1、組別：第六組組員：蘇琳偉、陳治、陳家和、陳硅報告人：陳硅學號：詞匯&釋義：Parafilm 封口膜Chloroform 氯仿（三氯甲烷）Isopropanol 異丙醇DEPC 焦碳酸二乙酯TRIZOL a mono-phasic solution of phenol and guanidine isothiocyanatePhenol 苯酚isthiocyanate 異硫氰酸胍MCS multiple cloning site （polycloning site）注：MSC是DNA載體序列上人工合成的一段序列，含有多個限制內切酶識別位點。能為外源DNA提供多種可插入的位置或插入方案。實

2、驗任務： 1. 從豬肌肉纖維中提取RNA;2. 2對RNA上EGFP基因密碼子片段進行RT-PCR擴增;3. 將經RT-PCR技術擴增的cDNA與插入載體質粒，并將其轉化入大腸桿菌進行克隆；4. 從大腸桿菌中提取含目的基因的載體質粒。實驗目的: 1.掌握提取純化總RNA的原理和技術； 2.掌握RT-PCR原理和技術； 3.掌握TA克隆原理和技術。實驗原理：A 總RNA提取和純化RNA 分離的最關鍵因素是盡量減少RNA 酶的污染。但RNA 酶活性非常穩定，分布廣泛，除細胞內源性RNA 酶外，環境中也存在大量RNA 酶。因此在提取RNA 時，應盡量創造一個無RNA 酶的環境，包括去除外源性RNA

3、酶污染和抑制內源性RNA 酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA 酶，通過RNA 酶的阻抑蛋白Rnasin 和強力的蛋白質變性劑如異硫氰酸胍抑制內源性RNA 酶。Trizol試劑是直接從細胞或組織中提取總RNA的試劑，是一種由苯酚和異硫氰酸胍組成的單相溶液它在破碎和溶解細胞時能保持RNA的完整性，裂解細胞并釋放出RNA,酸性條件使RNA與DNA分離,加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后，RNA可以通過異丙醇沉淀來還原。在除去水樣層后，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA，在有機層中加入異丙醇

4、能沉淀出蛋白。共純化DNA對于樣品間標準化RNA的產量十分有用。無論是人、動物、植物還是細菌組織，各種樣品最大使用量（1ml Trizol），動物組織( 50mg)，植物組織(100 mg)，絲狀真菌( 100mg)，動物細胞(5×1061×107)，酵母(1×107) 。TRIZOL試劑能促進不同種屬不同分子量大小的多種RNA的析出。例如，從大鼠肝臟抽提的RNA瓊脂糖凝膠電泳并用溴化乙啶染色，可見許多介于7 kb和15 kb之間不連續的高分子量條帶，（mRNA和hnRNA成分）兩條優勢核糖體RNA條帶位于5 kb (28S)和2 kb (18S)，低分子量RNA

5、介于0.1 和 0.3 kb之間 (tRNA, 5S)。當抽提的RNA用TE稀釋時其A260/A280比值1.8 。Rnase 污染的10大來源 1：手指頭 2：槍頭 3：水/緩沖液4：實驗臺面 5：內源 Rnase 6：RNA 樣品7：質粒抽提 8：RNA 保存 9：陽離子 (Ca, Mg) 10：后續實驗所用的酶 RNA提取須杜絕外源酶的污染，實驗時應注意一嚴格戴好口罩，手套。 二實驗所涉及的離心管，Tip 頭，移液器桿，電泳槽，實驗臺面等要徹底處理。 三實驗所涉及的試劑/溶液，尤其是水，必須確保 RNase-Free。 RNA純化流程圖（附：上清不含DNA的原因：1.因為細胞中存在DNA

6、酶，在提取之前細胞破碎的時候沒有加DNA酶抑制劑，DNA已經被分解了。2.上層水相，PH 5.1左右，當溶液pH在酸性的時候，DNA分子就會沉淀在酚與溶液的界面，只有RNA分子留在水相。而當pH接近中性時，DNA就會溶解在水相，（導致PH中性的大概原因是trizol與樣品比例不對，應該盡量保證提取量的前提下使trizol過量）RNA純化要求1 純化后不應存在對酶(如逆轉錄酶)有抑制作用物質2 排除有機溶劑和金屬離子的污染3 蛋白質、多糖和脂類分子等的污染降低到最低程度4 排除DNA分子的污染BRT-PCR一、知識背景：1、基因表達：DNA RNA Protein單拷貝基因表達存在逐步放大機制，

7、如一個蠶絲心蛋白基因104 個絲心蛋白mRNA（每個mRNA 存活4d，可以合成105 個絲心蛋白） 共合成109 個絲心蛋白。因此單拷貝基因的mRNA 表達水平對于其功能水平的調控是非常重要的。2、PCR 技術(olymerase chain reaction)：即聚合酶鏈式反應。在模板、引物和四種脫氧核苷酸存在的條件下依賴于DNA 聚合酶的酶促反應，其特異性由兩個人工合成的引物序列決定。反應分三步：a、變性：通過加熱使DNA 雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA；b、退火：將反應混合液冷卻至某一溫度，使引物與模板結合。c、延伸：在DNA 聚合酶和dNTPs 及Mg2存在下，退火引物沿5 3方向

