1、壬基酚對家兔丙二醛及谷胱甘肽過氧化物酶的影響壬基酚對家兔丙二醛及谷胱甘肽過氧化物酶的影響摘要：本試驗以被喂養壬基酚的不同月齡家兔作為試驗材料，通過家兔不同器官中丙二醛及其谷胱甘肽過氧化物酶含量的測定，來分析壬基酚對于家兔的影響。結果表明：家兔血漿、肌肉、肝和腎中丙二醛和谷胱甘肽過氧化物酶含量發生了不同程度的改變，壬基酚可影響機體的抗氧化防御系統。關鍵詞：壬基酚；家兔；丙二醛；谷胱甘肽過氧化物酶Influence Of Nonylphenol On Malondialdehyde And Glutathione Peroxidase Of The Rabbit Abstract： This st

2、udy was mainly aimed to evaluate the effect of nonylphenol to the malondialdehyde (MDA) and glutathione peroxidase (GPX) of the Rabbit. One-，three - and fivemonth-old rabbits were randomly divided into control group which was administered by water without any chlorine and experiment group which was

3、administered by 0.5mg/L nonylphenol solution. There were six rabbits in every group. After 21 days, the rabbits were killed for the sampling of plasma, liver, muscle and kidney. The results showed that the concentration of MDA and the activity of GPX were changed, and therefore nonylphenol can alter

4、 lipid peroxidation and the antioxidant defense system.Key words：Nonylphenol; Rabbit; Malondialdehyde; Glutathione peroxidase目 錄前言11.材料與方法21.1 動物材料21.2試驗方法22結果與分析32.1壬基酚對不同月齡家兔MDA的影響結果52.2壬基酚對不同月齡家兔GPX的影響結果53討論53.1壬基酚對不同月齡家兔MDA的影響53.2壬基酚對不同月齡家兔GPX的影響6參考文獻7致謝10前言壬基酚（Nonylphenol，NP）是一種新近認識的環境內分泌干擾物，被廣

5、泛的應用于工業生產中，例如清潔劑、油漆、殺蟲劑的生產，還可作為工業生產中的抗氧化劑以及一些個人護理用品的乳化劑，少量壬基酚被應用于食品包裝方面透明塑料膜的制造。壬基酚的化學性質穩定，難降解，研究證實壬基酚在60的有氧環境中可以經微生物降解，但在無氧情況下壬基酚仍難于降解1。由于壬基酚的脂溶性和難降解的特點，水生生物可作為其富集的貯存庫2。一方面通過水體的傳遞積累于生物體內，另一方面通過食物鏈的傳遞而發生放大作用3。壬基酚在河水、水生附著生物和底棲生物之間的生物積累與放大倍數在18-1200倍之間。而底棲生物的相對最大積累率可達106倍，環境激素通過食物鏈的生物放大作用比通過水體的傳遞對魚類等水

6、生生物的危害更大4。如大西洋鮭（Salmo salar）可以通過洄游將環境雌激素轉移到阿拉斯加淡水湖泊，從而使環境雌激素濃度高出其他湖泊2倍5-6。在生態系統中，這類物質通過生物濃縮、生物積累和生物放大等途徑增大濃度，實現對生物和人類的更大危害。壬基酚可對生物體產生廣泛的不良作用。近幾年來通過體內外試驗研究發現，壬基酚對嚙齒類動物的多種器官、系統存在毒性作用，其中對于生殖系統的研究比較透徹。當壬基酚劑量為250mg/（kg·d）時，經口給予嚙齒類動物時可引起明顯的睪丸損害，壬基酚能降低雄性大鼠生殖系統附睪的重量，導致精子密度和睪酮水平降低與促黃體素、促卵泡素水平的增加，并且精巢中細胞

7、凋亡的數目隨著壬基酚濃度的增加而增加7。壬基酚可以通過模仿或是調節內源性激素系統影響正常的腦功能。Obata等研究發現壬基酚可以通過雌激素受體的作用，誘導大鼠紋狀體內羥自由基（·OH）的形成8。在體試驗進一步證明了壬基酚對于中樞神經系統的正常功能有一定干擾作用。通過對卵巢切除大鼠皮下注射劑量為50 mg/（kg·d）的壬基酚發現，壬基酚能夠通過影響孕激素受體系統改變皮質功能9，也能夠通過影響腺垂體水平，抑制卵巢切除大鼠促黃體素的分泌10。在免疫系統中，體內和體外細胞試驗都證明壬基酚能通過改變胸腺細胞Fas和FasL的表達誘導細胞凋亡來影響免疫功能11、12。壬基酚還可通過激

