1、SPA的純化、表達與鑒定中文摘要： 該實驗用大腸桿菌做表達載體，然后用IPTG誘導大腸桿菌表達SPA，破碎大腸桿菌提取SPA后用鎳柱純化，再運用SDS-PAGE、雙向免疫擴散法、western blotting等方法對表達的蛋白質進行鑒定，其中制備免疫血清（抗SPA免疫血清）選取的動物為雄性健康成年的家兔。中文關鍵詞：SPA、SDS-PAGE、western blotting、雙向免疫擴散。前言1. SPA的背景SPA即(Staphylococcal protein A,SPA)葡萄球菌A蛋白，是葡萄球菌細胞壁的一種表面蛋白(單鏈多肽),能與人及某些哺乳類動物的IgG分子的Fc段發(fā)生非特異性結

2、合,SPA與IgG結合后的復合物具有抗吞噬,促細胞分裂,致超敏反應和損傷血小板等活性.（一）SPA的主要存在部位SPA存在于大多數(shù)（90）金黃色葡萄球菌中，而不存在于表皮葡萄球菌中；并且主要存在于血漿凝固酶陽性菌株，而不存在于陰性菌株中。前者是致病的，后者是非致病的，但在體內研究中尚未發(fā)現(xiàn)SPA和菌株致病性之間有任何肯定的關系。不同菌株間的SPA含量有明顯差異，以I株金黃色葡萄球菌含SPA量最高，和細胞壁的肽聚糖呈共價結合。抗二甲氧基苯青霉素突變株（methicillin-resistant strain）能產生分泌SPA，它較之細胞壁所含的SPA在免疫學性質上相似，但易分離，損失少。（二）S

3、PA的相對分子質量及等電點SPA為蛋白質成分，僅含少量或不含碳水化合物，其相對分子質量因提取方法不同而異，用脫氧核糖核酸酶消化細胞壁后超速離心或用加熱抽提法，所測相對分子質量為1200015000。用沉淀平衡分析和在6molL鳥嘌呤鹽酸中凝膠過濾，測出相對分子質量為42000。SPA為單鏈多肽，內含3個高度相似的Fc段結合區(qū)，每區(qū)由50個以上的氨基酸組成，不含色氨酸和半胱氨酸。其羧基末端是賴氨酸，氨基末端結構尚未肯定。SPA黏度高于球蛋白，等電點（pi）為51，其天然結構十分穩(wěn)定，在應用6 molL鳥嘌呤鹽酸變性劑的條件下，尚能保存某些三級結構，如將變性劑除去，則能自然矯正而恢復原有結構。（三

4、）SPA的免疫學特性   SPA具有和人及許多動物（如豚鼠、豬、小鼠、猴等）IgG結合的能力。SPA結合部位是Fc段而不是Fab段，這種結合不會影響抗體的活性。SPA具有的結合力是雙價的，每個SPA分子可以同時結合2個IgG分子，也可一方面同IgG相結合，一方面與標記物如熒光素、酶（HRP、AKP和GO等）、膠體金和鐵蛋白等相結合。還有一個饒有興趣的事實是，與SPA結合后IgG可用4molL鳥嘌呤鹽酸等使之解離。利用這一生物化學特性，可以將SPA交聯(lián)在葡聚糖凝膠上，對抗原或抗體蛋白質進行純化。SPA對IgG免疫球蛋白亞型的結合有選擇性，如SPA與人IgG亞型IgG

5、l、IgGz和IgG4有結合力，唯獨不結合IgG3；只結合IgH2，而不結合IgHl。SPA與人及大部分哺乳動物血清中的IgG結合，能反應的動物包括豚鼠、小鼠（純種）、狗、豬、猴和經免疫的家兔等。其結合部位為免疫球蛋白的CH2和Cn3的交界處。另外，它還能與少數(shù)血清中的IgM結合。SPA還能激活和固定補體，激活B淋巴細胞，促使其成熟并分泌產生各類免疫球蛋白。（四）SPA的生物學特性1免疫原性與過敏原性：SPA做為免疫原能刺激免疫活性細胞合成Ig，又能與其相應抗體的Fab段結合呈現(xiàn)抗原抗體的特異性反應。SPAIgG注射家兔皮下可引起Arthus樣反應，還可引起豚鼠的遲發(fā)性超敏反應。SPA體外試驗

6、，能刺激豚鼠離體回腸收縮。 2抗吞噬作用：由于IgG的Fc段結合點既是lgG調理活性結合點，又是SPA反應點。因此，SPA可與吞噬細胞競爭，結果抑制了多形核白細胞的吞噬作用，也可能是SPA阻斷調理素與吞噬細胞作用的結果。 3固定補體：SPAIgG和免疫復合物一樣可以固定人和某些動物(如豚鼠、豬、狗等)血清中的補體，主要是通過補體傳統(tǒng)激活途徑。 4促有絲分裂因子：SPA是一種B細胞激活劑，固相SPA作用明顯，并不需要T細胞輔助,可容性SPA作用微弱，必須有T細胞參與。 5去封閉作用：固相SPA能部分去除腫瘤病人和帶瘤動物血清中的封閉活性，從而降低了血清對淋巴細胞介導的細胞毒的封閉作用。（五）SP