8、延伸。以上三步為一個循環，如此反復。3、逆轉錄酶和RT-PCR逆轉錄酶（reverse transcriptase）是存在于RNA 病毒體內的依賴RNA 的DNA 聚合酶，至少具有以下三種活性：1、依賴RNA 的DNA 聚合酶活性：以RNA 為模板合成cDNA 第一條鏈；2、Rnase 水解活性：水解RNANA 雜合體中的RNA；3、依賴DNA 的DNA 聚合酶活性：以第一條DNA 鏈為模板合成互補的雙鏈cDNA.二、RT-PCR 的準備：1、引物的設計及其原則：1）引物的特異性決定PCR 反應特異性。因此引物設計是否合理對于整個實驗有著至關重要的影響。在引物設計時要充分考慮到可能存在的同源序

9、列，同種蛋白的不同亞型，不同的mRNA 剪切方式以及可能存在的hnRNA 對引物的特異性的影響。盡量選擇覆蓋相連兩個內含子的引物，或者在目的蛋白表達過程中特異存在而在其他亞型中不存在的內含子。2）引物設計原則的把握：引物設計原則包括a、引物長度:一般為1530bp ，引物太短會影響PCR 的特異性，引物太長PCR 的最適延伸溫度會超過Taq 酶的最適溫度，也影響反應的特異性。b、堿基分布：四種堿基最好應隨機分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特別是連續出現3 個以上的單一堿基。GC 含量（Tm 值）：4060，PCR 擴增的復性溫度一般是較低Tm 值減去510 度。c、3端要求：3端必須與模板嚴格

10、互補，不能進行任何修飾，也不能有形成任何二級結構的可能。末位堿基是A 時錯配的引發效率最低，G、C 居中間，因此引物的3端最好選用A、G、C 而盡可能避免連續出現兩個以上的T。d、引物自身二級結構：引物自身不應存在互補序列，否則會自身折疊成發夾狀結構或引物自身復性。e、引物之間的二級結構：兩引物之間不應有多于4 個連續堿基互補，3端不應超過2 個。f、同源序列：引物與非特異擴增序列的同源性應小于連續8 個的互補堿基存在。g、5端無嚴格限制：5末端堿基可以游離，但最好是G 或C，使PCR 產物的末端結合穩定。還可以進行特異修飾（標記、酶切位點等）等等。根據實驗目的選擇適當的引物。常用引物設計軟件

11、如Primer5.0，Oligo6.0 等對于這些條件都可以自行設置。二步法RT-PCR反應流程圖示一部法RT-PCR反應流程圖示CTA克隆a質粒的基本特性1質粒的復制    通常一個質粒含有一個與相應的順式作用控制要素結合在一起的復制起始區（整個遺傳單位定義為復制子）。在不同的質粒中，復制起始區的組成方式是不同的，有的可決定復制的方式，如滾環復制和 復制。在大腸桿菌中使用的大多數載體都帶有一個來源于 pMB1 質粒或 ColE1 質粒的復制起始位點。圖 3-1 是其復制其始示意圖。 在復制時，首先合成前 RNA ，即前引物，并與 DNA 形成雜交體；而

12、后 RNase H 切割前 RNA ，使之成為成熟的 RNA ，并形成三葉草二級結構，該引物引導質粒的復制。形成的 RNA 可控制 RNA 形成二級結構，同時 Rop 增強 RNA 的作用，從而控制質粒的拷貝數。削弱 RNA 和 RNA 之間相互作用的突變，將增加帶有 pMB1 或（ColE1）復制子的拷貝數。        圖 帶 pMB1（或 ColE1） 復制起點的質粒在復制起始階段所產生的轉錄的方向及其粗略大小。 滾環復制：滾環式復制(rolling circle replication)是噬菌體中常見的DNA復制方

13、式。許多病毒DNA的復制、質粒、F因子在接合(conufgation)轉移時其DNA的復制，以及許多基因擴增時都采用這種方式。在以這種機制進行的復制中，親代雙鏈DNA的一條鏈在DNA復制起點處被切開，其5'端游離出來。這樣，DNA聚合酶便可以將脫氧核糖核苷酸聚合在3'-OH端。當復制向前進行時，親代DNA上被切斷的5'端繼續游離下來，并且很快被單鏈結合蛋白所結合。因為5'端從環上向下解鏈的同時伴有環狀雙鏈DNA環繞其軸不斷的旋轉，而且以3'-OH端為引物的DNA生長鏈則不斷地以另一條環狀DNA鏈為模板向前延伸，因而稱為滾環復制。由于只有一條DNA鏈是完整

14、的，因而在DNA解鏈時不會產生拓撲學上的問題，即未解鏈的雙螺旋區不會產生超螺旋。當5'-端從環上解下來后不久，即與單鏈結合蛋白結合，以后可移動的引發體便在其上形成，以引發RNA引物的合成，然后由DNA聚合酶催化合成岡崎片段。這個過程與前述的DNA滯后鏈的合成一樣。最后由DNA聚合酶切除RNA引物，并填充間隙構成完整的DNA鏈。5'端所以能從環上不斷解鏈，主要是由于DNA聚合酶及引發體構成的復制體中的螺旋酶不停的向前移動所致。在這種復制方式中，DNA的延伸可以一直進行下去，產生的DNA鏈可以是親代DNA單位長度的許多倍。這么長的DNA鏈是如何轉變為單位長度的DNA分子的，目前尚不