8、活caspase-3以及線粒體去極化誘導胸腺細胞的凋亡13。除了對生殖系統以及免疫系統的毒性研究以外，壬基酚還被發現可以作為細胞轉化的助劑，導致體內癌癥的發生14，誘導成熟大鼠急性肝毒性作用15。丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是脂質過氧化的最終分解產物之一,其含量變化可在分子水平上指示生物體的氧化損傷程度16 。因此通過檢測機體內MDA含量變化，可以直接反映出機體內脂質過氧化的程度，而且能間接的反映出機體細胞受自由基攻擊損傷的程度17。生物體抗氧化酶防御系統主要包括超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、谷胱

9、甘肽過氧化物酶（Glutathione Peroxidase, GPX）等，其主要功能是清除活性氧自由基18-21。谷胱甘肽過氧化氫酶（GPX）是生物機體內重要的抗氧化酶之一，它可以消除機體內的過氧化氫及脂質過氧化物，阻斷活性氧自由基對機體的進一步損傷，是生物體內重要的活性氧自由基清除劑 22。在機體清除自由基的過程中，抗氧化酶起著重要的作用。GPX能催化H2O2 和脂質過氧化物還原，防止脂質過氧化物對機體生物膜和組織的損傷，并防止脂質過氧化物進一步水解為有害物質MDA。因此MDA和GPX的含量變化可在分子水平上指示生物體的氧化損傷程度23，24 。毒理學研究表明生物體GSH 和MDA 含量變

10、化對化學物質反應靈敏，且測定簡便、不易受分析條件影響，常作為化學物質生態毒性的評價指標25，26。王志成27等人發現氟中毒會使體內起抗氧化作用的SOD、GPX等酶的生物活性受抑制，使自由基在體內大量蓄積而致脂質過氧化作用增強。眾多試驗研究也發現氟可對動物多種組織產生脂質過氧化損傷28-34。目前有關壬基酚的研究主要集中在對于內分泌、生殖和發育、促癌作用、免疫影響等方面，而關于壬基酚對動物機體理化的影響尚未見報道。因此本試驗以家兔為試材，檢測喂養了壬基酚的家兔體內MDA及GPX含量的變化，為進一步深入研究壬基酚對動物機體影響的研究提供參考依據。1材料與方法1.1 動物材料 試驗所用健康成年家兔均

11、購于大慶春蕾飼養場，用長春希望兔飼料喂養。1.2 試驗方法動物材料的處理健康家兔36只，1月齡、3月齡和5月齡各12只。飼養室預飼養一周后隨機分成對照組和處理組，每組6只。對照組喂養除氯自來水，處理組喂養0.5mg/L壬基酚溶液，喂養21天。動物采樣和樣品制備速眠新麻醉家兔：家兔肌肉注射速眠新，注射后5-10分鐘麻醉。如果第一次給藥量不足，可再加大給藥劑量，使其麻醉。心臟取血：將兔仰臥固定在手術臺上，將心臟部位被毛剪去，用碘酒酒精消毒皮膚，選擇心搏最明顯處穿刺，針頭刺入心臟后即有血液涌入注射器中。取得所需血量后，迅速將針頭拔出，將血液轉入肝素處理的離心管中。組織采樣：注射過量麻醉劑處死家兔，再

12、解剖取出肝、肌肉和腎。血液樣品制備：將取出的血液3000r/min離心10min，取血漿，裝入離心管中液氮速凍后置于-70冰箱保存，以待用于生化指標的測定。組織塊樣品制備及處理：將取出的組織塊剪碎混勻后裝入離心管中，經液氮速凍后置于-70冰箱保存，以待用于生化指標的測定。測定前，取出組織塊，稱取肌肉、肝、腎分別為1g、0.5g、1g，將其置于研缽中研磨后用于冷的0.9%生理鹽水稀釋勻漿，制成的組織勻漿濃度分別為10%、20%、20%。將組織勻漿3000r/min離心10min取上清，用于生化指標的測定。丙二醛含量的測定參照測試盒說明書提供的方法，制備標準管，標準空白管及測定管。將其混勻之后，9

