1、實驗一 實驗動物的一般操作技術一、 實驗目的學習食品毒理學試驗中有關動物試驗的基本操作技術，掌握實驗動物的選擇，性別鑒定，抓取方法，標記方法，染毒方法，生物材料采集和實驗動物處死等技術。二、器材與試劑苦味酸酒精飽和溶液、美藍溶液、0.9的NaCl溶液托盤天平、電子天平、棉簽、1mL注射器、灌胃器、燒杯、容量瓶、定量取血管、玻璃毛細管、鼠籠昆明種小鼠三、操作方法（一） 實驗動物的選擇食品毒理學研究中，無論應用何種種屬、品系的實驗動物，都必須是健康動物。動物的選擇，應重點檢查下述項目。1. 外觀 體形豐滿，被毛濃密光順，行動敏捷，反應靈活。2. 眼睛 明亮，瞳孔清晰，雙側等圓，眼內無分泌物，眼瞼無

2、腫脹、發紅。3. 耳 耳道無分泌物溢出，耳殼無膿瘡、糜爛。4. 鼻 無噴嚏，無漿性黏液分泌物。5. 皮膚 無創傷、膿瘡、疥癬、濕疹。6. 頭頸部 姿勢端正。頸項歪斜提示可能存在內耳疾患，不能用于實驗。7. 消化道 無嘔吐、便秘、腹瀉，糞便成形，肛門附近被毛潔凈。8. 神經系統 無震顫、麻痹、運動失調，如有轉圈運動或倒提時呈圓圈擺動，不能用于實驗。9. 四肢及尾 四肢、趾及尾無紅腫、潰瘍。10. 食欲及營養 良好（二） 實驗動物的性別鑒定1. 大鼠、小鼠 主要觀察肛門與生殖孔的間距，雄性間距大，而雌性間距小；雄鼠夏天或臥位可見睪丸，雌鼠腹部有明顯乳頭，大鼠6對，小鼠5對。（三） 實驗動物的抓取和

3、固定實驗前應了解動物的一般習性，正確抓取和固定動物，既要大膽，又要細心。 1. 小鼠的抓取方法 先用右手抓取鼠尾部提起，置于實驗臺上向后拉，在其向前爬行時，用左手拇指和食指抓取小鼠的兩耳和頸部皮膚，將鼠體置于左手手心中，以無名指按住鼠尾根部，小指按住后腿即可。右手則可進行灌胃或注射等操作。（四） 實驗動物的稱重、編號和標記1. 稱重 一般同一組內，同性別動物體重差異應小于平均體重的10，組間同性別動物體重平均值相差應小于5。2. 編號和標記（1） 染色法 一般采用不同顏色的染料涂擦于動物不同部位的被毛染色，表示不同號碼，此法適用于大鼠、小鼠和豚鼠。常用的染料有苦味酸酒精飽和液（黃色）、美藍溶液

4、（藍色）或甲基紫酒精飽和液、0.5中性紅或品紅溶液（紅色）等。具體方法為：頭部為1號，按順時針方向，右前肢2號、右肋3號、右后肢4號、尾跟5號、左后肢6號、左肋7號、左前肢8號、背部9號；在相應部位涂染另一種顏色染料表示十位，兩種顏色可編199號。（五） 實驗動物的染毒途徑和方法1. 經口染毒（1） 灌胃 將毒物不經口腔和食道，直接灌入胃內。急性毒性試驗多用此法。具體方法：用帶有灌胃器的適當容積注射器吸取所需的受試液（溶液、混懸液、乳液）備用。小鼠保定，一手緊抓住耳后、頸部皮膚，用無名指、小指和大魚際肌壓緊尾根部。將動物固定成垂直體位，腹部面向操作者，使上消化道固定呈一直線。另一手持注射器，將

5、針頭由動物口腔側插入，避開牙齒，沿咽后壁緩緩滑入食道。若遇阻力，可輕輕上下滑動探索，當感到阻力消失時，即將針頭深入至胃部。如動物掙扎，應停止進針或將針頭拔出，千萬不能強行插入，以免損傷、穿破食道，甚至誤入氣管，導致動物立即死亡。進針深度一般是小鼠2.5cm。為驗明灌胃針是否正確地插入胃部，可輕輕回抽注射器，如無氣泡抽出表明已在胃中，可將受試液推入。（2） 喂飼 將受試化學物均勻拌入飼料或溶于飲水中，由動物自由采食。適用于染毒時間較長的毒性試驗，如亞慢性和慢性毒性試驗。（3） 吞咽膠囊 將所需劑量的受試化學物裝入膠囊內，強制動物咽下。適用于易揮發、易水解和有異味的化學物，兔、犬、貓可用此法。2注