15、清楚。可能是由特異的內切酶切開產生單位長度的子代DNA。這些DNA可自身環繞，或保持線性分子狀態。某些質粒進行的滾環復制與噬菌體進行的滾環復制并非完全的相同，它們至少存在以下幾點差別：1.質粒在進行滾環復制時，正鏈和負鏈必須等量復制。2.具有兩個復制起始區，即雙鏈起始區和單鏈起始區，它們分別起動前導鏈（正鏈）和后隨鏈（負鏈）的合成。滾環復制特點：1、以親本鏈（+鏈）為模板合成互補的環狀負鏈，形成閉合環狀的復制形RF1；2、以成環滾環復制產生多個子代RF；3、以RF的負鏈為模板進行滾環復制產生多拷貝正鏈單環。滾環復質圖示型復制DNA在復制原點解開成單鏈狀態,分別作為模板,各自合成其互補鏈,則出現

16、兩個叉子狀的生長點,叫做復制叉。復制過程中，由于形狀像希臘字母,因而叫復制,又叫Cairns復制,其復制中間體稱為Cairns分子。在復制中為雙向復制。大多數生物為雙向等速復制,也有少數雙向不等速復制的情況。型復制圖示2質粒的拷貝數    質粒拷貝數分為嚴謹型與松馳型。嚴謹型質粒每個細胞中拷貝數有限，大約 1 幾個；松馳型質粒拷貝數較多，可達幾百。表 5-1 就是不同類的質粒與復制子及拷貝數的大致關系。表 3-1 ：質粒載體及其拷貝數質粒 復制子 拷貝數 pBR322 及其衍生質粒 pMB1 1520 pUC 系列質粒及其衍生質粒 突變的 pMB1 50

17、0700 pACYC 及其衍生質粒 p15A10212pSC101 及其衍生質粒pSC101 5 ColE1ColE11520pUC 系列質粒的復制單位來自質粒 pMB1 ，但其拷貝數較高。 pMB1 質粒的復制并不需要質粒編碼的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期較長的酶（DNA 聚合酶 ，DNA 聚合酶 ），依賴于 DNA 的 RNA 聚合酶，以及宿主基因 dnaB 、 dnaC 、 dnaD 和 danZ 的產物。因此，存在抑制蛋白質合成并阻斷細菌染色體復制的氯霉素或壯觀霉素等抗生素時，帶有 pMB1（或 ColE1） 復制子的質粒將繼續復制，最后每個細胞中可積聚 23 千個質粒。3質

18、粒的不相容性 兩個質粒在同一宿主中不能共存的現象稱質粒的不相容性，它是指在第二個質粒導入后，在不涉及 DNA 限制系統時出現的現象。不相容的質粒一般都利用同一復制系統，從而導致不能共存于同一宿主中。兩個不相容性質粒在同一個細胞中復制時，在分配到子細胞的過程中會競爭，隨機挑選，微小的差異最終被放大，從而導致在子細胞中只含有其中一種質粒。而不相容群指那些具有不相容性的質粒組成的一個群體，一般具有相同的復制子。在大腸桿菌中現已發現 30 多個不相容群，如 ColE1 和 pMB1 ， pSC101 和 p15A。4轉移性 質粒具轉移性。它是指在自然條件下，很多質粒可以通過稱為細菌接合的作用轉移到新宿

19、主內。它需要移動基因 mob ，轉移基因 tra ，順式因子 bom 及其內部的轉移缺口位點 nic。二、標記基因    按其用途可將標記基因分為選擇標記基因和篩選標記基因。選擇標記用于鑒別目標 DNA （載體）的存在，將成功轉化了載體的宿主挑選出來，篩選標記可用于將特殊表型的重組子挑選出來。（一） 選擇標記抗生素抗性基因是目前使用最廣泛的選擇標記。1氨芐青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene, ampr）    氨芐青霉素抗性基因是基因操作中使用最廣泛的選擇標記，絕大多數在大腸桿菌中

20、克隆的質粒載體帶有該基因。青霉素可抑制細胞壁肽聚糖的合成，與有關的酶結合并抑制其活性，抑制轉肽反應。氨芐青霉素抗性基因編碼一個酶，該酶可分泌進入細菌的周質區，抑制轉肽反應并催化 -內酰胺環水解，從而解除了氨芐青霉素的毒性。青霉素是一類化合物的總稱，其分子結構由側鏈 R-CO- 和主核 6-氨基青霉烷酸（6-APA）兩部分組成。在 6-APA 中有一個飽和的噻唑環（A）和一個 -內酰胺環， 6-APA 為由 L- 半脫氨酸和纈氨酸縮合成的二肽。 2四環素抗性基因（Tetracycline resistance gene,tetr）    四環素可與核糖體