7、A的應用1應用于免疫球蛋白的制備和分析：SPA是一種比較理想的提純和分析免疫球蛋白的試劑。由于SPA與IgG及其某些亞型的Fc段有較強的結合力，可利用來提純、分析免疫球蛋白制劑，結合后的PSAIgG可再用解離劑如4mol/L尿素、4mol/L，硫氰酸鹽或6mol/L的鳥嘌呤鹽酸鹽使之解離，多用SPASepharose 層析柱分離IgG或其亞型及斷片如Fc、Fab等。2應用于免疫細胞化學：由于SPA具有雙價結合力，在免疫細胞化學技術中可作為橋抗體或標記抗體。由于SPA能與多種動物的IgG的Fc段結合，因此，作為第二抗體或標記抗體，SPA的最大優(yōu)點是不受種屬特異性的限制，故在目前各種免疫細胞化學技

8、術中已得到廣泛的應用。除不受種屬限制這一特點外，SPA法還具有染色時間短、靈敏性高和背景染色淡等優(yōu)點。據(jù)報告用國產酶聯(lián)SPA代替酶標記抗體，應用間接染色，時間較PAP法省時一半。SPA分子量小（1300042000），易于穿透組織，而免疫球蛋白酶標記抗體為200000，PAP復合物為430000，均較SPA分子量大。3應用于多種細菌、支原體和病毒等病原體的簡易快速診斷可應用SPA菌體作為載體，結合特異性抗體成為一種吸附原，作協(xié)同凝集劑，用于某些細菌和病毒的定群和分型。4可作為一種研究免疫復合物、膜抗原、膜受體和膜Ig的固相吸附劑Hallgsen用同位素標記SPA測定血IgG的凝集物，發(fā)現(xiàn)85%

9、全身性紅斑狼瘡和42%類風濕病人血清中凝集物增高。SPA用于細胞膜抗原、表面IgG和Fc受體的研究最大特點是能研究活細菌。Ghetie（1976）用SPA致敏綿羊紅血球，與經IgG處理的細胞形成玫瑰花環(huán)，來鑒定帶Fc受體的細胞，反之，如用SPA抑制玫瑰花環(huán)形成，則可定量測定細胞表面的IgG。應用SPA與膠體金或鐵蛋白相結合，可在電鏡水平檢查抗原抗體反應的定位。特別是蛋白A膠體金技術（Protein AGold technique, PGA技術）自Pomano和Romano（1977）首次報告用于標記細胞表面抗原、包括淋巴細胞、血小板、大鼠腎臟細胞及感染的病毒細胞獲得成功以后，已得到愈來愈廣泛的

10、應用，是一種較為理想的免疫電鏡技術。實驗原理1 SPA的原核表達大腸桿菌表達的基本概念：一個完整的表達系統(tǒng)通常包括配套的表達載體和表達菌株，如果是特殊的誘導表達還包括誘導劑，如果是融合表達還包括純化系統(tǒng)或者Tag檢測等等。選擇表達系統(tǒng)通常要根據(jù)實驗目的來考慮，比如表達量高低，目標蛋白的活性，表達產物的純化方法等等。主要歸結在表達載體的選擇上。表達載體：我們關心的質粒上的元件包括啟動子，多克隆位點，終止密碼，融合Tag（如果有的話），復制子，篩選標記/報告基因等。通常，載體很貴，我們可以通過實驗室之間交換得到免費的載體。但是要小心，輾轉多個實驗室和多個實驗室成員之手的載體是否保持原來的遺傳背景？

11、MCS是否還是原來那個MCS？是我們要特別注意的。E.coli的乳糖操縱子（元）含Z、Y及A三個結構基因，分別編碼半乳糖苷酶、透酶和乙酰基轉移酶，此外還有一個操縱序列O、一個啟動序列P及一個調節(jié)基因I。I基因編碼一種阻遏蛋白，后者與O序列結合，使操縱子（元）受阻遏而處于關閉狀態(tài)。在啟動序列P上游還有一個分解（代謝）物基因激活蛋白（CAP）結合位點。由P序列、O序列和CAP結合位點共同構成lac操縱子的調控區(qū)，三個酶的編碼基因即由同一調控區(qū)調節(jié)，實現(xiàn)基因產物的協(xié)調表達 。在沒有乳糖存在時，lac操縱子（元）處于阻遏狀態(tài)。此時，I序列在PI啟動序列操縱下表達的Lac阻遏蛋白與O序列結合，阻礙RNA

12、聚合酶與P序列結合，抑制轉錄起動。當有乳糖存在時，lac操縱子（元）即可被誘導。在這個操縱子（元）體系中，真正的誘導劑并非乳糖本身。乳糖進入細胞，經b半乳糖苷酶催化，轉變?yōu)榘肴樘恰：笳咦鳛橐环N誘導劑分子結合阻遏蛋白，使蛋白構象變化，導致阻遏蛋白與O序列解離、發(fā)生轉錄。異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一種作用極強的誘導劑，不被細菌代謝而十分穩(wěn)定，因此被實驗室廣泛應用。  T7噬菌體具有一套專一性非常強的轉錄體系，利用這一體系中的元件為基礎構建的表達系統(tǒng)稱為T7表達系統(tǒng)。T7噬菌體基因編碼的T7 RNA聚合酶選擇性的激活T7噬菌體啟動子的轉錄。它是一種高活性的RNA聚合酶，其合成mRNA

13、的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以轉錄某些不能被大腸桿菌RNA聚合酶有效轉錄的序列。在細胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬菌體啟動子的情形下，大腸桿菌宿主本身基因的轉錄競爭不過T7噬菌體轉錄體系，最終受T7噬菌體啟動子控制的基因的轉錄能達到很高的水平。T7噬菌體啟動子的轉錄完全依賴于T7 RNA聚合酶，因此T7 RNA聚合酶的轉錄調控模式就決定了表達系統(tǒng)的調控方式。噬菌體DE3是噬菌體的衍生株，一段含有l(wèi)ac，lacUV5啟動子和T7 RNA聚合酶基因的DNA片段倍插入其int基因中，用噬菌體DE3的溶源菌，如BL21(DE3)、HMS174(DE3)等作為表達載體的宿主菌，調控方