13、5水浴40min，取出后用流水冷卻，然后4000轉/分，離心10min，取上清，532nm處，1cm光徑比色杯，蒸餾水調零，測各管OD值。1.2.4谷胱甘肽過氧化物酶的測定參照測試盒說明書提供的方法將對照管與測定管進行酶促反應?；靹蚝螅?7水浴，預溫5min，分別加入37預溫的試劑一100L。然后37水浴準確反應5min后分別再加入試劑二2000L，對照管再加200L的試劑盒樣品?；靹蚝?，4000轉/分，離心10min，取上清1ml做顯色反應。之后進行混勻，室溫靜置15min后，412nm處，1cm光徑比色杯，蒸餾水調零，測各管OD值。計算公式（1）MDA含量活力的計算：組織MDA含量（nmo

14、l/ mgprot）=（測定管OD值-標準空白管OD值）/（標準管OD值-標準空白管OD值）×標準品濃度（10nmol/mL）÷蛋白含量（mgprot/ml）血漿MDA含量（nmol/ mgprot）=（測定管OD值-標準空白管OD值）/（標準管OD值-標準空白管OD值）×標準品濃度（10nmol/mL）×樣品測試前稀釋倍數（2）GPX活力的計算：組織GPX酶活力=（非酶管OD值-酶管OD值）/（標準管OD值-空白管OD值）×標準管濃度（20umol/L）×稀釋倍數（5*）÷反應時間÷（取樣量×樣本蛋白含

15、量）血漿GPX活力=（非酶管OD值-酶管OD值）/（標準管OD值-空白管OD值）×標準管濃度（20umol/L）×稀釋倍數（5*）×樣本測試前稀釋倍數1.2.6 數據處理所得數據用SAS V8.0統計學軟件包進行處理分析，壬基酚處理對各組的影響使用一般線性模型的雙因素方差分析，而多重比較使用鄧肯氏法（Duncans）。2結果與分析2.1壬基酚對不同月齡家兔MDA的影響結果如表1-4所示，雙因素方差分析表明，壬基酚的處理對血漿、肌肉、肝和腎中MDA含量的變化沒有顯著作用（P血漿=0.121，P肌肉=0.544，P肝=0.541，P腎=0.274），但是月齡卻有顯著作

16、用（P血漿=0.001，P肌肉=0.009，P肝=0.000，P腎=0.000）。三月齡家兔的血漿MDA含量明顯高于一月齡和五月齡。肌肉中MDA隨年齡增長含量升高。一月齡家兔的肝中MDA含量明顯高于三月齡和五月齡。腎中MDA則隨月齡增長含量升高。表1壬基酚對家兔血漿中MDA含量的影響（單位：nmol/ ml）一月齡三月齡五月齡平均值對照組67.21±35.92145.42±14.8695.17±27.59102.60a試驗組103.41±31.77170.62±37.19125.11±21.46133.05a注：同一行列肩標小寫字母不

17、同者表示差異顯著（P0.05），相同或無表示差異不顯著（P0.05）以下各表同上表2壬基酚對家兔肌肉中MDA含量的影響（單位：nmol/ ml）一月齡三月齡五月齡平均值對照組85.02±24.60106.54±4.06159.32±52.37116.96a試驗組84.49±30.22133.22±25.20168.89±16.64128.87a表3壬基酚對家兔肝中MDA含量的影響（單位：nmol/ ml）一月齡三月齡五月齡平均值對照組32.26±9.3412.69±1.1211.10±1.6418.68a

18、試驗組24.43±1.2414.32±1.3413.87±3.4017.54a表4壬基酚對家兔腎中MDA含量的影響（單位：nmol/ ml）一月齡三月齡五月齡平均值對照組3.30±0.324.75±0.539.27±0.595.77a試驗組3.650±0.364.91±0.2310.09±1.136.22a2.2壬基酚對不同月齡家兔GPX的影響結果如表5-8所示，雙因素方差分析結果表明，壬基酚的處理對血漿、肌肉和腎中GPX含量的變化沒有顯著作用（P血漿=0.554，P肌肉=0.776， P腎=0.942）