21、30S 亞基的一種蛋白質結合，從而抑制核糖體的轉位。四環素抗性基因編碼一個由 399 個氨基酸組成的膜結合蛋白，可阻止四環素進入細胞。 pBR322 質粒除了帶有氨芐青霉素抗性基因外，還帶有四環素抗性基因。3氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene, Cmr, cat）    氯霉素可與核糖體 50S 亞基結合并抑制蛋白質合成。目前使用的氯霉素抗性基因來源于轉導性 P1 噬菌體（也攜帶 Tn9）。cat 基因編碼氯霉素乙酰轉移酶，一個四聚體細胞質蛋白（每個亞基 23kDa）。在乙酰輔酶 A 存在的條件下，該蛋白催化氯

22、霉素形成氯霉素羥乙酰氧基衍生物，使之不能與核糖體結合。4卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor）    卡那霉素和新霉素是一種脫氧鏈霉胺氮基糖苷，都可與核糖體結合并抑制蛋白質合成。 卡那霉素和新霉素抗性基因實際就是一種編碼氨基糖苷磷酸轉移酶（APH（3'）-, 25kDa）的基因，氨基糖苷磷酸轉移酶可使這兩種抗生素磷酸化，從而干擾了它們向細胞內的主動轉移。在細胞中合成的這種酶可以分泌至外周質腔，保護宿主不受這些抗生素的影響。5琥珀突變抑制基因 supF &#

23、160;  在基因的編碼區中，若某個密碼子發生突變后變成終止密碼子，則稱這樣的突變為赭石突變（突變為 UAA），或琥珀突變（突變為 UAG），或乳白突變（突變為 UGA）。 supF 基因編碼細菌的抑制性 tRNA ，可在 UAG 密碼子上編譯酪氨酸。如果在某一宿主中含具琥珀突變的 tetr 基因和 ampr 基因，只有當宿主含有 supF 基因時才會對 Amp 和 Tet 具有抗性。相應的， supE 基因在 UAG 密碼子上編譯谷氨酰氨。由于目前所用的標記基因使用方便，因此用這類標記的載體較少。6其它    還有一些正向選擇標記，

24、表達一種使某些宿主菌致死的基因產物，而含有外源基因片段插入后，該基因便失活。如蔗糖致死基因 SacB ，來自淀粉水解芽胞桿菌 （Bacillus amyloliquefaciens） ，編碼果聚糖蔗糖酶。在含蔗糖的培養基上 sacB 基因的表達對大腸桿菌來說是致死的，因此該基因可用于插入失活篩選重組子。（二）篩選標記    篩選標記主要用來區別重組質粒與非重組質粒，當一個外源 DNA 片段插入到一個質粒載體上時，可通過該標記來篩選插入了外源片段的質粒，即重組質粒。1-互補（-complementation）    

25、-互補是指 lacZ 基因上缺失近操縱基因區段的突變體與帶有完整的近操縱基因區段的 -半乳糖苷酶（ -galactosidase ，由 1024 個氨基酸組成）陰性的突變體之間實現互補。-互補是基于在兩個不同的缺陷 -半乳糖苷酶之間可實現功能互補而建立的。大腸桿菌的乳糖 lac 操縱子中的 lacZ 基因編碼 -半乳糖苷酶，如果 lacZ 基因發生突變，則不能合成有活性的 -半乳糖苷酶。例如， lacZM15 基因是缺失了編碼 -半乳糖苷酶中第 11-41 個氨基酸的 lacZ 基因，無酶學活性。對于只編碼 N-端 140 個氨基酸的 lacZ 基因 （稱為 lacZ'） ，其產物也沒

26、有酶學活性。但這兩個無酶學活性的產物混合在一起時，可恢復 -半乳糖苷酶的活性，實現基因內互補。    在 lacZ' 編碼區上游插入一小段 DNA 片段（如 51 個堿基對的多克隆位點），不影響 -半乳糖苷酶的功能內互補。但是，若在該 DNA 小片段中再插入一個片段，將幾乎不可避免地導致產生無-互補能力的 -半乳糖苷酶片段。利用這一互補性質，可用于篩選在載體上插入了外源片段的重組質粒。在相應的載體系統中，lacZM15 放在 F 質粒上, 隨宿主傳代； lacZ' 放在載體上, 作為篩選標記 （圖 3-2） 。相應的受體菌有 JM 系列、

27、 TG1 和 XL1-Blue ，前二者均帶有 D （lac - proAB）F' proAB + lacIq lacZD M15 基因型。其中 lacI 為 lac 阻抑物的編碼基因，lacIq 突變使阻抑物產量增加，防止 lacZ 基因滲漏表達。    lacZ 基因是乳糖 lac 操縱子中編碼 -半乳糖苷酶的基因，乳糖及其衍生物可誘導其表達。 乳糖既是 lac 操縱子的誘導物，也是作用的底物。異丙基-D- 硫代半乳糖苷（IPTG）是乳糖的衍生物，可作為 lac 操縱子的誘導物，但不能作為反應的底物； 5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（