14、式為化學信號誘導型，類似于Lac表達系統(tǒng)。2 SDS-PAGE檢測表達的蛋白質聚丙烯酰胺凝膠，是由丙烯酰胺單體（Acr）和少量的交聯(lián)劑N,N”-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）,在催化劑（過硫酸銨或核黃素，前者為化學聚合，后者為光聚合）和加速劑TEMED（N，N，N，N，四甲基乙二胺）的作用下聚合交聯(lián)成的三維網狀結構的凝膠。改變單體的濃度或單體與交聯(lián)劑的比例，可以得到不同孔徑的凝膠（孔徑大小可以通過改變單體Acr的濃度或單體與交聯(lián)劑的比例而控制）。蛋白質分子是兩性電解質分子，在直流電場內可以移動，PAGE過程中具有三種物理效應： （1）凝膠對樣品分子的篩選效應（分子篩效應） 顆粒小、呈球形的樣品分子移

15、動快，顆粒大、形狀不規(guī)則的分子通過凝膠孔洞時的阻力大，移動慢；（2）不連續(xù)系統(tǒng)對樣品的濃縮效應。凝膠層的不連續(xù)：濃縮膠的孔徑大，分離膠的孔徑小，在電場的作用下，蛋白質顆粒在大孔膠中泳動時的阻力小，移動快，而在小孔徑中，移動慢。因而在兩層凝膠交界處，由于凝膠孔徑的不連續(xù)性使樣品遷移受阻而壓縮成很窄的區(qū)帶。緩沖液離子成分及pH的不連續(xù)：在兩層凝膠中均有三羥甲基氨基甲烷（Tris）及HCI。Tris的作用是維持溶液的電中性及pH值，是緩沖配對離子，HCI在任何pH值溶液中均易解離出氯離子，它在電場中遷移率大，走在最前面，故稱為快離子或前導離子。電極緩沖液中的甘氨酸（Gly）在pH8.3的緩沖液中其解

16、離度很小，僅為0.11，因而在電場中遷移率很小，稱為慢離子或尾隨離子。血清中，大多數(shù)蛋白質等電點在5.0左右，在pH8.3或6.7時均帶負電荷，在電場中移向正極，其有效遷移率介于快慢離子之間，于是蛋白質就在快慢離子間形成的界面出，被濃縮成極窄的區(qū)帶。三者的有效遷移率為m氯氯> m蛋白蛋白> m甘甘（m為遷移率，為解離度），當進入pH8.9的分離膠時，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過蛋白質，因此氯離子及甘氨酸離子沿著離子界面繼續(xù)前進。蛋白質分子由于分子量大，被留在后面，然后分成多個區(qū)帶，因此分離膠之間pH的不連續(xù)性可控制其遷移率。在濃縮膠中要求慢離子較所有被分離樣品的有效遷移率低，

17、以使樣品在快慢界面之間被濃縮。進入分離膠后，慢離子的有效遷移率比所有樣品的有效遷移率高，使樣品不再受離子界面的影響。電位梯度的不連續(xù)性：電位梯度的高低與電泳速度的快慢有關。電泳開始后由于快離子遷移率大，就會很快超過蛋白質，在快離子后面形成一個離子濃度低的區(qū)域即低電導區(qū)。低的電導區(qū)就具有較高的電位梯度，而高的電位梯度又使蛋白質和慢離子在快離子后面加速泳動。當三者的遷移率與電位梯度的乘積彼此相等時，三者的泳動速度就相等。在快慢離子的移動速度相等的文臺建立后，二者之間形成一個穩(wěn)定而又不斷向陽極移動的界面。而蛋白質的有效遷移率在快慢離子之間，因此也就聚集在這個移動附近，被壓縮成一個狹小的中間層。（3）

18、電荷效應當進入pH8.9的分離膠后，各種血清蛋白質所帶靜電荷不同，而有不同的遷移率。表面電荷越多，則遷移快；反之則慢。因此各種蛋白質按電荷少，分子量大小及分子形狀以一定的順序排列形成一個個區(qū)帶。不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)所具備的電荷效應、分子篩效應和濃縮效應大大提高了它的分辨率。3 蛋白的提取與純化His-Tag融合蛋白是目前最常見的表達方式，而且很成熟，它的優(yōu)點是表達方便而且基本不影響蛋白的活性，無論是表達的蛋白是可溶性的或者包涵體都可以用固定金屬離子親和色譜去（IMAC）純化。IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography)是Porath

19、 et al.1975年用固定IDA作為配基的填料螯合過渡金屬銅、鎳、鈷或鋅離子，可以吸附純化表面帶組氨酸、色氨酸或半胱氨酸殘基的蛋白，1987年 Smithetal. 發(fā)現(xiàn)帶有幾個組氨酸或色氨酸小肽和螯合金屬離子的IDA-sephadex G-25作用力更強，此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadex G-25親和純化在氨基端帶組氨酸和色氨酸的胰島素原。同年1987年Hochuli et al.發(fā)現(xiàn)帶有相連組氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更強于普通的肽，1988年他第一次用這樣的方法純化了帶六個組氨酸標簽的多肽，無論是在天 然還是變性條件下一次親和純化都得到很