6、射染毒 外源化學物的毒性研究中，根據試驗目的和需要，可選擇腹腔注射、靜脈注射、肌肉注射、皮下注射等途徑染毒。大鼠和小鼠經尾靜脈注射，兔則經耳靜脈注射。（六） 實驗動物生物材料的采集和制備毒理學研究中，常常需要采集動物的血液、尿液或組織，測定外源化學物或其代謝物的濃度。因此，生物材料的采集和制備是毒理學研究重要的基本操作技術。1大、小鼠采血（1）鼠尾采血。 適用于用血量較少的試驗。固定動物后，將鼠尾浸入4550溫水，使尾靜脈充血，擦干，用酒精棉球消毒。將尾尖剪去約23mm, 拭去第一滴血，用血色素吸管（吸管內加抗凝劑與否，依試驗需要而定）吸取定量尾血，然后用干棉球壓迫止血。如需要多次采血，可用火

7、棉膠涂封，下次采血時去掉火綿膠。鼠尾采血亦可用1ml注射器連接56號針頭直接刺入尾靜脈定量采血。（2）斷頭采血。操作者一手握住動物，另一手持剪刀或斷頭鉗快速斷頭，倒立動物將血液滴入容器，注意防止斷毛落入容器中。用于大鼠、小鼠。（3）摘眼球采血。動物倒立，使眼球外突充血，用小鑷迅速摘掉眼球，將血液滴入事先備好的容器內。此法用于鼠類大量采血，僅使用一次。（七） 實驗動物的處死方法1. 頸椎脫臼法 多用于小鼠，一手按住鼠頭，另一手抓住鼠尾猛力向后拉，使動物頸椎脫臼，立即死亡。2. 斷頭法 用于大鼠和小鼠。保定者一手按住鼠頭，另一手握住背部，露出頸部，助手持大剪刀或斷頭器剪斷頸部，使之死亡。此法不引起

8、血漿皮質酮、兒茶酚胺升高，常用于血液及化學成分、組織酶測定。3. 擊打法 適用于較小的動物。抓住鼠尾、提起，用力摔打其頭部，鼠痙攣后立即死亡；也可用器具擊打動物頭部，使其致死。前法多用于小鼠，后法多用于大鼠和家兔。4. 其他 電擊法、槍擊法、微波法等。動物處死方法多種多樣，原則是根據實驗需要進行選擇，同時盡量消除動物在試驗過程中所致的疼痛和不適，遵守動物試驗的職業道德。四、作業注明自己所選擇實驗動物的性別、體重及編號（畫圖說明）實驗二 小鼠骨髓細胞微核試驗一、實驗目的通過本次實驗，學習和掌握小鼠骨髓多染紅細胞（PCE ）微核測定方法。二、實驗原理微核試驗是用于染色體損傷和干擾細胞有絲分裂的化學

9、毒物的快速檢測方法。微核是指存在干細胞中主核之外的一種顆粒大小相當于細胞直徑的1/20-1/5，呈圓形或杏仁狀，其染色與細胞核一致，在間期細胞中可以出現一個或多個。一般認為微核是細胞內染色體斷裂或紡錘絲受到影響而在細胞有絲分裂后期滯留在細胞核外的遺傳物質。所以，微核試驗能檢測化學毒物或物理因素誘導產生的染色體完整性改變和染色體分離改變這兩種遺傳學終點。微核可以出現在多種細胞中，但在有核細胞中較難與正常核的分葉及核突出物相區別。由于紅細胞在成熟之前最后一次分離后數小時可將主核排出，而仍保留微核于PCE 細胞中，因此通常計數PCE 細胞中的微核。三、器材與試劑1器材 手術刀、手術剪、無齒鑷、小型彎

10、止血鉗、干凈紗布、帶橡皮頭吸管、臺式離心機、刻度離心管、晾片架、電吹風機、玻璃蠟筆、玻璃染色缸、2ml注射器及針頭、載玻片及推片、定時鐘、帶油鏡頭顯微鏡、細胞計數器。2試劑 甲醇（分析純）、甘油（分析純）、小牛血清、生理鹽水、Giemsa儲備液（取Giemsa染料，甘油66ml ，甲醇60ml 。先將染料置于研缽內，加入少量甘油混合研細，再分次傾入剩余的甘油繼續研磨，然后轉移至燒杯內，蓋上玻璃表面皿，置60 水浴2h ，取出待冷卻后加入甲醇，混合靜置2 周后，過濾于棕色瓶內，存放陰涼處。該儲備液存放的時間越長，染色效果越好。臨用時用pH6.8 磷酸鹽緩沖液配制為10的應用液、pH 6.8 的磷

