迅速增殖，并向髓鞘損傷區(qū)域移動，分化成熟，包裹軸突，完成髓鞘再生。OPCs的形態(tài)呈圓形，無突起，隨著成熟與分化，經(jīng)過發(fā)出突起、突起逐漸增多、形成密集的膜樣突起幾個階段，最后成為包繞軸突、形成髓鞘的成熟少突膠質(zhì)細胞。然而，原本可以再生的髓鞘，為什么在MS晚期患者和一些動物模型中失去了再生的能力，即髓鞘的再生機制，至今沒有定論。我們在對慢性脫髓鞘轉基因動物（plptg/）1的解析工作中發(fā)現(xiàn)，在髓鞘再生不能的轉基因模型小鼠腦內(nèi)大量存在OPCs，但是這些OPCs不能順利成熟、分化成為可包繞軸突、形成髓鞘的少突膠質(zhì)細胞，而是停滯在形成髓鞘包

9、繞軸突的前期，即premyelinating階段1,2。關于這一階段的少突膠質(zhì)細胞，Trapp.研究小組2在論文中有著詳細的描述，它們可以表達成熟少突膠質(zhì)細胞形成髓鞘所必須的蛋白，如蛋白脂質(zhì)蛋白（proteolipid protein，PLP），髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）等，甚至向軸突伸出突起，不過它們停留在這一階段，無法形成包繞軸突的膜樣結構。我們在前期的研究證實，伴隨脫髓鞘過程的神經(jīng)病理學改變，小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞都有不同程度的增多，它們都可以通過表達各種蛋白或細胞因子影響髓鞘再生的微環(huán)境。因此可以認為髓鞘再生微環(huán)境的變化，即某些基因表達水平的變化

10、，才是導致髓鞘不能再生的更為可能的原因。對這些基因功能的闡明對于髓鞘再生機制的研究將有著深遠的影響和意義。本研究采用一種特異誘導少突膠質(zhì)細胞凋亡、導致神經(jīng)脫髓鞘的毒性物質(zhì)cuprizone，制備急性脫髓鞘小鼠模型，并在模型中發(fā)現(xiàn)了型半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族的成員cystatin F的mRNA在髓鞘脫失區(qū)域的表達，同時在相同區(qū)域發(fā)現(xiàn)有小膠質(zhì)細胞的激活。通過原位雜交后的免疫雙染技術，確定cystatin F主要由活化的小膠質(zhì)細胞表達，推測髓鞘的崩解和小膠質(zhì)細胞的活化是誘導cystatin F表達的主要因素。材料和方法1.實驗動物6周齡C57BL/6系小鼠 10只，雌雄不拘，隨機分為實驗組10只和對

11、照組5只（大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供）。2.脫髓模型制備及組織準備模型組動物用含0.2% cuprizone的粉末飼料飼育6 w；對照組動物正常飼料飼育6 w。乙醚麻醉后經(jīng)左心室4%多聚甲醛溶液灌流，固定，取腦。經(jīng)4%多聚甲醛溶液后固定24 h后，于20% DEPC處理蔗糖溶液內(nèi)置換過夜。OCT (Sakura Finetechnical Co., Tokyo)包埋，冰凍冠裝切片，切片厚度18 m。3.原位雜交及原位雜交后免疫組化雙染ABC常規(guī)方法免疫組化染色。兔抗Iba1抗體 (11000, Wako）；生物素化羊抗兔抗體（1200，Vectastain）；ABC（AvidinBiotin

12、Peroxidase kit，99100，Invitrogen）。cfms（macrophage colonystimulating factor receptor）及cystatin F原位雜交主要步驟如下： 18 m冰凍切片經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定20 min，20 g/ml蛋白酶K處理30 min；4%多聚甲醛溶液固定15 min，以滅活蛋白酶K；0.1 mol/L  TEA（三乙醇胺）HCL洗15 min；65預雜交2 h后，分別加入地高辛標記的cfms和cystatin F cRNA探針65過夜；緩沖液（1×SSC和50%甲酰胺）65洗30 min×3；M

13、ABT緩沖液（100 mmol/L maleic acid ，150 mmol/L NaCl，0.1% Tween20，pH7.5）室溫洗30 min×2；加堿性磷酸酶耦聯(lián)的抗地高辛抗體，4過夜； MABT緩沖液室溫洗30 min×3；NBT/BCIP室溫孵育至發(fā)色良好；PBS終止反應。雜交后的切片用nuclear fast red襯染。cystatin F原位雜交之后切片進行Iba1免疫組化ABC法染色，DAB顯色。結果1.小膠質(zhì)細胞的增殖與活化cfms原位雜交為藍色點狀信號，在正常對照動物中均勻分布在白質(zhì)和灰質(zhì)區(qū)域，陽性細胞的數(shù)目也相對較少（Fig.1A）。在髓鞘脫失模