20、好效果，此后表達帶六個組氨酸標簽的蛋白配合IMAC變得非常普遍，相對而言，不帶標簽的蛋白純化就非常困難，所以 表達帶六個組氨酸標簽的蛋白配合IMAC純化變成最常用而且最有效的研究蛋 白結構和功能的有力手段。1986年Porath et al.還發(fā)現(xiàn)Fe3+-IDA-sephadex G-25可以用于磷酸化蛋白的純化，而后發(fā)現(xiàn)Ga3+-IDA也有同樣的效果，這樣螯合這兩種金屬離子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和純化，同時 IMAC也可以用于純化各種和金屬離子結合的多肽，應用非常廣泛。4免疫血清的制備及檢驗免疫血清的制備是一項常用的免疫學實驗技術。高效價、高特異性的免疫血清可作為免疫學診斷的試劑

21、(如用于制備免疫標記抗體等)，也可供特異性免疫治療用。免疫血清的效價高低取決于實驗動物的免疫反應性及抗原的免疫原性。如以免疫原性強的抗原刺激高應答性的機體，常可獲得高效價的免疫血清。而使用免疫原性弱的抗原免疫時，則需同時加用佐劑以增強抗原的免疫原性。免疫血清的特異性主要取決于免疫用抗原的純度。因此，如欲獲得高特異性的免疫血清，必須予先純化抗原。此外，抗原的劑量、免疫途徑及注射抗原的時間間隔等，也是影響免疫血清效價的重要因素應予重視。具有免疫原性的抗原可刺激機體相應B細胞增殖、分化形成漿細胞并分泌特異性抗體。由于抗原分子表面的不同決定簇為不同特異性的B細胞克隆所識別，因此由某一抗原刺激機體后產生

22、的抗體，實際上為針對該抗原分子表面不同決定簇的抗體混合物(即多克隆抗體)。另外，抗體的產生具有回憶應答的規(guī)律性，牨m現(xiàn)為初次免疫注射與再次免疫注射后的抗體應答特點截然不同。這是由于記憶性B細胞參與再次應答所致。5 western blottingWestern免疫印跡，是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測。與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽

23、類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。6 雙向免疫擴散法測定血清效價將抗原和相應抗體分別加入同一凝膠板中的相鄰小孔中，使兩者相互擴散，當擴散到它們的濃度達當量點時形成沉淀線。如果抗原-抗體濃度合適時，沉淀線在兩孔的中間，如抗體過量，沉淀線靠近抗原孔。如抗原過量，沉淀線靠近抗體孔。用雙擴散技術作定量測定時，應使用合適的沉淀條件。如抗原或抗體大大過量，由于溶解作用的改變和重新沉淀，可能產生沉淀遷移或多種沉淀物。

24、為了研究合適的抗原和抗體濃度，將血清放在中間孔中，一系列稀釋的抗原放在中間孔的周圍，此技術可以測定抗血清的效價。此外，根據(jù)沉淀融合的情況，還可以鑒定兩種抗原是否完全相同。在瓊脂中形成的沉淀線對相應的抗原和抗體是不可通過的，而對其它無關的抗原或抗體則可以通過。故兩種相同的抗原從兩孔擴散與第三孔擴散出來的相應抗體相遇時，將以一定的角度形成融合沉淀線。同樣，兩種不同的抗原與各自相同的抗體相遇時，則形成兩條交叉的沉淀線。兩種抗原部分相同的情況下，則形成部分交叉和部分融合的沉淀線。二、材料與方法2.1 實驗材料試劑1. 5*M9 鹽溶液 （V=100ml）：在去離子水中溶解以下鹽類，終體積為100ml。

25、Na2H2PO4·12H2O 8.55gKH2PO4 1.5gNaCl 0.25g(NH4)Cl 0.5g2. LB培養(yǎng)基（固體培養(yǎng)基加1g瓊脂）：在去離子水中溶解以下物質，終體積為100ml。 胰蛋白胨 1g 酵母提取液 0.5g NaCl 1g3. M9培養(yǎng)基：在750ml無菌水中（冷卻至50以下）加入5*M9鹽溶液： 200ml1mol/LMgSO4：2ml1mol/L CaCl2：0.1ml20%葡萄糖（細菌濾器除菌）：20ml4. 2M Tris-HCL(pH8.8),100mL稱取24.2g Tris堿，加50mL蒸餾水，緩慢的加濃鹽酸至pH8.8（約加4mL），讓溶液冷

26、卻至室溫，pH將會升高。加蒸餾水至100 mL。5. 1M Tris-HCL(pH6.8),100mL稱取12.1g Tris堿，加50mL蒸餾水，緩慢的加濃鹽酸至pH6.8（約加8mL），讓溶液冷卻至室溫，pH將會升高。加蒸餾水至100 mL。6. 10（W/V）SDS, 100mL稱取10g的SDS,加蒸餾水至總量100mL7. 50（V/V）甘油，100mL到取50mL 100的甘油，加入50mL蒸餾水。8. 1（W/V）溴酚藍，100 mL稱取100mg溴酚藍加蒸餾水至100 mL，攪拌直到完全溶解，過濾除去聚合的染料。9. A液：丙稀酰胺儲存液，100 30（W/V）丙稀酰胺，0.8