11、酸鹽緩沖液。3陽性對照物 環磷酰胺。四、操作步驟1試驗動物及處理(l）動物選擇：一般常用的試驗動物為大、小鼠。以小鼠使用最為廣泛，要求體重18 g , 7-12 周齡。每組小鼠數量5只，雌雄各半。(2)染毒途徑：根據研究目的或受試化學毒物性質的不同，可分別選用經口、經皮、經呼吸道及注射等染毒途徑。但原則上應盡可能采用與入體接觸化學毒物相同的途徑。(3）染毒次數及取樣時間：研究證實化學毒物需在靶器官內蓄積至一定的濃度才具有致突變作用。波動范圍可以達到 24 -72h。這就要求在接觸化學毒物后設立不同的采樣時間點。考慮到以上兩方面的原因，建議采用多次染毒的方法。其中以4次染毒比較方便合理。即每天染

12、毒一次，連續4天，第5天取樣。(4）劑量選擇：受試化學毒物的最大劑量除受溶解度大小所限外，應達到最大耐受量。一般情況下，應設 3-5個或更多劑量組，劑量覆蓋的范圍要達到3個數量級以上。同時還應設立陽性對照組和陰性對照組。陽性對照組可用環磷酰胺（40mg/kg）腹腔注射 1 次或 2 次。陰性對照組用等體積的溶劑。2骨髓液的制備和涂片試驗動物最后一次染毒后，按確定的時間用頸椎脫臼或麻醉的方法將其處死，四肢固定于解剖板，將腹中線被毛浸濕，剖開胸腹部，取下胸骨，擦凈血污，用小型彎止血鉗將骨髓擠于有一滴小牛血清的清潔載玻片上 , 混合均勻后推片。也可在動物處死后，迅速用手術剪將其兩腿股骨取下，剔去肌肉

13、，用生理鹽水洗去血污和碎肉，剪去兩端的骨髓，取骨髓滴在清潔的載玻片上，推片。陽性及陰性對照組按上述方法同時進行處理。3固定將推好晾干的骨髓片放入染色缸中，用甲醇溶液固定 15min，取出晾干。不能及時染色的涂片也應固定后保存。4染色將固定晾干后的涂片，用新鮮配制的 Giemsa 應用液（Giemsa 儲備液 l 份加 pH6.8的磷酸鹽緩沖液9份）染色 10 - 15min ，然后沖洗掉玻片上的染色液，置晾片架上晾干5觀察計數先在低倍鏡下進行觀察，選擇分布均勻，染色較好的區域，再在油鏡下觀察計數PCE 細胞呈灰藍色，正染紅細胞（ NCE ）呈橘黃色。細胞中含有的微核多數呈圓形，邊緣光滑整齊，嗜

14、色性與核質一致，呈紫紅色或藍紫色。一個細胞內可出現一個或多個微核。計數 1000 個 PCE 中含微核的 PCE 數，并且計數 200 個細胞中 PCE 與 NCE 的比值。五、結果分析與評價每只動物為一觀察單位。每組的雌、雄動物分別計算微核 PCE 的均值。雌、雄動物之間無明顯的性別差異時可合并計算結果，否則應分別進行計算；正常的 PCE/NCE 比值約為 1（正常范圍為0.6-1.2）。如比值0. 01，則表示 PCE 形成受到嚴重抑制，受試化學毒物的劑量過大，試驗結果不可靠。陰性對照組和陽性對照組的微核發生率，應與試驗所用動物種屬及品系的文獻報道結果或者是與研究的歷史數據相一致。該試驗的

15、關鍵步驟是制作良好的骨髓涂片及優質的染色。六、作業計數 PCE 中的微核，微核率以千分率表示，并簡要分析陰性對照組和陽性對照組的微核發生率不同的原因。實驗二補充內容 細菌回復突變試驗1 范圍細菌回復突變試驗包括鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗和大腸桿菌細菌回復突變試驗。本標準主要規定鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗的基本技術要求，選擇大腸桿菌進行細菌回復突變試驗時應參閱有關文獻。本標準適用于評價食品生產、加工、保藏、運輸和銷售過程中所涉及的可能對健康造成危害的化學、生物和物理因素的致突變作用，檢驗對象包括食品及其食品原料、食品添加劑、新資源食品、輻照食品、食品相關產品(用于食品的包裝材料、容器、洗滌劑和用