19、，對肝中GPX含量的變化有顯著作用（P肝=0.002），但是月齡卻有顯著作用（P血漿=0.006，P肌肉=0.000，P肝=0.000，P腎=0.000）。五月齡家兔的血漿GPX含量明顯高于一月齡和三月齡。三月齡家兔的肌肉中GPX含量明顯高于一月齡和五月齡。五月齡家兔的肝中GPX含量明顯高于一月齡和三月齡。腎中GPX的含量隨月齡的增長而降低。表5壬基酚對家兔血漿中GPX含量的影響一月齡三月齡五月齡平均值對照組11.50±3.9715.63±1.0921.88±2.9516.34a試驗組15.71±3.2216.72±2.4419.63±

20、;2.2517.35a表6壬基酚對家兔肌肉中GPX含量的影響一月齡三月齡五月齡平均值對照組1285.75±234.552630.04±192.371879.16±250.661931.6a試驗組1468.41±169.932429.44±123.522001.03±169.041966.3a表7壬基酚對家兔肝中GPX含量的影響一月齡三月齡五月齡平均值對照組228.37±28.96230.76±13.68398.86±25.53286.00a試驗組206.39±11.27226.80±9

21、.76317.71±14.34250.30b表8壬基酚對家兔腎中GPX含量的影響一月齡三月齡五月齡平均值對照組127.95±2.52104.77±6.8692.753±5.01108.49a試驗組132.18±5.35106.48±12.0587.909±4.31108.86a3討論3.1壬基酚對不同月齡家兔MDA的影響正常情況下，機體活性氧自由基由細胞新陳代謝不斷產生，不斷清除，兩者處于平衡狀態。當活性氧自由基的產生超過機體防御體系的清除能力或機體的防御體系受損而不能發揮正常功能時，自由基會對細胞形成氧化損傷?；钚匝踝杂苫?/p>

22、對機體造成的重大損害之一是其代謝產生脂質過氧化。機體內存在著大量的不飽和脂肪酸，極易受到過氧化作用的損傷。脂質過氧化的損傷途徑為:氧自由基+細胞膜脂質脂質過氧化反應過氧化脂質丙二醛+細胞成分脂褐質。MDA 是脂質過氧化反應鏈式終止階段產生的小分子產物，是目前公認能反映氧自由基產生及引發的脂質過氧化反應的間接指標，其含量可以間接反映自由基的產生情況和機體組織細胞的脂質過氧化程度35。而且，脂類過氧化產物MDA能與膜上的蛋白質氨基酸殘基或核酸反應生成Shiff堿，增大膜的透性，促進膜的滲漏，降低膜的穩定性，從而使各種細胞器膜的結構與功能發生紊亂，嚴重時可導致細胞死亡36，因此可反映其對組織損傷的嚴

23、重程度，也是目前反映機體氧化損傷最具代表性的指標。肝臟在機體內具有特殊的解剖位置、組織結構與生理生化特征，是最易作為外來化學物的毒作用靶器官。肝臟是一個被血液充盈的器官，與血液循環系統密切相連，由于肝臟存在門靜脈與肝動脈兩套入肝血管，分別接受來自胃腸道靜脈血液與體循環的動脈血液，化學物質無論從何種途徑進入機體，最終均可通過血液循環迅速達到肝臟，尤其從消化道吸收的化學毒物，在進入血循環前毒物首先與肝臟接觸。因此，當機體接觸外源性毒物時，肝臟比其他器官更常發生毒性反應。因而長期的壬基酚的處理刺激，血細胞產生的活性氧將升高，大量活性氧的積累可能進而導致了細胞的氧化損傷，引發脂質過氧化作用，并因此形成