28、X-gal） 可作為 lac 操縱子的底物，但不能作為誘導物。底物 X-gal 還可充作生色劑，被 -半乳糖苷酶分解后可產生蘭色產物，可使菌落或噬菌斑呈蘭色。   2插入失活    通過插入失活進行篩選的質粒主要有 pBR322 ，該質粒具有四環素抗性基因（tetr）和氨芐青霉素抗性基因（ampr）兩種抗性標記。當外源 DNA 片段插入 tetr 基因后，導致 tetr 基因失活，變成只對氨芐青霉素有抗性。這樣就可通過對抗生素是雙抗還是單抗來篩選是否有外源片段插入到載體中。三、質粒載體的種類（一）克隆載體  

29、60; 克隆載體主要用于擴增或保存 DNA 片段，是最簡單的載體。1pBR322       pBR322 質粒的大小為 4361bp ， GenBank 注冊號為 V0lll9 和 J01749 ，含有 30 多個單一位點，具有四環素抗性基因（tetr）和氨芐青霉素抗性基因（ampr），其質粒復制區來自 pMB1 （如圖 3-3）。目前使用廣泛的多質粒載體幾乎都是由此發展而來的。利用四環素抗性基因內部的 BamH 位點來插入外源 DNA 片段，可通過插入失活進行篩選。2pUC18 和 pUC19 

30、60;  pUC18 和 pUC19 大小只有 2686bp ，是最常用的質粒載體，其結構組成緊湊，幾乎不含多余的 DNA 片段，GenBank注冊號為 L08752（pUC18）和 X02514（pUC19）。由 pBR322 改造而來，其中 lacZ （MSC） 來自 M13mp18/19 圖 3-4 是其質粒圖譜。    這兩個質粒的結構幾乎是完全一樣 的，只是多克隆位點的排列方向相反。這些質粒缺乏控制拷貝數的 rop 基因，因此其拷貝數達 500-700 。 pUC 系列載體含有一段 lacZ 蛋白氨基末端的部分編碼序列，在特

31、定的受體細胞中可表現 -互補作用。因此在多克隆位點中插入了外源片段后，可通過 -互補作用形成的藍色和白色菌落篩選重組質粒。          圖 3-4 ： pUC18/19 質粒圖譜3pUC118 和 pUC 119  由 pUC18/19 增加了一些功能片段改造而來，大小為 3162bp ， GenBank 注冊號為 U07649（pUC118）和 U07650（pUC119）。相當于在 pUC18/19 中增加了帶有 M13 噬菌體 DNA 合成的起始與終止以及包裝進入

32、噬菌體顆粒所必需的順式序列。4pGEM-3Z/4Z  pGEM-3Z/4Z由pUC18/19 增加了一些功能片段改造而來，大小為 2.74kb, GenBank 注冊號為 X65304（pGEM-3Z, 2743bp）和 X65305（pGEM-4Z, 2746）。與 pUC18/19 相比，在多克隆位點的兩端添加了噬菌體的轉錄啟動子，如 Sp6 和 T7 噬菌體的啟動子。 pGEM-3Z 和 pGEM-4Z 的差別在于二者互換了兩個啟動子的位置。5多功能質粒載體  在上述載體的基礎上，人們設計出一些多功能的質粒載體，這類質粒載體綜合了以上質粒的特點。除

33、了作為質粒載體基本要素外，綜合了上述功能要素，如多克隆位點、 -互補、噬菌體啟動子和單鏈噬菌體的復制與包裝信號。典型的這類質粒有 pBluescriptKS（±），這類質粒一般由 4 個質粒組成一套系統，其差別在于多克隆位點方向相反（根據多克隆位點兩端 Kpn 和 Sac 的順序，用 KS 或 SK 表示），或單鏈噬菌體的復制啟始方向相反（或者說，引導 DNA 雙鏈中不同鏈合成單鏈 DNA ，用 + 或 - 表示）， pBluescriptKS（+） 的 GenBank注冊號為 X52327 。 pBluescriptKS（±） 的多克隆位點與 pUC18/19 的不同，且

34、使用 f1 噬菌體的復制與包裝信號序列，質粒圖譜如圖 3-5 。             6表達載體    該類載體是在常規克隆載體的基礎上衍生而來的，主要增添了強啟動子，以及有利于表達產物分泌、分離或純化的元件，有關本次實驗使用的b本次實驗所用pGEM®-T Easy 載體的有關信息載體圖譜 pGEM®-T 載體和pGEM®-T Easy 載體多克隆位點序列pGEM®-T Easy 載

35、體圖和相關序列位點pGEM®-T Easy 載體相關的序列位點T7 RNA 聚合酶轉錄起始位點 1多克隆位點區 10128SP6 RNA 聚合酶啟動子（17 至3） 139158SP6 RNA 聚合酶轉錄起始位點 141pUC/M13 反向測序引物結合位點 176197lacZ 起始密碼子 180lac 操縱子 200216內酰胺酶編碼區 13372197噬菌體f1 區 23802835lac 操作子序列 28362996, 166395pUC/M13 正向測序引物結合位點 29562972T7 RNA 聚合酶啟動子（17 至3） 29993pGEM®-T 和pGEM