27、（W/V）雙丙稀酰胺。稱取29.2g丙稀酰胺 和0.8g雙丙稀酰胺加水至100 mL10. B液:4×分離膠緩沖液，100 mL75 mL 2M Tris-HCL(pH8.8) 1.5M/L4mL 10SDS 0.421mL蒸餾水11. C液：4×分離膠緩沖液，100 mL50 mL 1M Tris-HCL(pH6.8) 0.5M/L4mL 10SDS 0.446mL蒸餾水12. 10過硫酸銨，5mL0.5g過硫酸銨加到5 mL蒸餾水,可在密封管內，4存放數(shù)月。13. 電泳緩沖液，1L3g Tris堿 25mM14.4g 甘氨酸 192mM1g SDS 0.1%加蒸餾水至1

28、L，pH應該在8.3左右。14. 5×樣品緩沖液，10mL0.6mL 1M Tris-HCL(pH6.8) 60mM/L50（V/V）甘油 25%2mL 10SDS 20.5 mL2-巰基乙醇 14.4 mM/L1 mL1溴酚藍 0.10.9 mL蒸餾水可在4存放數(shù)周，或在20保存數(shù)月。15. X分離膠的計算（該方案適用于灌制分離膠）A液 X/3 mLB液 2.5 mL蒸餾水 （7.5X/3）mL10過硫酸銨 50µLTEMED 5µL總量 10mL16. 10過硫酸銨 和TEMED可以根據(jù)實際情況添加。 兩塊5堆積膠（6cm×8cm×0.75

29、cm），4ml蒸餾水 2.3mlA液 0.67mlC液 1.0ml10過硫酸銨 30µLTEMED 5µL17. 考馬斯亮藍染液，1L(過濾)考馬斯亮藍R250 1.0g甲醇 450mL蒸餾水 450mL冰醋酸 100 mL18. 考馬斯亮藍脫色液，1L甲醇 100 mL冰醋酸 100 mL蒸餾水 800 mL19. 30%丙烯酰胺/0.8% N,N-亞甲丙烯酰胺將30克丙烯酰胺和0.8克N,N-亞甲丙烯酰胺溶于總體積為60ml的水中，加熱至37溶解之，補加水至終體積為100ml。0.45m微孔濾膜過濾除菌，查證該溶液pH應不大于7.0，置棕色瓶中保存。小心：丙烯酰胺具有很

30、強的神經毒性并可通過皮膚吸收，其作用具有累積性。稱量丙烯酰胺和N,N-亞甲丙烯酰胺時應戴手套和面具。可認為聚丙烯酰胺無毒，但也應謹慎操作，因為它還可能含有少量未聚合材料。20. 4×TrisCl/SDS, pH8.8, 在300mlH2O中溶解91g Tris堿(1.5mol/L)，用1mol/L調節(jié)pH至8.8, 補加H2O至體積500ml。用0.45um濾膜過濾溶液，再加入2g SDS0.4%(w/v)，于4可保存1月。21. 4×TrisCl/SDS, pH6.8, 在40mlH2O中溶解6.05g Tris堿(0.5mol/L)，用1mol/L調節(jié)pH至6.8, 補

31、加H2O至體積100ml。用0.45um濾膜過濾溶液，再加入0.4g SDS0.4%(w/v)，于4可保存1月。22. 4×SDS電泳緩沖液Tris base 24.2 gGlycerin115.3 g20%SDS 20 ml加水至總體積1000ml。應用時稀釋4倍即為1×SDS電泳緩沖液(Tris 0.05M, Glycerin 0.38M, SDS 0.1%)。23. TEMED (N,N,N,N-四甲基乙二胺)TEMED通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺和N,N-亞甲丙烯酰胺的聚合。24. 10%過硫酸銨過硫酸銨提供驅動丙烯酰胺和亞甲丙烯酰胺聚合所必需的自由基。

32、可用去離子水配制小量10%(w/v)的貯存液并保存于4。由于過硫酸銨會緩慢分解，故應隔周新鮮配制。25. TBST配制： tris 1.21g；MaCl 8.8g；Tween20 0.5ml加水至1L或tris2.42g；NaCl 80g；tween20 1ml，ph7.6，加水至1L。 藥品IPTG、限制酶BamHI和HindIII溶菌酶、NaCl、磷酸緩沖液、鎳瓊脂糖凝膠FF或鎳NTA瓊脂糖凝膠FF、吐溫、巰基乙醇Tris、甘油、SDS、溴酚藍、丙稀酰胺、雙丙稀酰胺、2-巰基乙醇、過硫酸銨、TEMED、甘氨酸、鹽酸、考馬斯亮藍R250、甲醇、冰醋酸、標準蛋白marker活卡價苗(BCG)、

33、弗氏不完全佐劑(FIA)、弗氏完全佐劑乳化抗原(FCA-IgG)丙烯酰胺、N,N-亞甲丙烯酰胺、Tris、SDS、Glycerin、TEMED、過硫酸銨、馬斯亮藍、氯化鈉、氯化鎂、甲醇、2-巰基乙醇、溴酚藍、甘氨酸、BSA、吐溫、羊抗兔IgG-HRP等 菌種大腸桿菌BL21(DE3)pLysS 儀器離心機、搖床超聲波破碎儀、層析柱、紫外分光光度計、垂直板電泳槽、電泳儀垂直板電泳槽、電泳儀、移液器、微量移液器帶蓋搪瓷盤、凝膠成像系統(tǒng)。剪刀、鑷子、注射器、量筒、動物固定架、滅菌三角燒瓶(200ml)、手術器械一套、塑料放血管等垂直板電泳槽、轉移電泳槽、電泳儀、硝酸纖維素膜等2.2 方法步驟外源基因

