1、醫學生念珠菌對唑類抗真菌藥耐藥機理及基相關因素的研究進展文字表述:關鍵詞:念珠菌唑類抗真菌藥耐藥摘要唑類抗真菌藥耐藥的念珠菌株呈現增多趨勢,許多學者從不同方面進行了研究。綜述念珠菌對唑類藥物的耐藥現象和耐藥產生的相關因素,以及對耐藥機理從基因水平進行研究的新進展。隨著抗真菌藥的臨床應用,耐藥菌株逐漸產生。近年來有關對真菌藥物耐受的念珠菌報道增多,已引起醫學界和藥學界廣泛關注,許多學者對此進行了深入探討和研究。一、念珠菌對唑類藥物的耐藥現象(一耐藥菌株的增多與傳播:HIV感染、器官移植、惡性腫瘤患者,由于免疫功能低下或抑制,易伴發條件致病性感染特別是真菌感染,60%80%艾滋病患者有一種或幾種真

2、菌感染。唑類藥物廣泛用于臨床治療和預防,由于長期反復和大劑量應用,耐藥菌株和發生率日趨升高。據報道法國Pasteur醫院和其它幾個研究中心1994年分離自艾滋病患者的念珠菌株10%對氟康唑耐藥1。而新近的統計資料顯示,在艾滋病患者口咽感染念珠菌中,33%以上是耐藥菌株,對氟康唑的最小抑菌濃度(MIC>12.5g/ml(敏感菌株MIC值一般<4g/ml2。Dromer等報道在10對已保持性關系專一并穩定1年以上的HIV陽性伴念珠菌感染的患者中,有13例口咽分離的感染菌株對氟康唑耐藥。從未用過唑類藥物的5例患者,其性伴感染的念珠菌株卻均對氟康唑有耐藥性。進一步通過DNA限制性片段長度多

3、態分析(RFLP發現,這些感染菌株具有很近的種系關系,上述10對性伴中有6對的分離菌具有一個以上的相同克隆片段,因此可認為耐藥菌株可以通過性伴傳播3。(二耐藥菌株對唑類藥物具有交叉耐藥性:HexiaoGang對分離自HIV感染者的212株白念珠菌(以下簡稱白念研究發現,多數菌株對氟康唑敏感,MIC值<2g/ml,這些菌株對伊曲康唑的MIC50及MIC90值也相應較低,范圍在0.05g0.1g/ml之間。另有61株對氟康唑敏感性較差,其MIC值為4g62g/ml,MIC50及MIC90值分別是8g/ml、64g/ml;同時測得伊曲康唑對這些菌株的MIC50和MIC90值分別是0.2g/ml

4、和0.4g/ml。由此可見,這些菌株不但對氟康唑不敏感,對伊曲康唑的MIC50和MIC90值也相應增高了約4倍。盡管臨床上尚未證實唑類藥物間的交叉耐藥性,但這項實驗室研究結果顯示了氟康唑與伊曲康唑間的交叉耐藥現象4。另有研究結果也支持這一論點,并進一步指出靶酶編碼基因和膜上轉運泵編碼基因的突變、缺失和過分表達是交叉耐藥產生的物質基礎5。(三耐藥現象導致了感染菌種的變遷:Price等對美國一家醫院1987至1992年5年間分離的念珠菌進行氟康唑體外敏感試驗,并對血標本中菌種的分布進行了氟康唑使用前后對比研究,發現MIC值具有明顯的種間差異,白念對氟康唑最敏感,而光滑念珠菌敏感性最差。這一結果與5

5、年間菌血癥致病菌種的變遷相一致。在氟康唑使用前和使用初期,白念感染率為87%,但到1992年(氟康唑已廣泛應用只占感染菌株的31%。在此期間,光滑念珠菌的感染率由2%升到26%;熱帶念珠菌從2%升到24% ;克柔念珠菌從9%升到20%。由此可見,隨著氟康唑廣泛應用,導致了念珠菌菌血癥致病菌向非白念的變遷6。然而并非所有學者認為臨床治療可導致酵母感染菌種變遷。Sobel在10余年的臨床實踐中,對許多念珠菌性陰道炎患者盡管長期給予酮康唑治療,但并未發現引起陰道炎的酵母菌種發生改變7。二、念珠菌對唑類藥物產生耐藥的相關因素(一細胞免疫低下或缺陷易導致耐藥菌株產生:對伴口咽念珠菌感染的HIV患者研究發