36、74;-T Easy 載體的特殊應用1PCR 產物的克隆。2采用Erase-a-Base®系統構建不定向巢式缺失體。3單鏈DNA 制備。4重組子的藍白斑篩選。5利用雙向啟動子進行體外轉錄。注意平端PCR 產物(來自質粒載體說明書)具有校正活性的熱穩定性DNA 聚合酶如Pfu DNA 聚合酶 (產品目錄號：M7741)，Pwo DNA 聚合酶，Tli DNA 聚合酶（目錄號M7101）在進行PCR 擴增時產生平端PCR產物。這種平端PCR 產物可以通過加A 尾程序后（圖4），連接到pGEM®-T 和pGEM®-TEasy 載體中（6）。采用這種方法連接，只有一個片段

37、插入，而平端連接克隆可能產生多個插入。另外采用T 載體克隆不需要對載體去磷酸化，載體自連的背景很低。Pfu 和Tli DNA 聚合酶產生的PCR 產物經過加尾處理，并以理想載體：插入片段比例進行連接，可得到5595重組子（表2）。值得注意的是，PCR 產物有必要采用Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System(d) (Cat.# A9281)進行PCR 產物直接純化或凝膠純化。若PCR 產物不進行純化，Pfu、Pwo 和Tli DNA 聚合酶的校正活性在進行加尾反應或連接反應時，可降解PCR 片段的3-A 或除去加尾反應的載體的3-T突出端。為了提高克

38、隆效率，應根據純化PCR 產物的摩爾濃度調整加尾反應中的DNA 量和連接需要的體積。當PCR 產物片段小或擴增反應良好，產物的摩爾濃度高，加尾或連接反應需要的體積很小。相反，如果PCR 片段比較大或擴增不好，產物的摩爾濃度低，則需要較大的體積。我們已成功地用Taq DNA 聚合酶 對1-7l 純化的平端PCR片段進行加尾反應，并優化插入片段:載體的連接比例，參見章節IV.C 詳細討論了插入片段:載體比例的優化。轉化后采用藍白斑篩選重組子，結果70100的重組子含有PCR 擴增的DNA 片段，而PCR 片段沒有加尾的對照反應，只有很少的重組子。對照實驗結果表明大多數pGEM®-T Ea

39、sy 載體含有3-T，并且Taq DNA 聚合酶可成功對大多數PCR 片段加上3-A。 優化插入片段和載體的摩爾比pGEM®-T 和pGEM®-T Easy 載體系統優化的插入DNA 對照片段和載體的摩爾比為1:1，采用8:1 到1:8 的連接比例也可成功進行連接。如果你的PCR 產物開始的連接不理想，則有必要優化連接比例。一般開始采用3:1 到1:3 的連接比例。PCR 產物的濃度可通過凝膠電泳上的DNA 分子量標準進行估計或采用熒光定量。pGEM®-T 和pGEM®-T Easy 載體大概3kb 大小，系統提供的載體濃度為50ng/l。計算連接反應中

40、需要的PCR 產物的量可采用以下公式:加入載體的量（ng）×插入片段大小（kb）載體大小kb×插入片段和載體的摩爾比3:1=插入片段的量根據推薦的不同插入片段:載體比例加入足夠的pGEM®-T 和pGEM®-T Easy載體進行連接，并進行對照反應。c 重組T質粒的構建外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統中，將分別經酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連

41、接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒有的特性，即能使兩個平末端的雙鏈DNA分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接率低，一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。T4噬菌體DNA 連接酶催化DNA 連接反應分為3 步：首先，T4 DNA 連接酶與輔因子ATP形成酶-ATP復合物；然后，酶-ATP復合物再結合到具有5磷酸基和3羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后產生一個新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。連接反應通常將兩個不同大小的片斷相連。因為DNA片斷有兩個端點，所以切割時

42、出現兩種可能，一種是單酶切，另一種是雙酶切，這兩種酶切方法在基因工程操作中都經常用到。對于單酶切來說，載體與供體的末端都相同，連接可以在任何末端之間進行，這樣就導致了大量的自連接產物。為了減少自環的高本底，可對載體進行5除磷酸處理，原理是連接酶只能連接DNA片斷的3OH末端與5端，所以除磷后載體不會自環。一旦有外源片斷插入時，由外源片斷提供5端就能與載體進行連接。通過這種方法可大大減少由載體的自 環造成的高本底。對于雙酶切來說，無論載體與供體同一片段上都有不同的末端，這樣就避免了載體與供體的自環，能使有效連接產物大大增加。雙酶切的另一個特點是能將供體分子定向連接到載體上。 連接反應的溫度在37

43、時有利于連接酶的活性。但是在這個溫度下粘末端的氫鍵結合是不穩定的。因此采取折中的溫度，即12-16，連接12-16h（過夜），這樣既可最大限度地發揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結構的穩定。Taq DNA酶擴增的PCR產物，其DNA雙鏈前后末端都有一個游離的A堿基，可以與pGEM-T Easy Vector 末端游離的T堿基互補形成環狀重組T質粒。d 質粒轉化與篩選（1） 感受態細胞（Competent cells）:受體細胞經過一些特殊方法（如CaCl，RuCl等化學試劑法）的處理后，細胞膜的通透性發生變化，成為能容許外源DNA的載體分子通過，進入感受態細胞（2） 轉化（transforma