34、的誘導表達（1）將大腸桿菌劃平板（LB-Amp+培養(yǎng)基），獲取單菌落。（2）挑單菌落于試管（5ml LB-Amp+培養(yǎng)基）中，37，150rpm,振蕩培養(yǎng)過夜。（3）次日，將5ml菌液接種入含100ml M9-Amp+培養(yǎng)基的錐形瓶中擴大培養(yǎng)，37，150rpm振蕩培養(yǎng)4-5小時，至細菌達到對數(shù)生長期。（取樣品A11 mL置于EP管中， 4，12000 r/min離心10 min收集細菌沉淀，棄去上清）( 6 ） 將擴大培養(yǎng)的菌種迅速進行低溫（冰水浴）冷卻5分鐘，于15，150rpm振蕩培養(yǎng)45分鐘后。加IPTG （終濃度為80mmol / L）誘導，繼續(xù)于15，150rpm振蕩培養(yǎng)4天。（取

35、樣品A21 mL置于EP管中， 4，12000 r/min離心5 min收集細菌沉淀，棄去上清）( 7 ）將上述培養(yǎng)液4，8000 r/min離心20 min，收集細菌沉淀4貯藏備用。 大腸桿菌細胞破碎樣品的處理對純化是很重要的，重要的原則是破碎要溫和，不能使蛋白斷裂或者降解，否則一些片段同樣也帶有標簽，這樣增加了純化的難度。需要注意的問題是超聲破碎溫度，強度，時間。破碎方法如下：（1）將收集的菌體沉淀加20ml破碎緩沖液(pH8.0的lys緩沖液)在冰上混合45分鐘，如果pH不在7-8，需要用0.5M NaOH一邊攪拌一邊滴加.（2）把混合菌體在冰水中用超聲探頭破碎3min,檢測pH,如果不

36、在7-8,還是用0.5M NaOH一邊攪拌一邊滴加去調.（3）破碎的液412000g離心20分鐘，這時候可以把上清和沉淀分別留樣，留作跑電泳檢驗。 SPA蛋白的純化（1）平衡緩沖液(pH值8.0的lys緩沖液)：pH8.0的50mM磷酸緩沖液含0.5M NaCl。（2）洗脫緩沖液1：pH值8.0的lys緩沖液含20mM咪唑。（3）洗脫緩沖液2：pH值8.0的lys緩沖液含200mM咪唑。（4）取1ml鎳瓊脂糖凝膠FF或鎳NTA瓊脂糖凝膠FF預裝柱，用10ml平衡緩沖液平衡，然后取破碎上清10ml樣品以0.5ml/min上樣，然后2ml/管分管收集。（5）用15ml平衡緩沖液洗去未吸附的樣品，流

37、速1-2ml/min，2ml/管收集（6）用5 ml洗脫緩沖液1洗去未吸附的樣品，流速1-2ml/min，2ml/管收集（7）用5 ml洗脫緩沖液2洗去未吸附的樣品，流速1-2ml/min，2ml/管收集。（8）再用10ml0.5mol/L的NaOH洗柱后，用平衡緩沖液平衡至pH值8.0，以備下次使用。（9）收集的部分可以用紫外分光光度儀測定蛋白的濃度，再取有蛋白的部分電泳檢測純度。 SDS-PAGE檢測表達的蛋白質一、灌制分離膠（1）組裝凝膠模具可按照使用說明書。裝配好灌膠用的模具。（2）將A液，B液及蒸餾水在一個小燒杯或試管中混合，丙稀酰胺（A液 中）是神經毒素，操作時必須戴手套。（3）加

38、入過硫酸銨和TEMED后，輕輕攪拌使其混勻（過量氣泡的產生會干擾聚合）。凝膠很快會聚合，操作要迅速。（4）小心將凝膠溶液用吸管沿隔片緩慢加入模具內，這樣可以避免在凝膠內產生氣泡。（5）當加入適量的分離膠溶液時（對于小凝膠，凝膠液加至約距離前玻璃板頂端1.5cm或距梳子約0.5cm，輕輕在分離膠溶液上覆蓋一層15mm的水層，這使凝膠表面變得平整。（6）等待3060min,使凝膠聚合。當凝膠聚合后，在分離膠和水層之間將會出現(xiàn)一個清晰的界面，可以微微傾斜模具，檢測凝膠是否聚合。二、灌制堆積膠（1）吸盡覆蓋在分離膠上的水。（2）將A液，C液和蒸餾水在三角燒瓶或小試管中混合。（3）加入過硫酸銨和TEME

39、D后，輕輕攪拌使其混勻。（4）將堆積膠溶液用吸管加至分離膠的上面，直至凝膠溶液到達前玻璃板的頂端。（5）將梳子插入凝膠內，直至梳子齒的底部與前玻璃板的頂端平齊。必須確保梳子齒的末端沒有氣泡。膠梳子稍微傾斜插入可以減少氣泡的產生。（6）約30min凝膠聚合。（7）凝膠聚合后，小心拔出梳子，不要將加樣孔撕裂。（8）將凝膠放入電泳槽內，如果使用Bio-Rad的微型凝膠系統(tǒng)，可預先接好電極。（9）將電泳緩沖液加入內外電泳槽中，使凝膠的上下端均能浸泡在緩沖液中。三、制備樣品和上樣（1）樣品制備a. 取培養(yǎng)物100ul于EP管，5000g×5min離心，棄上清，菌體加入40ul上樣緩沖液，100