24、脂質過氧化物37。因此肝臟脂質過氧化作用增強，抗氧化能力下降，造成了肝臟氧化與抗氧化防御機制之間的失衡，使機體處于氧化應激狀態，從而誘發肝臟的氧化損傷，因此家兔肝臟中MDA的含量應該有顯著降低。然而，本試驗肝臟中MDA的含量對照與處理后的試驗結果沒有明顯差異，且處理后家兔MDA含量有所降低，表明壬基酚對其沒有產生顯著作用。大量動物試驗研究提示，大鼠血漿內的SOD隨年齡明顯降低，而MDA顯著升高38 。本試驗結果發現不同月齡家兔血漿肌肉和腎中MDA含量總趨勢隨年齡增加，這一檢測結果與其它文獻報道的MDA隨年齡而增加相一致，從而表明壬基酚并沒有對其產生嚴重的影響。但是也可能由于本試驗中壬基酚處理的

25、時間過短，或者濃度不夠大，對機體生理系統基本無影響，沒有造成生物體的氧化損傷程度。對于個別年齡段的MDA含量有較大差別，顯著增高，可能由于此年齡段家兔生長太快所致。3.2壬基酚對不同月齡家兔GPX的影響GPX 是生物體內廣泛存在的一種重要的清除H2O2 和許多有機氫過氧化物的酶。它能催化H2O2 和脂質過氧化物還原，防止脂質過氧化物對機體生物膜和組織的損傷，并防止脂質過氧化物進一步水解為有害物質MDA。大量動物試驗研究提示，大鼠血漿和肝內的GPX隨年齡明顯降低。本試驗結果發現不同月齡家兔血漿、肌肉和肝中GPX含量總趨勢隨月齡增加，腎中的GPX含量則隨年齡而降低，這一檢測結果與其它文獻報道的血漿

26、和肝內GPX隨年齡而降低不一致，可能由于本試驗家兔年齡偏小，快速生長刺激了機體內GPX的產生，影響GPX含量。然而，血漿、肌肉和腎對照與試驗組沒有明顯差異，表明壬基酚對其沒有產生嚴重的影響。壬基酚對其沒有影響可能由于壬基酚處理的時間過短，或者濃度不夠大，沒有造成生物體的氧化損傷程度。GPX是體內重要抗氧化酶，SOD歧化O2形成的H2O2、H2O2R、ROOH分別與還原型谷胱甘肽在谷胱甘肽過氧化物酶作用下形成H2O、RH和毒性較小的ROH，起到清除自由基的作用39。處理組家兔GPX活性較對照組有不同程度的降低。正常情況下，肝臟代謝過程中產生一定量的自由基，但可被抗氧化自由基物質所清除，二者之間處

27、于平衡狀態，不造成肝臟組織的損害。談冶雄等40測定慢性活動性肝炎、肝硬化、肝癌等肝組織中的GPX活性，結果均顯著低于肝功正常者,表明損傷過程中GPX活性受抑制。血漿谷胱甘肽依賴酶的活性在氧化劑增高時出現，并且從損傷的肝細胞中釋放到血清，因此GPX 是肝細胞損傷的超級標志41。當肝臟有毒物質增高時，能影響肝臟的正常生理功能，從而使血液和體液中硒的濃度下降，谷胱甘肽過氧化物酶的活性降低。這與本試驗結果相似，反映了家兔肝臟GPX清除活性氧自由基的能力降低，增加了脂質過氧化程度，對肝細胞具有破壞作用。表明，壬基酚降低組織細胞抗氧化能力，造成自由基損傷。綜上所見，本研究通過測定壬基酚對不同月齡兔子血漿、

28、肝臟、腎臟和肌肉中MDA和GPX含量的影響，發現長期飼喂壬基酚后引起兔子血漿、肝臟、腎臟和肌肉中MDA含量的升高，而在GPX的含量發生了不同程度的改變，說明壬基酚能增強機體內脂質過氧化的程度，對機體產生不顯著的傷害，表明壬基酚可以影響兔子機體的氧化與抗氧化系統。參考文獻1 范奇元，丁訓城，蔣學之等，消化道攝入壬基酚在大鼠體內的分布與清除J環境與職業醫學，2002，19（2）：2282302 楊再福，趙曉祥環境雌激素對水生動物的影響研究進展J生態環境200514（1）：1081123 Zou E Current status of environmental endocrine disrupti

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