6、現,細胞免疫降低者對念珠菌有易感性,同時在這些患者身上也易發生耐藥現象。在臨床治療失敗的病例中,測其MIC值明顯升高,且在CD4細胞數<20l患者身上耐藥顯著高發,提示耐藥的產生除與氟康唑的長期應用有關外,CD4細胞數減少更易產生耐藥菌株8。Redding觀察1例反復發生口咽念株菌感染的患者,在2年反復14次治療中,氟康唑有效量由100mg/d快速升至800mg/d,MIC值亦由0.25g/ml上升到>64g/ml。其間測得患者CD4細胞數是9/l。在第15次再次發病時,氟康唑800mg/d已經無效9。有學者推斷,免疫系統嚴重缺陷可能阻止抗真菌藥物效應的正常發揮。(二藥物與機體感染

7、狀況對念珠菌耐藥有誘導作用:Vuffray等對口服氟康唑150mg/d已耐藥的口咽念珠菌感染的HIV患者改用更高劑量,其中91例次治療失敗者既往用藥的平均累積量是10600mg,而119例次治療有效的平均累積量是4400mg。兩者用藥累積量有顯著性差異(P<0.001。提示藥物的應用與菌株耐藥的產生密切相關10。Cameron等隨機選擇87例HIV陽性患者分組研究,對其中22例有口咽或食管感染癥狀和17例無癥狀的白念分離菌株進行唑類藥敏感試驗(兩組患者均有唑類藥應用史,兩組MIC值有非常顯著性差異(P<0.0001;前者高于后者。接著又對分別來自未經唑類藥治療的無癥狀和有癥狀患者的

8、分離菌株進行MIC值對比分析,其P值<0.0001,有癥狀者顯著高于無癥狀者。以上研究結果顯示藥物應用史和感染癥狀與唑類藥物對其致病菌株的MIC值升高顯著相關。作者又對其余非白念菌株進行上述對比研究,結論相同11。(三菌株的耐藥性可能經遺傳獲得:挪威學者對13株挪威念珠菌進行氟康唑藥敏試驗,其中11株分離自1990至1996年門診就醫的8例惡性病患者,其中僅2例有氟康唑治療史,另2株為60年前的保藏菌。結果對所有菌株MIC值均>32g/ml。60年前的保藏菌株和未經治療者的致病菌株亦出現耐藥現象,提示耐藥并非均為唑類藥物應用所誘導,菌株的耐藥性很可能具有遺傳性12。有研究推測這些耐

9、藥表型至少可以穩定600代13。因而,患者最初感染的可能即為具有遺傳穩定性的耐藥菌株,也可能在長期唑類藥臨床應用中由敏感菌株突變成為耐藥菌株。耐藥的產生與許多已知和未知的因素有關,但藥物的長期反復治療和預防應用起著關鍵作用。因此有學者指出應最大限度地避免上述用藥方式。并提出兩條防止和延緩耐藥產生的措施:短期大劑量用藥以盡快有效地殺滅真菌,降低耐藥突變的發生率。對于唑類耐藥的菌株,除了加大劑量外,適時換用其它藥物也是非常必要的14。三、念珠菌對唑類藥物的耐藥機理迄今為止,多數學者認為念珠菌對唑類藥物的耐藥主要通過以下三條途徑:細胞膜對唑類藥物通透性改變,細胞攝取和蓄積的藥物量降低。藥物作用的靶酶

10、C-14去甲基化酶(14DM產生過多。靶酶對藥物的親和力降低。后二條可歸納為唑類藥物作用靶酶的改變。通常認為,膜通透性的改變起更重要的作用。有學者對敏感和耐藥的光滑念珠菌研究發現,對3H標記的氟康唑,敏感菌株攝入率是0.33±0.02pmol/min,耐藥菌株幾乎不能顯示熒光攝入。同時測兩者IC50(50%inhibitionof incorporation值相近,IC50反映藥物對靶酶抑制作用,靶酶改變無明顯差異。說明膜通透性改變在耐藥產生中起關鍵作用15。(一對靶酶變化的研究:唑類藥物作用的靶酸是膜成分麥角固醇合成中不可缺少的中間合成酶,唑類藥物對此具有強的親和性,從而抑制酶的催

11、化活性,麥角固醇合成受阻,胞膜結構破壞,真菌生長抑制。靶酶結構改變以及其過度表達均可導致念珠菌耐藥,許多學者對這一耐藥機理進行了研究。從理論上講,靶酶編碼基因Erg16的擴增可致其過度表達。Sanglard等人用URA3-14DM雜交基因探針對分離自5例艾滋病患者的16株白念進行DNA分析,結果無論耐藥還是敏感菌株,其靶酶基因Erg16的拷貝數均無變化。因而推測靶酶的過度表達并非由基因Erg16的擴增所致。Sanglard又采用Northernblot方法對耐藥和敏感菌株靶酶的mRNA含量進行測定。發現大部分mRNA含量高的菌株,其MIC值相應增高。但有1株靶酶mRNA含量高的菌株,MIC值卻