16、于食品生產經營的工具、設備)以及食品污染物。2 術語和定義2.1 細菌回復突變試驗細菌回復突變試驗是以營養缺陷型的突變體菌株為指示生物檢測基因突變的體外試驗。常用的菌株有組氨酸營養缺陷型鼠傷寒沙門氏菌和色氨酸營養缺陷型的大腸桿菌。2.2 堿基取代型基因突變 指DNA多核苷酸鏈上某個堿基為另一個堿基取代，引起DNA堿基序列異常。2.3 移碼型基因突變指在DNA堿基序列中插入或缺失了一個或幾個（除了3和3的倍數）堿基，于是按三聯密碼連續閱讀的規則，該部位以后的密碼子組成全部改變，指導合成的多肽鏈也全部發生改變。3 原理/實驗目的檢測受試物對微生物（細菌）的基因突變作用，預測其遺傳毒性和潛在的致癌作

17、用。細菌回復突變試驗利用鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌來檢測點突變，涉及DNA的一個或幾個堿基對的置換、插入或缺失。鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌的試驗菌株分別為組氨酸缺陷突變型和色氨酸缺陷突變型，他們在無組氨酸或色氨酸的培養基上不能生長，在有組氨酸或色氨酸的培養基上才能正常生長。致突變物存在時可以回復突變為原養型，在無組氨酸或色氨酸的培養基上也可以生長。故可根據菌落形成數量來衡量受試物是否為致突變物。某些致突變物需要代謝活化后才能使上述細菌產生回復突變，受試物要同時在有和沒有代謝活化系統的條件下進行試驗。4 儀器和試劑4.1 儀器實驗室常用設備、低溫高速離心機、低溫冰箱（-80）或液氮罐、生物安全柜、恒

18、溫培養箱、恒溫水浴、滅菌設備、勻漿器等。4.2 試劑培養基成分或試劑除特殊說明外至少應是化學純，無誘變性。避免重復高溫處理，選擇適當保存溫度和期限，如肉湯保存于4不超過六個月，其它詳見下述各培養基及溶液內容。4.2.1 營養肉湯培養基牛肉膏2.5g，胰蛋白胨 5.0g，氯化鈉2.5g，磷酸氫二鉀（K2HPO4.3H2O）1.3g，加蒸餾水至 500mL，加熱溶解，調pH值至7.4，分裝后0.103 MPa 20min滅菌，普通冰箱保存備用，保存期不超過半年。4.2.2 營養肉湯瓊脂培養基瓊脂粉 1.5g，加營養肉湯培養基至 100mL，加熱融化后調節pH為7.4，0.103 MPa 20min

19、 滅菌。4.2.3 底層培養基在400mL滅菌的1.5瓊脂培養基（100 ）中依次加入磷酸鹽貯備液8mL, 40葡萄糖溶液20mL，充分混勻，待涼至80 左右時用于倒平皿。每平皿按25mL（相對于90mm平皿）制備平板，冷凝固化后倒置于37 培養箱中24小時，備用。磷酸鹽貯備液、40葡萄糖溶液和1.5瓊脂培養基配方如下：4.2.3.1 磷酸鹽貯備液(Vogel-Bonner minimal medium E, 50×)磷酸氫鈉銨（NaNH4HPO44H2O）17.5g，檸檬酸（C6H8O7H2O） 10.0g，磷酸氫二鉀（K2HPO4） 50.0g，硫酸鎂（MgSO47H2O） 1.

20、0g，加蒸餾水至100mL溶解（注：待其他試劑完全溶解后再將硫酸鎂緩慢放入其中繼續溶解，否則容易析出沉淀），0.103 Mpa 20min滅菌。4.2.3.2 40%葡萄糖溶液葡萄糖40.0g加蒸餾水至100mL，0.055 MPa 20min滅菌。4.2.3.3 1.5瓊脂培養基稱瓊脂粉6.0g加入400 mL三角瓶，加蒸餾水至400 mL，融化后，0.103 MPa 20min滅菌。4.2.4 頂層培養基加熱融化頂層瓊脂，每100 mL頂層瓊脂中加10mL 0.5 mmol/L組氨酸生物素溶液。混勻，分裝在4個燒瓶中，0.103 MPa 20min滅菌。用時融化分裝小試管，每管2mL，45

21、水浴中保溫。頂層瓊脂和0.5 mmol/L組氨酸生物素溶液配制如下。4.2.4.1 頂層瓊脂稱瓊脂粉3.0 g，氯化鈉2.5 g加蒸餾水至500 mL，0.103 MPa 20min滅菌。4.2.4.2 0.5 mmol/L組氨酸生物素溶液（誘變試驗用）稱D-生物素（分子量244）30.5 mg和L-組氨酸（分子量155）19.4 mg加蒸餾水至250 mL，0.103 MPa 20min滅菌。4.2.5 特殊試劑及培養基4.2.5.1 0.8氨芐青霉素溶液（鑒定菌株用，無菌配制）氨芐青霉素40 mg用0.02 mol/L 氫氧化鈉溶液稀釋至5 mL，保存于冰箱。4.2.5.2 0.1結晶紫溶