14、型動物中，其信號密集分布于胼胝體（箭頭所示區(qū)域）等具有髓鞘脫失的區(qū)域（Fig.1B）。Iba1免疫組化結果顯示在正常對照動物中細胞形態(tài)較小，突起較少，處于非活化狀態(tài)，在灰白質(zhì)內(nèi)散在分布（Fig.1C）。而在髓鞘脫失模型動物中陽性表達細胞數(shù)量明顯增多，并且集中在胼胝體區(qū)域。細胞體積較大，分支較多，處于明顯的活化吞噬狀態(tài)（Fig.1D）。2.cystatin F mRNA的表達情況正常對照組動物腦內(nèi)未見cystatin F原位雜交信號。在脫髓鞘動物模型中其表達信號主要表位于髓鞘脫失嚴重的胼胝體（Fig.1E箭頭所示部位）。cystatin F原位雜交（藍色）后Iba1免疫組化（棕色）結果顯示，cy

15、statin F主要由小膠質(zhì)細胞表達（Fig.1F）。討論Cystatin F發(fā)現(xiàn)于1993年，別名leukocystatin和CMAP （cystatinlike metastasis associated protein），屬于型半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族的成員。Cystatin F顯示與家族其他成員的同源性很低（35%），在它的N末端有兩個半胱氨酸的殘基和位于與蛋白酶相互作用區(qū)域的二硫鍵。cystatin F以二硫化物聚合物的形式分泌，激活后變?yōu)閱误w形式。作為型半胱氨酸蛋白酶的抑制因子，cystatin F對cathepsin  L, V, K 和F有一定的抑制作用，但是相對于同

16、一家族的cystatin C其抑制作用很低，而對cathepsins B和C基本沒有抑制作用。根據(jù)以往的研究cystatin F的表達主要見于淋巴器官，如脾臟，淋巴結等，主要存在于與抗原呈遞相關的細胞中35。在某些腫瘤細胞，如白血病細胞中也有表達5,6，有研究證明cystatin F在腫瘤細胞中的表達與腫瘤的轉移有一定的相關性7,8。但在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中，關于此基因的表達至今國內(nèi)外均未見報道，在脫髓鞘疾病中的表達及誘導其表達的機制更是一無所知。通過我們的研究發(fā)現(xiàn)，正常小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)未見cystatin F表達，而在髓鞘脫失后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)區(qū)域內(nèi)可見cystatin F表達，并且

17、表達細胞主要為小膠質(zhì)細胞。作為腦內(nèi)的吞噬細胞，小膠質(zhì)細胞具有清除髓鞘殘骸的功能，因此神經(jīng)髓鞘脫失時通常伴隨著小膠質(zhì)細胞的增生及活化。cfms 基因編碼的跨膜糖蛋白為單核細胞集落刺激因子CSF1受體的類似物，其表達主要在單核細胞系的細胞中，包括腦內(nèi)的小膠質(zhì)細胞9。Iba1是一種由147個氨基酸構成的鈣結合蛋白，主要在小膠質(zhì)細胞的細胞質(zhì)和細胞核中表達10。根據(jù)cfms制備的探針和Iba1抗體均能較好的顯示活化和增生的小膠質(zhì)細胞。小膠質(zhì)細胞吞噬髓鞘的殘骸后，其蛋白水解酶的表達水平升高（先前的研究已經(jīng)證實），但是不能將cystatin F的表達單純解釋為蛋白水解酶水平增高造成的，因為畢竟cystati

18、n F作為蛋白酶的抑制物，其作用很弱。因此誘導cystatin F表達的原因和其表達的作用還有待于進一步的研究。參考文獻 1 Kagawa T, Ikenaka K, Inoue Y et al. Glial cell degeneration and hypomyelination caused by overexpression of myelin proteolipid protein gene. Neuron, 1994;13427-442 2  Chang A, Tourtellotte WW, Rudick R et al. Premyelinating oligoden

19、drocytes in chronic lesions of multiple sclerosis. N Engl J Med, 2002;346165-173 3 Ma J, Matsumoto M, Tanaka KF et al. An animal model for late onset chronic demyelination disease caused by failed terminal differentiation of oligodendrocytes. Neuron glia biol, 2006;281-91 4 Ni J, Fernandez MA, Danie

20、lsson L et al. Cystatin F is a glycosylated human low molecular weight cysteine proteinase inhibitor. J Biol Chem, 1998;27324797-24804 5 Halfon S, Ford J, Foster J et al. Leukocystatin, a new Class II cystatin expressed selectively by hematopoietic cells. J Biol Chem, 1998;27316400-16408 6 Cappello F, Gatti E, Camossetto V et al. Cystatin F is secreted, but artificial modification of its    Cterminus can induce its endocytic targeting. Exp Cell Res, 2004;297607-618 7 Nathanson CM, Was