12、顯著低于另1株mRNA含量低的菌株。因而僅用靶酶mRNA含量升高只能部分地解釋耐藥現象的產生16。由靶酶過分表達而耐唑類藥物的實驗室依據有待進一步深入探討。White曾對17株白念Erg16基因進行分析,該基因含有始動區域的5個片段(PAPE,編碼區域的7個片段和終止區域的3個片段(TATC。利用PCR-SSCP技術對這些片段擴增后行序列分析。與敏感菌株相對照,耐藥菌株在編碼區域第7片段近3'端的1547位點發生堿基突變,鳥嘌呤(G由腺嘌呤(A取代,相應地Erg16編碼蛋白質也發生改變,位于467位點的精氨酸(Arg由賴氨酸(Lys替代。這一位點正處于靶酶的活性中心,它改變了酶的活性,

13、也引起菌株對唑類的耐藥。對PE片段位點-367至-284序列分析發現,耐藥菌株可以有多處等位基因異質性(heterogenicity,并在-284位點有等位基因缺失突變。推測可能與基因重組和基因轉換有關,這些突變基因與菌株對唑類耐藥有關17。(二細胞膜對唑類藥物通透性改變是真菌耐藥的一個主要因素:有實驗測知敏感白念菌株胞內唑類濃度是胞外的2.5倍以上,而耐藥菌株胞內僅是胞外的1/2。耐藥菌株膜通透性的改變,主要依賴膜上兩種蛋白泵的功能改變。一種泵是ATP能量依賴型的多藥載體(亦稱ABCtransporters,進行能量依賴的主動運輸;另一種泵簡稱BEN,通過電化學勢能進行被動運輸,屬于非能量依

14、賴型載體。這兩種與耐藥有關的載體被劃屬于ABC超家族和MF超家族16。這兩種泵將細胞內物質轉運到細胞外。研究發現,膜對唑類通透性降低不是由于藥物攝入的減少,而是由胞內泵出藥物的增多,即兩種泵功能的增強與耐藥密切相關。有學者對這兩種蛋白泵的基因進行分析,在分離自5例艾滋病患者的17株白念中,菌株2號、3號、16號、17號的MIC值較基余菌株有明顯升高。用斑點雜交的方法檢測兩種蛋白泵基因CDR(編碼ABC 蛋白泵和MDR(編碼BEN蛋白泵的mRNA水平。結果CDR的mRNA水平在16和17號菌株比在115號菌株約增高5倍。MDR的mRNA水平基本呈現隨MIC值而升高的趨勢,第1株反映mRNA水平的

15、熒光信號很弱,mRNA水平很低,2號和3號菌株熒光信號大大增強,mRNA水平分別是1號的12倍和25倍。因此推測蛋白泵的mRNA水平升高是耐藥的分子生物學改變5。進一步分析認為轉錄水平的升高和mRNA加帽和多聚尾的修飾改變可能是mRNA含量升高的主要原因。也有學者認為一些開放閱讀框架(ORFs,編碼氨基酸的三聯體長鏈,無終止密碼子,是基因存在的區域可能與ABC和MF兩家族的基因編碼有關。Alarco的研究結果顯示對白念MF家族的編碼基因BEN的啟動子AP1的過分表達可致菌株耐藥,但開放閱讀框架有缺失突變時該菌株的耐藥性可被大大地抑制或消失。FLR1(Fluconazoleresistance1

16、的表達又受AP1蛋白的調節,FLR1的表達可被AP1的過分表達所誘導。因而FLR1,這個編碼MF家族多藥載體的開放閱讀框架可能是受AP1蛋白調控的一種決定菌株耐藥性的分子因素18。上述研究顯示,在菌株產生耐藥過程中,可能通過三條耐藥途徑,也可能主要通過一條途徑。但耐藥機理的闡明尚需多方面拓寬和深入研究。參考文獻NewmanSLetal.ClinInfectDis,1994;19:684686LawDetal.JAntimicrobChemother,1996,34:659668DromerFetal.AIDS.1997;11(9:10951101HeXGetal.AntimicrobAgent

17、sChemother,1994;38(10:24952497 WhiteTCetal.AntimicrobAgentsChemother,1997;41(7:14821487 PriceMFetal.AntimicrobAgentsChemother,1994;38(6:14221424 SobelJDetal.ClinInfectDis,1992;14(Suppl1:148153 SangerozanJAetal.AmJMed,1994;97(4:339346ReddingSLetal.ClinInfectDis,1994;18:240242VuffrayACetal.AIDS,1994;8

18、:708709CameronMetal.AntimicrobAgentsChemother,1993;37(11:24492453SandveaDetal.AntimicrobAgentsChemother,1997;41(6:13751376 WhiteTCetal.OralDis,1996;3(Suppl1:102109RexJHetal.AntimicrobAgentsChemother,1995;39;18HitchcockCAetal.AntimicrobAgentsChemother,1997;37(9;19621965 SanglardDetal.AntimicrobAgentsChemother,1995;