22、液（鑒定菌株用）100 mg結晶紫，溶于無菌水至100 mL。4.2.5.3 L-組氨酸溶液和0.5 mmol/L D-生物素溶液（鑒定菌株用）L-組氨酸0.4043 g和D-生物素12.2mg分別溶于蒸餾水至100mL，0.103 Mpa 20min滅菌，保存于4冰箱。4.2.5.4 0.8四環素溶液（用于四環素抗性試驗和氨芐青霉素-四環素平板）40 mg四環素用0.02 mol/L 鹽酸緩沖液稀釋至5 mL，保存于4冰箱。4.2.5.5 氨芐青霉素平板（用作TA97、TA98、TA100菌株的主平板）和氨芐青霉素四環素平板（用作TA102菌株的主平板）每1000 mL中由以下成分組成底層培

23、養基 980 mL，組氨酸水溶液（0.4043g/100mL）10 mL，0.5 mmol/L生物素 6 mL，0.8氨芐青霉素溶液 3.15 mL，0.8四環素溶液0.25 mL，四環素僅在使用對四環素有抗性的TA102時加入。以上成分均已分別滅菌或無菌制備。4.2.5.6 組氨酸生物素平板（組氨酸需要試驗用）每1000mL中由以下成分組成：底層培養基 984mL，組氨酸水溶液（0.4043/100mL） 10mL，0.5mmol/L生物素 6mL，以上成分均已分別滅菌。4.2.5.7 二甲亞砜（DMSO）：光譜純，無菌。4.2.6 陽性誘變劑的配制根據所選擇的誘變劑的種類和劑量用適當的溶劑

24、配制陽性對照品（見附錄B、C）。4.3 10% S9混合液的制備10% S9混合液由S9組分和S9輔助因子以適當比例組成，用作試驗中的活化系統。4.3.1 S9輔助因子的配制4.3.1.1鎂鉀溶液氯化鎂1.9 g和氯化鉀6.15 g加蒸餾水溶解至100 mL。4.3.1.2 0.2 mol/ L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）磷酸氫二鈉（Na2HPO4, 28.4g/L）440 mL，磷酸二氫鈉（NaH2PO4H2O, 27.6g/L）60 mL，調pH至7.4，0.103 MPa 20min滅菌或濾菌。4.3.1.3 輔酶-（氧化型）溶液無菌條件下稱取輔酶-，用無菌蒸餾水溶解配制成0.025

25、mol/L溶液，現用現配。4.3.1.4 葡萄糖-6-磷酸鈉鹽溶液無菌條件下稱取葡萄糖-6-磷酸鈉鹽，用無菌蒸餾水溶解配制成0.05 mol/L，現用現配。4.3.2 大鼠肝S9組分的誘導和配制選健康雄性成年SD或Wistar大鼠，體重150200 g左右，周齡約56周。將多氯聯苯（Aroclor1254）溶于玉米油中，濃度為200g/L，按500 mg/kg BW無菌操作一次腹腔注射，5天后處死動物，處死前禁食12h。也可采用苯巴比妥鈉和-萘黃酮聯合誘導的方法進行制備，經口灌胃給予大鼠苯巴比妥鈉和-萘黃酮，劑量均為80mg/kg，連續3天，禁食16h后斷頭處死動物。其他操作同多氯聯苯誘導。處

26、死動物后取出肝臟，稱重后用新鮮冰冷的0.15 mol/L氯化鉀溶液連續沖洗肝臟數次，以便除去能抑制微粒體酶活性的血紅蛋白。每克肝（濕重）加0.1 mol/L氯化鉀溶液3 mL，連同燒杯移入冰浴中，用消毒剪刀剪碎肝臟，在玻璃勻漿器（低于4000 r/min，往復12 min）或組織勻漿器（低于20000 r/min，1 min）中制成肝勻漿。以上操作需注意無菌和局部冷環境。將制成的肝勻漿在低溫（0 4 ）高速離心機上以9000 g離心10 min，吸出上清液為S9組分，分裝于無菌冷凍管或安瓿中，每安瓿2 mL左右，最好用液氮或干冰速凍后置-80 低溫保存。S9組分制成后，經無菌檢查，測定蛋白含量

