1、植入前胚胎染色體嵌合型的初步分析 (一 )【摘要】目的應用熒光原位雜交(FISH技術對人類早期胚胎染色體的嵌合型進行初步分析，并探討胚胎染色體嵌合型對常規體外受精-胚胎移植(IVF-ET成功率以及植入前診斷的影響。方法對IVF-ET治療周期中胚胎質量差、不適于胚胎移植和冷凍保存的正常受精胚胎以及在 植入前胚胎性別診斷中診斷為男性胚胎、不能移植的38個胚胎進行FISH結果38個胚胎共有 293 個核，雜交率為 96.2%。其中正常胚胎 12 個，占 31.6%，二倍體胚胎(正常胚胎 + 二倍體嵌合型胚胎) 28 個，占 73.7%，嵌合型胚胎(二倍體嵌合型胚胎+異常嵌合型胚胎)19個，占50.0

2、%。在W4細胞期胚胎中，嵌合型胚胎占18.2%，但在58細胞期和?9田胞期胚胎中，嵌合型胚胎的比例分別增至68.4%和 50.0%。結論隨著卵裂次數的增加，嵌合型胚胎所占的比例也增加， 但嵌合型胚胎中嵌合細胞的比例卻隨之而降低。 胚胎染色體的嵌合型 可能是影響常規IVF-ET成功率的重要因素。應用FISH技術可準確地進行單細胞植入前性別診斷，但在進行植入前單基因診斷時，最好能同時活檢 2個細胞，以增加準確度。 PreliminaryAnalysisofChromosomeMosaicisminPreimplantationEmbryos【 Abstract 】 ObjectiveUsingfl

3、uorescenceinsituhybridizationtoanalyzechromosomemosaicisminhumanpreimpla ntationembryosandaccesstheinfluenceofmosaicismoninvitrofertilization-embryotransfer(IVF-ET)a ndpreimplantationgeneticdiagnosis.MethodsNormalfertilizedembryos,whichwerenotsuitablefore mbryotransferandcryopreservation,andmaleembr

4、yosinpreimplantationgenderdiagnosiswereanal yzedbyfluorescenceinsituhybridization.ResultsTwohundredandninetythreenucleuseswerefounda mong38embryos.Thehybridizationratewas96.2%.Twelveembryos(31.6%)werenormal.Twenty-eigh tembryos(73.7%)werediploidembryos,whichincludednormaldiploidembryosandembryoswith

5、dipl oidmoscaicism.Inaddition,19(50.0%)embryoswereconsideredtobechromosomalmosaicsduetodipl oidmosaicismandabnormalmosaicsm. Thefrequencyofmosaicismincreasedfrom18.2%in-stag4celleembryosto68.4%and50.0%in58cell-stageand > 9cstageembryosrespectively.ConclusionThefrequencyofMosaicismincreaseswit hsu

6、ccessivecleavagedivisions.Moscaicismmaybeoneoftheimportantfactorsaffectingthesuccessrat esinIVF-ET.Identificationofsexbyanalysisofasinglecleavagecellisaccurate;however,itwouldbebettert obiopsy2cellstoreduceerrorsinpreimplantationgeneticdiagnosisofsinglegenediseases.【Keywords】 Insituhybridization,flu

7、orescence;Mosaicism;Preimplantationdiagnosis 人類生育能力較大多數哺乳類動物低， 35 歲以下有生育能力的婦女每個排卵周期只有 1/4 的 受 孕 可 能 1 。 而 在 常 規 試 管 嬰 兒 體 外 受 精 - 胚 胎 移 植 (invitrofertilization-embryotransfer,IVF-ET) 中，每一胚胎移植周期的成功率也只有1/4 左右 1 。單純形態學參數只能粗略地估計胚胎的發育潛能，而 80 年代初，人們在研究胚胎的形態和 著床的關系時發現，人類胚胎的染色體異常可能是影響胚胎著床的重要因素2。近年來，在應用熒光原位雜

8、交( fluorescenceinsituhybridization,FISH )技術，分析植入前胚胎也證實， 染色體嵌合型不管在形態正常與否的胚胎中均占有一定的比例3。我們從 1998年11月開始，應用雙色 FISH分析胚胎的性染色體，1999年5月開始加用18號染色體探針進行三色 熒光原位雜交技術，現將結果報道如下。資料與方法一、研究對象取1998年11月1999年8月，本生殖醫學研究中心IVF-ET治療周期中胚胎質量差、不適于胚胎移植和冷凍保存的正常受精胚胎以及在植入前胚胎性別診斷中，診斷為男性胚胎、 不能移植的胚胎共 38個為研究對象，在受精后第 24天進行固定。二、方法1細胞固定：將