44、tion）：是將異源DNA分子引入一細胞株系，使受體細胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，是基因工程等研究領域的基本實驗技術。注意： 轉化過程所用的受體細胞一般是限制-修飾系統缺陷的變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變株。（3） 轉化的方法：i化學方法（熱擊法）：使用化學試劑（如CaCl2、RuCl等）制備的感受態細胞，通過熱擊處理將載體分子導入受體細胞； ii電轉化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態細胞，通過高壓麻脈沖的作用將載體DNA分子導入受體細胞。pGEM®-T 和pGEM®-T Easy 載體連接反應產物的轉化步驟一定要使用高效率的感受態細胞（1×10

45、8 cfu/g DNA）進行轉化，因為采用單堿基突出端進行連接不是很有效，采用轉化效率高的感受態細胞1×108 cfu/g DNA（或更高）可得到合理的克隆菌數目（參見章節VI. E）。我們建議使用JM109 高效感受態細胞（產品目錄號：L2001），pGEM®-T 和pGEM®-T Easy 載體系統提供這種感受態細胞。也可使用其他宿主菌，但是它們應該適合用藍白斑及氨芐進行篩選。在使用JM109 制備感受態細胞前，JM109 應保存在含加維生素B1 的M9 基本培養基中，這有助于F因子的選擇，F因子帶有proAB 基因，這和脯氨酸營養缺陷型宿主菌（proAB 基

46、因缺失）是互補的，攜帶的lacIqZM15 對于藍白斑篩選是必需的。如果你不采用Promega 公司JM109 高效率感受態細胞，應按照后面的轉化步驟進行操作。在LB/氨芐/IPTG/X-Gal 平板篩選轉化子（參見章節XI. A），為得到理想的結果，最好不要使用放置超過1 個月的平板。篩選含插入片段的轉化子插入片段成功克隆到pGEM®-T 和pGEM®-T Easy 載體中，可阻斷 半乳糖苷酶的編碼序列，因而重組克隆可在指示培養基上通過顏色進行篩選。然而連接到pGEM®-T和pGEM®-T Easy 載體的PCR 產物的特點對轉化后藍白斑克隆菌的比例影

47、響很大。大多數情況下含有PCR 產物的克隆菌為白色，如果PCR 片段和LacZ 基因在同一讀碼框，則重組克隆菌可能為藍色。這種DNA 片段堿基數是3 的整數倍（含3-A），并且讀碼框無終止密碼子。據文獻報道，在同一讀碼框內插入長達2kb 的DNA 片斷，重組克隆菌仍可能為藍色。即使PCR 產物不是3 的整數倍大小，由于擴增反應可引入突變（缺失或點突變），也可造成pGEM®-T 和pGEM®-T Easy 載體和片段連接轉化后，重組克隆菌為藍色。pGEM®-T 和pGEM®-T Easy 載體系統的對照DNA 為542bp，來源于Promega公司pGEM

48、®-luc（b,個g）DNA (Cat.#E1541)，這個DNA 序列被引入突變，在6 個讀碼框中含有多個終止密碼子，從而確保對照反應產生的藍色克隆菌的背景數很低。由此可見，插入DNA 對照的結果不能代表你的PCR 產物的連接結果。（這就解釋了為什么對菌落進行插入片段進行PCR擴增后進凝膠電泳分析是必要的。）E. 質粒提取細菌質粒是一類雙鏈、閉環的DNA，大小范圍從1kb至200kb以上不等。各種質粒都是存在于細胞質中、獨立于細胞染 色體之外的自主復制的遺傳成份，通常情況下可持續穩定地處于染色體外的游離狀態，但在一定條件下也會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復制而復制， 并通

49、過細胞分裂傳遞到后代。質粒已成為目前最常用的基因克隆的載體分子，重要的條件是可獲得大量純化的質粒DNA分子。目前已有許多方法可用于質 粒DNA的提取，本實驗采用堿裂解法提取質粒DNA。堿裂解法是一種應用最為廣泛的制備質粒DNA的方法，其基本原理為：當菌體在NaOH和 SDS溶液中裂解時，蛋白質與DNA發生變性，當加入中和液后，質粒DNA分子能夠迅速復性，呈溶解狀態，離心時留在上清中；蛋白質與染色體DNA不變性 而呈絮狀，離心時可沉淀下來。 純化質粒DNA的方法通常是利用了質粒DNA相對較小及共價閉環兩個性質。例如，氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心、離 子交換層析、凝膠過濾層析、聚乙二醇分級沉淀等方

50、法，但這些方法相對昂貴或費時。對于小量制備的質粒DNA，經過苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀 等簡單步驟去除殘余蛋白質和RNA，所得純化的質粒DNA已可滿足細菌轉化、DNA片段的分離和酶切、常規亞克隆及探針標記等要求，故在分子生物學實驗室 中常用。 一、試劑準備1. 溶液: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl (pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高壓滅菌15min ，貯存于4。任何生物化學反應，首先要

51、控制好溶液的pH，因此用適當濃度的和適當pH值的Tris-Cl溶液。50 mM葡萄糖最大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其實對質粒的抽提本身而言，幾乎沒有任何影響。所以說溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，配在分子生物學試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長。在溶液I中加入高達 10 mM 的EDTA，無非就是要把大腸桿菌細胞中的所有二價金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA，其實也沒什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太長的時間里完 成質粒抽提，就不用怕DNA會迅速被