27、（Lowry法），每毫升蛋白含量不超過40mg為宜，并經間接致癌物（誘變劑）鑒定其生物活性合格后貯存于深低溫或冰凍干燥，保存期不超過一年。4.3.3 10% S9混合液的制備一般由S9組分和輔助因子按1：9組成10%的S9混合液，也可將濃度配制成30（不同受試物所需S9濃度不同），臨用時新鮮無菌配制，或過濾除菌。10 S9混合液10mL配制如下：取上述：磷酸鹽緩沖液 6.0 mL， 鎂鉀溶液 0.4 mL 葡萄糖-6-磷酸鈉鹽溶液 1.0 mL， 輔酶-溶液 1.6 mL， 肝S9組分 1.0 mL，混勻，置冰浴中待用。用每皿0.5 mL S9混合液（含20µL 50 µL

28、 S9）測定其對已知陽性致癌物（誘變劑）的生物活性，確定最適用量，或者按一般用量，即每平皿0.5 mL S9混合液。5 菌株及其鑒定與保存5.1 試驗菌株 5.1.1 推薦菌株組合1推薦采用下列的菌株組合：a） 鼠傷寒沙門氏菌TA1535； b） 鼠傷寒沙門氏菌TA97a 或TA97 或TA1537； c） 鼠傷寒沙門氏菌TA98； d） 鼠傷寒沙門氏菌TA100； e) 鼠傷寒沙門氏菌TA102 或大腸桿菌WP2uvrA 或大腸桿菌WP2uvrA(PKM101)。5.1.2 推薦菌株組合2可采用四株鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100和TA102。5.2 菌株的鑒定5.2.

29、1 總則 菌株特性應與回復突變試驗標準相符。菌株的鑒定包括：基因型鑒定、自發回變數鑒定和對陽性致突變物敏感性的鑒定。每3個月進行一次菌株鑒定，遇到下列情況也應進行菌株鑒定：a) 在收到培養菌株后；b) 當制備一套新的冷凍保存或冰凍干燥菌株時；c) 重新挑選菌株時；d) 使用主平板傳代時；5.2.2 鑒定方法5.2.2.1 增菌培養在5 mL營養肉湯培養基中用接種環接種貯存菌培養物，37 振蕩（100 次/min）培養10小時或靜置培養16小時，使活菌數不少于12´109/mL。5.2.2.2 組氨酸缺陷型（his）的鑒定5.2.2.2.1 底層培養皿的制備加熱融化底層培養基兩瓶。一瓶

30、不加組氨酸，每100 mL底層培養基中加0.5 mmol分子D-生物素0.6 mL；另一瓶加組氨酸，每100mL底層培養基中加L-組氨酸1 mL和0.5 mmol分子D-生物素0.6mL。冷卻至50左右，每種底層培養基各倒兩個平皿。5.2.2.2.2 接種取有組氨酸和無組氨酸培養基平皿各一個，按菌株號順序各取一接種環的菌液劃直線于培養基表面，37 培養48小時。5.2.2.2.3 結果判定四株菌在有組氨酸培養基平皿表面各長出一條菌膜，在無組氨酸培養基平皿上除自發回變菌落外無菌膜，說明受試菌株確為組氨酸缺陷型。5.2.2.3 脂多糖屏障缺陷（rfa）的鑒定5.2.2.3.1 接種加熱融化營養肉湯

31、瓊脂培養基。取菌液0.1 mL移入平皿，迅速將營養肉湯瓊脂培養基（冷卻至50左右）適量倒入平皿，混勻，平放凝固。將無菌濾紙片一片放入已凝固的培養基平皿中央，用移液器在濾紙片上滴加0.1結晶紫溶液10 µL，37 培養24小時，每個菌株做一個平皿。5.2.2.3.2 結果判定陽性者在紙片周圍出現一個透明的抑制帶，說明存在rfa突變。這種變化允許某些大分子物質進入細菌體內并抑制其生長。TA97、TA98、TA100和TA102均有抑制帶，野生型鼠傷寒沙門氏菌沒有抑制帶。5.2.2.4 R因子（抗氨芐青霉素）的鑒定5.2.2.4.1 接種加熱融化營養肉湯瓊脂培養基，冷卻到50左右，適量倒入