40、水浴3min，待冷卻后10000g×10min離心，小心吸取上清，轉入另一標記好的EP管，室溫保存?zhèn)溆茫ㄈ玳L期放置，則置于-20保存，電泳前再煮沸2分鐘）。b. 將蛋白質樣品與5X樣品緩沖液（20l5l）在一個Ep管中混合。放入100加熱510min，離心，取上清點樣。（2）上樣用微量注射器將樣品加入樣品孔中。將蛋白質樣品加至樣品孔的底部。并隨著染料水平的升高而升高注射器針頭。同時加入標準蛋白marker，避免帶入氣泡，氣泡易使樣品混入到相鄰的加樣孔中。四、電泳（1）將電源插頭與適當?shù)碾姌O相接。電流應流向陽極。（2）將電壓調至200V（保持恒壓;對于兩塊0.75mm的膠來說，電流開始

41、時為100mA，在電泳結束時應為60 mA；對于兩塊1.5mm的膠來說，開始應為110 mA，結束時應為80 mA）；（3）對于兩塊0.75mm的凝膠，染料的前沿遷移至凝膠的底部約需3040min(1.5mm的凝膠則需4050min)；（4）關閉電源。（5）從電極上拔掉電極插頭。（6）從電泳槽中取除凝膠玻璃板。（7）小心移動兩塊玻璃板之間的隔片，將其插入兩塊玻璃板的一角。輕輕撬開玻璃板，凝膠便會貼在其中的一塊板上。五、考馬斯亮藍染色（1）戴上手套避免將手指印留在電泳膠上，將膠移如一個小的盛有少量考馬斯亮藍的容器內（小心不將膠撕破）。或將玻璃板連同凝膠浸在染料中輕輕振蕩直至凝膠脫落。（2）對于0

42、.75mm的凝膠，可在搖床上緩慢振蕩510min。對于1.5mm的凝膠，則需1020min，在染色和脫色過程中要用蓋子或封口膜密閉容器口。（3）棄去染液，將凝膠在水中漂洗數(shù)次。戴手套以避免將雙手染色。（4）加入考馬斯亮藍（約50mL），清晰的條帶很快會顯現(xiàn)出來，大部分凝膠脫色需要1小時，使用過的脫色液則可用水沖洗掉。為了脫色完全，需要數(shù)次更換脫色液并振蕩過夜。免疫血清的制備及檢測一、制備家兔抗SPA免疫血清（1）用剪刀剪去家兔兩后腳掌的部分兔毛，以酒精及碘酒消毒皮膚；（2）第一次免疫: 用2ml注射器吸取弗氏完全佐劑(FCA)乳化的抗原(SPA)下稱FCA-IgG液1ml，每側腳掌皮下各注入0

43、.5ml。（3） 第二次免疫：間隔10-14天后，于兩側窩及鼠蹊部腫大的淋巴結內注入FCA-IgG，每個淋巴結注0.1ml，其余注入淋巴結附近皮下共1ml。如淋巴結未腫大或腫大不明顯時，直接注入兩側窩及鼠蹊部皮下。（4）間隔7-10天后，從耳靜脈采血0.51.0ml，分離血清，以雙相瓊脂擴散試驗測定免疫血清的抗體效價(即試血)。效價至少應達到一定比例時才能放血。二、心臟采用血法（1）家兔仰面，四肢縛于動物固定架上(或由助手抓住四肢固定)；（2）剪去左胸部兔毛，消毒皮膚；（3）用左姆指摸到胸骨劍突處，食指及中指放在右胸處輕輕向左推心臟，并使心臟固定于左胸側位置。然后，以左拇指觸摸心臟搏動最強的部

44、位；（4）用50ml注射器(連接16號針頭)，傾針45°角度，對準心搏最強處刺入心臟抽血致死；（5）將抽取的血液立即注入無菌三角燒瓶中，待凝固后分離血清。三、分離血清將三角燒瓶的血置37溫箱1小時，再置4冰箱內34小時。待血液凝固血塊收縮后，用毛細滴管吸取血清。于3000rpm離心15分鐘，取上清加入防腐劑(0.01硫柳汞或0.02疊氮鈉，最終濃度)，分裝后置4冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｋ摹⒔Y果鑒定以雙相瓊脂擴散試驗測定所獲免疫血清的抗體效價，并用瓊指免疫電泳鑒定免疫血清中抗體的質量，應產生單一的沉淀弧線。（1）將盛有3ml生理鹽水瓊脂的小試管置水浴中熔化。（2）將熔化好的瓊脂小心倒入已調好水

45、平的培養(yǎng)皿中，厚度為1mm。（3）瓊脂凝固后，按模板打孔，孔內的瓊脂如未被吸出則可用牙簽挑出，中心孔為加抗原的孔，四周的個孔為加抗體的孔，孔徑3mm，孔距4mm。打孔后將培養(yǎng)皿于酒精燈上烤背面（溫度不宜過高，以不燙手為宜），使瓊脂與玻片粘緊。（4）將兔抗人IgG按二倍稀釋法稀釋成1:2、1:4、1:8、1:16、1:32的不同濃度。（5）從上到右到下到左的順時針方向將不同濃度的抗體定量加入周圍五孔，第六孔加生理鹽水作為對照（千萬不要溢出或漏在瓊脂膠上）。（6）小心將培養(yǎng)皿放入濕盒內，置37溫箱，經24小時擴散，第二天觀察。（7）觀察沉淀帶的出現(xiàn)情況并拍下照片，在有沉淀出現(xiàn)的稀釋抗體中，稀釋倍數(shù)