52、降解，因為最終溶解質粒的TE緩沖液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提質粒呢？實話告訴你， 只要用等體積的水，或LB培養基來懸浮菌體就可以了。NaOH也使DNA變性，但只是個副產物，在溶液3加入后其中的醋酸和NaOH中和，質粒DNA恢復活性2. 溶液：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前臨時配置 。這是用新鮮的0.4 N的NaOH和2的SDS等體積混合后使用的。要新從濃NaOH稀釋制備0.4N的NaOH，無非是為了保證NaOH沒有吸收空氣中的CO2而減弱了堿 性。很多人不知道其實破細胞的主要

53、是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實上NaOH是最佳的溶解細胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物細胞，碰到了堿都會幾乎在瞬間就溶解，這是由于細胞膜發生了從bilayer（雙層膜）結構向 micelle（微囊）結構的相變化所導致。用了不新鮮的0.4 N NaOH，即便是有SDS也無法有效溶解大腸桿菌（不妨可以自己試一下），自然就難高效率抽提得到質粒。如果只用SDS當然也能抽提得到少量質粒，因為 SDS也是堿性的，只是弱了點而已。很多人對NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉淀，這是由于沒有正確理解一些書上的有關DNA變性復 性的描述所導致。有人不禁要問，既然是NaOH溶解的細

54、胞，那為什么要加SDS呢？那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點：第一，時間不能過長，千 萬不要這時候去接電話，因為在這樣的堿性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合（象對待女孩子一樣），不然基因組DNA也會斷裂。基因組 DNA的斷裂會帶來麻煩。3. 溶液：醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4保存備用。溶液III加入后就會有大量的沉淀，但大部分人卻不明白這沉淀的本質。最容易產生的誤解是，當SDS碰到酸性后發生的沉淀。如果你這樣懷疑，往1%的 SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大

55、量沉淀的出現，顯然與SDS的加入有關系。如果在溶液II中不加SDS會怎樣呢，也會有少量 的沉淀，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉淀出來的蛋白質。既然SDS不是遇酸發生的沉淀，那會不會是遇鹽發生的沉淀呢？在1的SDS溶液中慢慢加 入5 N的NaCl，你會發現SDS在高鹽濃度下是會產生沉淀的。因此高濃度的鹽導致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你會發現沉淀的量 要多的多。這其實是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此發生了沉淀。如此看

56、來，溶液III加入后的沉淀實際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS，而高濃度 的鹽，使得沉淀更完全。大家知道SDS專門喜歡和蛋白質結合，平均兩個氨基酸上結合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質 沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。這個過程不難想象，因為基因組DNA太長了，長長的DNA自然容易被SDS給共沉淀了，盡管SDS并不與DNA分子結合。那么2 M的醋酸又是為什么而加的呢？是為了中和NaOH，因為長時間的堿性條件會打斷DNA，所以要中和之。基因組DNA一旦發生斷裂，只要是50100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被PDS共

57、沉淀了。所以堿處理的時間要短，而且不得激烈振蕩，不然最后得到的質粒上總會有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電 泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。很多人誤認為是溶液III加入后基因組DNA無法快速復性就被沉淀了，這是天大的誤會，因為變性的也好復性的也 好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本來是為了溶解細胞而用的，DNA分子的變性其實是個副產物，與它是不是沉淀下來其實沒有關系。溶液 III加入并混合均勻后在冰上放置，目的是為了PDS沉淀更充分一點。  4. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH

58、 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4保存備用。5.苯酚/氯仿 /異戊醇（25：24：1）不要以為PDS沉淀的形成就能將所有的蛋白質沉淀了，其實還有很多蛋白質不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/異戊醇進行抽提，然后進行酒精沉淀才能得到質量穩 定的質粒DNA，不然時間一長就會因為混入的DNase而發生降解。這里用25/24/1的酚/氯仿/異戊醇是有很多道理的，這里做個全面的介紹。酚 （Phenol）對蛋白質的變性作用遠大于氯仿，按道理應該用酚來最大程度將蛋白質抽提掉，但是水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度

59、的鹽溶液（比如4M的 異硫氰酸胍），離心后酚相會跑到上層，不利于含質粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；還有一點，酚與水 有很大的互溶性，如果單獨用酚抽提后會有大量的酚溶解到水相中，而酚會抑制很多酶反應（比如限制性酶切反應），因此如果單獨用酚抽提后一定要用氯仿抽提一 次將水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液進行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉淀時就會被除干凈而不必擔心酶切等反應不能正常進行。至于 異戊醇的添加，其作用主要是為了讓離心后上下層的界面更加清晰，也方便了水相的回收。6.乙醇（無水乙醇、70%乙醇）回收后的水相含有足夠多的鹽，因此只要加入2倍體積的乙醇，在室溫放置幾分鐘后離心就可以將質粒DNA沉淀出來。這時候如果放到20，時間一長反而會 導致大量鹽的沉淀，這點不同于普通的DNA酒精沉淀回收，所以不要過分小心了。高濃度的鹽會水合大量的水分子，因此