32、平皿中，平放凝固，用移液器吸0.8的氨芐青霉素10 µL，在凝固的培養基表面沿中線涂成一條帶，待氨芐青霉素溶液干后，用接種環取各菌株菌液與氨芐青霉素帶相交叉劃線接種，并且接種一個不具有R因子的菌株作氨芐青霉素抗性的對照，37 培養24小時，一個平皿可同時鑒定幾個菌株。5.2.2.4.2 結果判定4個菌株經過24小時培養，在氨芐青霉素帶的周圍依然生長不受抑制，即有抗氨芐青霉素效應，證明它們都帶有R因子。5.2.2.5 四環素抗性的鑒定5.2.2.5.1 接種用移液器各吸取5µL10 µL 0.8的四環素溶液和0.8的氨芐青霉素溶液，在營養肉湯瓊脂培養基平皿表面沿中線

33、涂成一條帶，待四環素和氨芐青霉素溶液干后，用接種環取各菌株菌液與四環素和氨芐青霉素帶相交叉劃線接種TA102和一種有R因子的菌株（作四環素抗性的對照），37 培養24小時。5.2.2.5.2 結果判定TA102菌株生長不受抑制，對照菌株有一段生長抑制區，表明TA102菌株有抗四環素效應。5.2.2.6 uvrB修復缺陷型的鑒定5.2.2.6.1 接種在營養肉湯瓊脂培養基平皿表面用接種環劃線接種需要的菌株。接種后的平皿一半用墨紙覆蓋，在距15 W紫外線滅菌燈33 cm處照射8秒，37 培養24小時。5.2.2.6.2 結果判定對紫外線敏感的三個菌株（TA97、TA98、TA100）僅在沒有照射過

34、的一半生長，具有野生型切除修復酶的菌株TA102仍能生長。5.2.2.7 生物素缺陷型（bio）的鑒定5.2.2.7.1 底層培養皿的制備加熱融化底層培養基兩瓶。一瓶加生物素，每100 mL底層培養基中加0.5 mmol分子D-生物素0.6 mL和L-組氨酸1 mL；另一瓶不加生物素，每100 mL底層培養基中加L-組氨酸1 mL，冷卻至50 左右，每種底層培養基各倒兩個平皿。5.2.2.7.2 接種取有生物素和無生物素培養基平皿各一個，按菌株號順序各取一接種環的菌液劃直線于培養基表面，37培養48小時。5.2.2.7.3 結果判定四株菌在有生物素培養基平皿表面各長出一條菌膜，在無生物素培養基

35、平皿上除自發回變菌落外無菌膜，說明受試菌株確為生物素缺陷型。5.2.2.8 自發回變率的測定5.2.2.8.1 測定方法準備底層培養基平皿8個。融化頂層培養基8管，每管2mL，在45水浴中保溫。在每管頂層培養基中，分別加入待鑒定的測試菌株的菌液0.1mL，一式兩份，輕輕搖勻，迅速將此試管內容物倒入已固化的底層培養基平皿中，轉動平皿，使頂層培養基均勻分布，平放固化，37 培養48小時，計數菌落數。5.2.2.8.2 結果判定每一株的自發回變率應落在附錄A A.3所列的正常范圍內。5.3 菌株的保存鑒定合格的菌株應保存在深低溫（如-80 ），或加入9光譜級DMSO作為冷凍保護劑保存在液氮條件下（-

36、196 ）。無上述條件者可冰凍干燥制成干粉，4 保存。除液氮條件外，保存期一般不超過2年。主平板貯存在4，超過二個月后應丟棄（TA102除外，保存兩周后丟棄）。6 試驗設計及受試物的處理6.1 溶劑 溶劑要不與受試物發生反應，對所選菌株和S9沒有毒性，沒有誘變性。首選蒸餾水，對于不溶于水的受試物可選擇其他溶劑，首選DMSO(每皿最高添加量不超過0.1 mL）。也可選擇其他溶劑。6.2 劑量設計 決定受試物最高劑量的原則是受試物對試驗菌株的毒性和受試物的溶解度。進行預試驗有助于了解受試物對菌株的毒性和受試物的溶解度。對于無細菌毒性的可溶性受試物推薦的最高劑量是5 mg/皿或5 L/皿；對于溶解度

37、差的受試物，可以采用懸濁液，但溶液渾濁的程度（沉淀的多少）不能影響菌落計數。由于溶解度或者毒性的限制最大劑量達不到5 mg/皿或5 L/皿時，最高劑量應為出現沉淀或細菌毒性的劑量。評價含有潛在致突變雜質的受試物時，試驗劑量可以高于5 mg/皿或5 L/皿。對于需要前處理的受試物（如液體飲料、袋泡茶、口服液和輔料含量較大的樣品等），其劑量設計應以處理后的樣片計。 每種受試物在允許的最高劑量下設4個劑量組，包括加和不加S9兩種情況。按等比組距的原則設定劑量間隔，推薦采用倍組距。每個劑量應作3個平行皿。 一般受試物的最低劑量不低于0.2 g/皿。受試物應無菌，必要時以適當的方法滅菌或除菌。6.3 對