46、最大的一孔的抗體稀釋倍數(shù)即為抗體效價。 western blotting一、western blotting 實驗試劑配制方法：1）30%丙烯酰胺/0.8% N,N-亞甲丙烯酰胺將30克丙烯酰胺和0.8克N,N-亞甲丙烯酰胺溶于總體積為60ml的水中，加熱至37溶解之，補加水至終體積為100ml。0.45m微孔濾膜過濾除菌，查證該溶液pH應不大于7.0，置棕色瓶中保存。小心：丙烯酰胺具有很強的神經毒性并可通過皮膚吸收，其作用具有累積性。稱量丙烯酰胺和N,N-亞甲丙烯酰胺時應戴手套和面具。可認為聚丙烯酰胺無毒，但也應謹慎操作，因為它還可能含有少量未聚合材料。2）4×TrisCl/SDS

47、, pH8.8, 在300mlH2O中溶解91g Tris堿(1.5mol/L)，用1mol/L調節(jié)pH至8.8, 補加H2O至體積500ml。用0.45um濾膜過濾溶液，再加入2g SDS0.4%(w/v)，于4可保存1月。3）4×TrisCl/SDS, pH6.8, 在40mlH2O中溶解6.05g Tris堿(0.5mol/L)，用1mol/L調節(jié)pH至6.8, 補加H2O至體積100ml。用0.45um濾膜過濾溶液，再加入0.4g SDS0.4%(w/v)，于4可保存1月。4）4×SDS電泳緩沖液Tris base 24.2 gGlycerin115.3 g20%S

48、DS 20 ml加水至總體積1000ml。應用時稀釋4倍即為1×SDS電泳緩沖液(Tris 0.05M, Glycerin 0.38M, SDS 0.1%)。5）TEMED (N,N,N,N-四甲基乙二胺)TEMED通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺和N,N-亞甲丙烯酰胺的聚合。6）10%過硫酸銨過硫酸銨提供驅動丙烯酰胺和亞甲丙烯酰胺聚合所必需的自由基。可用去離子水配制小量10%(w/v)的貯存液并保存于4。由于過硫酸銨會緩慢分解，故應隔周新鮮配制。7）TBST配制： tris 1.21g；MaCl 8.8g；Tween20 0.5ml加水至1L或tris2.42g；NaCl

49、80g；tween20 1ml，ph7.6，加水至1L。二、SDS-PAGE、轉膜及顯色1）按廠商的使用指南用兩塊干凈的玻璃，平板和0.75mm墊片組裝電泳裝置中的玻璃平板夾層，并固定在灌膠支架上。2）按表12.1配制分離膠液體并脫氣，然后加入10的過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌混勻。表12.1 聚丙烯酰胺分離膠的配制試劑成分 配制不同濃度分離膠所需試劑(ml)5% 8% 10% 12% 15%Acry:Bis (30:0.8) 2.50 4.00 5.00 6.00 7.504×TrisCl/SDS,pH8.8 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75H2O 8.75 7.

50、25 6.25 5.25 3.7510%過硫酸銨 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05TEMED 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01按所需分離的蛋白質分子大小選擇合適的丙烯酰胺百分比濃度，一般地，5的凝膠可用于60200kDa的SDS變性蛋白質分子的分離，10用于1670kDa，15用于1245kDa。3）用一根巴斯德吸管立即將分離膠液體沿夾層中一條墊片的邊緣加入于玻璃平板夾層中，至凝膠約5cm高為止。樣品體積少于10l不需灌制積層膠。4）用另一根已斯德吸管，先從一邊的墊片，再從另一邊墊片往夾層的液面頂部緩緩加入一層水飽和異丁醇（厚約1cm）。讓凝膠在室溫聚合30mi

51、n。聚合后，可見在頂層異丁醇與凝膠的界面間有一清晰的折光線，膠的聚合失敗往往問題在于過硫酸按或TEMED，或兩者都有。5)傾去頂層的異丁醇，并以1×Tris-Cl/SDS, pH8.8緩沖液沖洗凝膠的頂部表面,盡量用吸水紙吸干。6)按表12.2配制積層膠液體，用吸管將液體沿一條墊片加入到玻璃平板夾層，直至夾層的頂部。表12.2 聚丙烯酰胺積層膠的配制GEL%（3.9%) Total (10.05ml)Acry:Bis(30:0.8) 1.30 ml4×TrisCl/SDS, pH6.8 2.50 mlH2O 6.10 ml10%過硫酸銨 0.05 mlTEMED 0.01

52、ml7)將0.75mm厚的梳子插入夾層的積層膠液體中，必要時，再補加積層膠液體充盈剩余空間。讓積層膠室溫聚合30min。8)在具螺口蓋的微量離心管中，用2×SDS加樣緩沖液按1:1(v/v)稀釋待測蛋白質樣品，于100煮沸5-10min。如樣品是蛋白質沉淀物，加入50100l 1×SDS加樣緩沖液溶解之，并同樣在100煮沸5-10min。按供應商的使用指南用2×SDS加樣緩沖液溶解蛋白質分子量標準混合物。對于0.3cm寬的加樣孔，推薦加樣體積以不超過20l 為宜。用考馬斯亮藍染色法顯跡，成分很復雜的蛋白質混合物需加2550g，而樣品中只有一種或不多的幾種蛋白的話，只需110g蛋白量。采用銀染顯跡時，樣品用量可減小10100倍（按樣品的復雜程度在小于20l的體積溶有0.010.5ng蛋白樣品不等）。2×SDS加樣緩沖液(loading buffer)配制：成分 體積 (ml)0.5M TrisCl (pH6.8) 12.520%SDS 11.5Glycerin 102%