9、胚胎置于酸性酞假設液內，當透明帶被消化后轉移到N-2-羥乙基哌嗪-N，-2-乙磺酸(hepes)緩沖液內，用細管吹打至細胞散開。取單個細胞放在已滴有1卩ITween20/鹽酸(0.1%Tween-20,0.01mol/L 鹽酸)的玻片上，在解剖鏡下觀察直至細胞溶解。待玻片枯燥后， 在磷酸鹽緩沖液內洗 5min，然后依次用70%、85%和100%的乙醇脫水。玻片可在-20C保存 4,5。2. 對照淋巴細胞的培養：用淋巴細胞行FISH 雜交率的對照。將染色體正常的成年男性外周血0.6ml參加5ml淋巴細胞培養液 RPMI1640中，搖勻后置于 37C培養箱中培養 66h。在培 養終止前參加秋水仙素

10、(2卩g/ml,0.5ml),然后用低滲液 0.075mol氯化鉀和固定液(甲醇： 冰醋酸為3 : 1)處理。最后將細胞懸液滴在清潔的玻片上，鏡下觀察染色體的分散情況， 玻片在-20 C保存。3. FISH選用美國Vysis公司的染色體計數探針。其中X染色體探針用橙色標記，Y染色體探針用綠色標記，18號染色體探針用綠藍色標記。變性時將玻片置于 73C70%的甲酰氨中5min ,然后參加73 C已變性并混有雜交液的探針。蓋上蓋玻片后用橡皮水泥封口，37C雜交爐內雜交24h。雜交完成后，將玻片置于73C0.4 >氯化鈉/檸檬酸鈉緩沖液/0.3%乙基苯基聚乙二醇(0.4 x SSC/0.3%N

11、onidetP-4)中 2min 和室溫下 2X SSC/0.1%NonidetP-40中 1min 洗脫非 特異性雜交，最后參加10卩14, 6-diamidino-2-plenylindole(DAPI)復染劑復染后在奧林巴斯BX60熒光顯微鏡下分別用羅丹明、異硫氰酸熒光素和Aqua濾片觀察結果。4. 結果評定 :當細胞同時出現紅綠信號各1 個和兩個綠藍色信號時,診斷為男性胚胎(XY,1818)。僅當同時出現兩個紅色和兩個綠藍色信號時,才診斷為女性胚胎(XX, 1818)。如果信號有分裂, 但兩個信號非常接近, 互相有交叉或并排排列的兩者之間距離小于信號大小 的一半時判斷為一個信號 6,7

12、。根據 Delhanty 等 1的分類標準,將胚胎分成正常和異 常兩大類。 正常胚胎即全部細胞核均為正常二倍體。 異常胚胎再分為嵌合型、 異常非嵌合型 以及無規律分裂型 3 類。根據嵌合型胚胎中占主導的細胞為正常二倍體還是其他異常核型, 將其再分為二倍體嵌合型和異常嵌合型。三、統計學方法采用x2僉驗和相關分析。結果一、對照淋巴細胞僉測結果在對照的 507 個男性淋巴細胞中,99.6%的淋巴細胞有雜交信號,94.9%顯示正常男性核型XY 1818，異常核型包括 3 個 XO, 1818, 5 個 YO, 1818, 5 個 XY 18 , 3 個 XYY 1818 , 1 個 XXY 1818。

13、二、FISH結果38 個胚胎共有 293 個核 282 個核有雜交信號 雜交率為 96.2%。 11 個核無雜交信號。正 常胚胎 12個 占 31.6% 二倍體胚胎(正常胚胎 +二倍體嵌合型胚胎)28個 占 73.7% 嵌合型胚胎(二倍體嵌合型胚胎 +異常嵌合型胚胎)19個 占 50.0%。 8個加用 18號染色體探針的二倍體嵌合型胚胎中 單倍體 /二倍體 2個 三倍體 /二倍體 1 個 四倍體/二倍體 1 個 非整倍體 4 個 其中單體性 1 個 染色體不別離 3個。 3個異常非嵌合型胚胎和 4個無規律 分裂型胚胎的碎片均 > 25.0%不同分裂期胚胎中，嵌合型胚胎所占比例不同。在W4