38、照組的設置 試驗應同時設陽性對照組、溶劑對照組和未處理對照組，包括加和不加S9種情況。陽性對照物要根據所采用的菌株進行選擇，并選擇合適的劑量以保證每次試驗的有效性，可參考附錄B、附錄C或其他資料。溶劑對照組的處理方法除不加入受試物外與處理組相同。當陽性致突變物采用DMSO溶解，而受試物不用DMSO溶解時，應同時做DMSO溶劑對照。6.4 含組氨酸受試物 對已知和經證實含有組氨酸并可能影響試驗結果的受試物必要時進行預處理（如經XAD-樹脂柱過濾）。7 試驗方法7.1 總則常用的實驗方法有平板摻入法、預培養平板摻入法和點試法等。7.2 平板摻入法7.2.1 將主平板或冷凍保存的菌株培養物接種于營養

39、肉湯培養基內，37 振蕩（100 次/min）培養10小時或靜置培養16小時，使活菌數不少于12´109/mL。7.2.2 底層培養基平皿，每個劑量加S9和不加S9均做3個平皿。7.2.3 融化頂層培養基分裝于無菌帶帽小試管（試管數與平皿數相同），每管2mL，在45水浴中保溫。7.2.4 在保溫的頂層培養基（試管）中依次加入測試菌株新鮮增菌液0.1mL，混勻；實驗組加受試物0.05 mL0.2mL（一般加入0.1mL，需活化時另加10 S9混合液0.5mL），再混勻，迅速傾入鋪好底層培養基的平皿上，轉動平皿使頂層培養基均勻分布在底層培養基上，平放固化；37培養48小時觀察結果，必要時

40、延長至72小時觀察結果。7.2.5 陽性對照組加入同體積標準誘變劑；溶劑對照組只加入同體積的溶劑；未處理對照組只在培養基上加菌液；其他方法同上。7.3 預培養平板摻入法預培養對于某些受試物可取得較好效果。因此可根據情況確定是否進行預培養。在加入頂層培養基前，先進行以下預培養步驟： a) 將受試物（需活化時另加10 S9混合液0.5 mL）和菌液，在37 中培養20 min，或在30 中培養30 min；b) 再加入2 mL頂層瓊脂.其他同上述平板摻入法。7.4 點試法7.4.1 同7.2.17.4.2 同7.2.27.4.3 同7.2.37.4.4 在水浴保溫的頂層培養基中依次加入測試增菌液0

41、.1 mL（需活化時另加10 S9混合液0.5 mL），混勻，迅速傾入底層培養基上，轉動平皿，使頂層培養基在底層分布均勻。平放固化后取無菌濾紙片（直徑約為6 mm），小心放在已固化的頂層培養基的適當位置上，用移液器取適量受試物（如10 µL），點在紙片上，或將少量固體受試物結晶加到紙片或瓊脂表面；37 培養48小時觀察結果。7.4.5 另作陽性對照組和溶劑對照組，分別在濾紙片上加入同體積標準誘變劑、溶劑，未處理對照組濾紙片上不加物質，其他步驟同上。8 數據處理與結果評價8.1 背景菌苔觀察和回變菌落計數 直接計數培養基上的回變菌落數，計算各菌株各劑量三個平皿回變菌落數的均數和標準差。

42、8.2 摻入法結果評價 在背景生長良好的條件下，測試菌株TA1535、TA1537、TA98和大腸桿菌的回變菌落數等于或大于溶劑對照組的3倍，其它測試菌株的回變菌落數等于或大于陰性（溶劑）對照組的2 倍，并具有以下兩種情況之一的可判定為陽性結果：a) 有劑量反應關系；b) 某一測試點有可重復的、有統計學意義的陽性反應。8.3 點試法結果評價 如在受試物點樣紙片周圍長出較多密集的回變菌落，與未處理對照相比有明顯區別者，可初步判定該受試物誘變試驗陽性，但應該用摻入法試驗來驗證。8.4 驗證 明顯的陽性結果不需要進行驗證；可疑的結果要改用其它的方法進行驗證；陰性結果需要驗證（即重復一次），應改變試驗的條件，如劑量間距（改為5倍間距）等。8.5 對照組結果評價陽性結果表明受試物對試驗菌株的基因組誘發了點突變。陰性結果表明，在該試驗條件下受試物對測試菌株不誘發基因突變。9 試驗報告9.1試驗名稱、試驗單位名稱和聯系方式、報告編號。9