14、田胞期胚胎中，嵌合型胚胎占 18.2%,但在58細胞期和細胞期胚胎中，嵌合型胚胎的比例分別增至68.4%和50.0%，兩者比較，差異有顯著性(PV 0.05)。隨著分裂次數的增加，二倍體嵌合型胚胎中，嵌合型細胞的比 例隨著胚胎細胞數目的增加而明顯減少(r=0.74，P=0.001)。討論一、嵌合型的發生率及其影響因素Munne等8在比擬了 4個中心的胚胎 FISH結果后報道，胚胎染色體嵌合型的發生率波動 在11%52%。嵌合型及其他染色體異常發生率的波動受以下因素影響：(1)卵子培養和操作時溫度的改變； (2)母親年齡； (3)培養時氧濃度； (4)超排卵方案； (5)胚胎的形態及發育； (6

15、) 有無多核細胞； (7)檢測染色體的數目和號數。其中，培養系統和超排卵方案影響最大。本 研究中正常二倍體胚胎12個占31.6%,與Laverge等9的結果相近，嵌合型胚胎比例偏高，占 50.0%，這可能與局部胚胎質量差、樣本量少和培養系統不同等因素有關。二、嵌合型的發生機理一般認為，由于有絲分裂時發生錯誤染色體不別離或 1 2 個細胞極性改變可形成嵌合型胚 胎。嵌合型發生的時間與卵裂有關。 本研究中嵌合型胚胎所占的比例隨著胚胎細胞數目的增 多而明顯增加， 提示隨著卵裂次數的增加， 有絲分裂發生錯誤的風險也增加，所以嵌合型胚胎所占的比例也隨之而增加。 但嵌合型胚胎中嵌合型細胞的比例卻隨之而降低

16、， 如果嵌合型 發生于第 1 次卵裂時，那么所有細胞均不正常，嵌合型發生于第2、3 次卵裂時，其不正常細胞分別為 50.0%和 25.0% 6。本研究結果也支持這種觀點。近年來， 在進行卵子和胚胎極性的研究中， 有學者提出嵌合型可能是胚胎發育過程中的正常 現象。 嵌合型細胞可能發育較慢或停滯， 并有可能開展為滋養外胚層細胞， 而不開展為內細 胞團， 所以不一定會影響胚胎的正常發育。 因此， 胎兒的染色體異常率遠沒有胚胎的異常率 高 10。三、胚胎嵌合型對IVF的影響在常規IVF中，胚胎的形態是最重要的評定胚胎質量的指標。但胚胎的形態學改變并不一定 能真實地反映胚胎的發育潛能。 雖然在形態正常的

17、胚胎中嵌合型胚胎的比擬低， 但亦占有一 定的比例。 1995 年 Munne 等 3將胚胎分為發育停滯，發育緩慢和有碎片及正常形態3組進行X,Y18,13/21號染色體的FISH,結果嵌合型胚胎分別為39.6%, 25.2%和14.1%, 3組之間差異有顯著性。 本研究中也可見無規律分裂的胚胎和異常非嵌合型胚胎的形態較差，胚胎碎片均 25.0%另外也有學者分析了其他染色體，如Delhanty等1報道，用X, Y和1號染色體探針三色 FISH檢測，有嵌合型的胚胎占30.0%。由于存在一定比例的染色體異常，因此在常規IVF中，每個胚胎移植周期的成功率一直在25%左右。從另一個角度來說，這可能也反映

18、了人類對異常胚胎的自然選擇和淘汰。四、染色體嵌合型對植入前診斷的影響盡管胚胎中有一定比例的嵌合型，但嵌合型不會對胚胎的性別診斷有影響11。本研究男性胚胎中無一例出現 2個X信號和2個18號染色體信號。但據報道，XO在男性胚胎中約占 12.0% 5,11，因此不能單憑1個X信號就診斷為女性胚胎。本研究中還有一個無規律分裂 的胚胎核型為 XXXX， 1818/XY， 1818/XY， 18/Y， 1818/3 個 XO， 1818，如果僅活檢 XXXX， 1818 并將其診斷為女性胚胎也會造成誤診。所以必須同時出現2個X信號和2個18號染色體信號時才診斷為女性胚胎。在本研究后期加用 18號染色體探針從而可以區分單體性和單