1、WB注意事項(xiàng)及常見(jiàn)問(wèn)題注意事項(xiàng)一、 樣本收集1. 組織樣本原則上要求客戶或我們的技術(shù)員把組織分切剪碎至研磨管（根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要告知他們?nèi)《嗌俳M織），并加入適量裂解液和研磨珠，然后放置于-80保存。具體詳情參照“組織樣本收集注意事項(xiàng).doc”；2. 細(xì)胞樣品原則上要求客戶或我們的技術(shù)員不要用胰酶把細(xì)胞消化下來(lái)，特別是分選對(duì)象是膜蛋白時(shí)，具體詳情參照“細(xì)胞樣品收集注意事項(xiàng).doc”；二、 總蛋白提取1. 組織樣品具體詳情參照“組織樣本收集注意事項(xiàng).doc”；記得加入蛋白酶抑制劑，如果分選對(duì)象是磷酸化蛋白時(shí)，記得加入磷酸化酶抑制劑；2. 細(xì)胞樣品具體詳情參照“細(xì)胞樣品收集注意事項(xiàng).doc”；記得加入蛋

2、白酶抑制劑，如果分選對(duì)象是磷酸化蛋白時(shí)，記得加入磷酸化酶抑制劑；三、 蛋白樣本保存裂解細(xì)胞或組織提取總蛋白時(shí)，細(xì)胞碎片沉淀一般-20保存以防萬(wàn)一，提取好的蛋白樣品分裝2份，一份加入上樣緩沖液變性后-20保存，一份直接-20保存；四、 蛋白變性提取好的總蛋白取一部分（不是全部）加入上樣緩沖液進(jìn)行加熱變性（100，5min），變性好的蛋白應(yīng)該-20保存，凍融后不再需要加熱變性；五、 SDS-PAGE1. 濃縮膠的膠濃度一般為5%，用于壓沉樣品；2. 分離膠的膠濃度取決于分析對(duì)象的分子量大小，詳情見(jiàn)Western Blotting 全攻略.pdf第4頁(yè)；3. 分離膠和濃縮膠的高度比為8:3；4. 電

3、泳結(jié)束后，應(yīng)及時(shí)用清洗干凈玻璃板，清洗時(shí)應(yīng)使用海綿擦布，切勿使用刷子，以免刮花玻璃板；5. 電泳結(jié)束后，應(yīng)及時(shí)沖洗電泳槽，以免鹽離子沉積，導(dǎo)致電泳絲腐蝕；6. 清洗電泳芯時(shí)，一定要注意別弄段電泳絲；六、 轉(zhuǎn)膜1. 注意海綿墊，濾紙（轉(zhuǎn)膜專用濾紙），轉(zhuǎn)印膜，膠的疊放位置，以保證正確的轉(zhuǎn)印方向；2. 注意海綿墊，濾紙（轉(zhuǎn)膜專用濾紙），轉(zhuǎn)印膜，膠的相對(duì)大小，以免造成短路；3. 轉(zhuǎn)印結(jié)束后，應(yīng)及時(shí)取出轉(zhuǎn)印膜，并立即用TBST漂洗1-2遍，并立即加入封閉液，這樣可以避免膜上的雜質(zhì)殘留或膜變干導(dǎo)致背景高的問(wèn)題；4. 轉(zhuǎn)印結(jié)束后，應(yīng)及時(shí)沖洗轉(zhuǎn)印槽和轉(zhuǎn)印芯，以免鹽離子沉積，導(dǎo)致電泳絲腐蝕；5. 轉(zhuǎn)印結(jié)束后，應(yīng)

4、及時(shí)用水泡洗海綿墊和濾紙，以免鹽離子沉積，導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜時(shí)短路，并放在籃子上晾干，如果海綿墊和濾紙不及時(shí)晾干，容易導(dǎo)致海綿墊和濾紙內(nèi)部的結(jié)構(gòu)破壞；七、 封閉1. 進(jìn)行封閉時(shí)，應(yīng)加入足量的封閉液（以完全覆蓋膜為底限），并保證整個(gè)封閉過(guò)程中，膜與封閉液充分接觸，避免長(zhǎng)時(shí)間離開(kāi)封閉液，特別進(jìn)行4靜止封閉過(guò)夜時(shí)，一定要加入足量的封閉液和保證平坦放置；上述注意事項(xiàng)主要為了避免膜變干，導(dǎo)致背景升高；八、 一抗雜交1. 一抗的稀釋比例：第一次使用時(shí)參考具體抗體說(shuō)明書(shū)建議的稀釋比例，并根據(jù)實(shí)際的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行調(diào)整；2. 雜交條件：如果是室溫孵育，至少保證孵育1-2小時(shí)，并放置脫色搖床上進(jìn)行搖晃，如果是4孵育，應(yīng)孵育過(guò)

5、夜，可靜止亦可放置脫色搖床上進(jìn)行搖晃；3. 應(yīng)使用專用的一抗稀釋液進(jìn)行稀釋，使用后進(jìn)行回收并4保存，如果回收的稀釋抗體用沉淀或長(zhǎng)菌，應(yīng)丟棄；九、 一抗雜交后洗膜1. 一般使用標(biāo)準(zhǔn)的TBST緩沖液，如果判斷因?yàn)槭且豢沟脑驅(qū)е碌谋尘斑^(guò)高，可以把NaCl的濃度提高到500 nM (標(biāo)準(zhǔn)的為150nM);2. 一般洗滌3次，每次10min，如果判斷因?yàn)槭且豢沟脑驅(qū)е碌谋尘斑^(guò)高，可以把洗滌次數(shù)提高到4-6次；十、 二抗雜交1.二抗的稀釋比例：第一次使用時(shí)參考具體抗體說(shuō)明書(shū)建議的稀釋比例，并根據(jù)實(shí)際的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行調(diào)整；2.雜交條件：一般室溫孵育，孵育1小時(shí)即可（時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生非特異雜交，從而導(dǎo)致背景過(guò)

6、高），并放置脫色搖床上進(jìn)行搖晃（一定要避免膜變干，否則背景其高）；3.應(yīng)使用封閉液進(jìn)行稀釋，使用后進(jìn)行不回收；十一、 二抗雜交后洗膜1.一般使用標(biāo)準(zhǔn)的TBST緩沖液，如果判斷因?yàn)槭且豢沟脑驅(qū)е碌谋尘斑^(guò)高，可以把NaCl的濃度提高到500 nM (標(biāo)準(zhǔn)的為150nM);2.一般洗滌3次，每次10min，如果判斷因?yàn)槭且豢沟脑驅(qū)е碌谋尘斑^(guò)高，可以把洗滌次數(shù)提高到4-6次；十二、 拍照1. 注意選擇曝光時(shí)間，同時(shí)兼顧工作效率，因選擇連續(xù)拍照模式，這樣總有一個(gè)何時(shí)曝光時(shí)間；十三、 報(bào)告單整理1. 原始圖片；2. 對(duì)比度和亮度調(diào)整的圖片；3. 圖片說(shuō)明：上樣順序；4. 灰度值：原始值，數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化（同

7、一個(gè)樣品的目標(biāo)蛋白的灰度值除以內(nèi)參蛋白的灰度值），相對(duì)表達(dá)量（實(shí)驗(yàn)樣品的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化比值除以參照樣品（問(wèn)客戶）的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化比值），參照樣品的相對(duì)表達(dá)量一定為1；5. 實(shí)驗(yàn)方法：準(zhǔn)確的一抗，二抗，稀釋比例；常見(jiàn)問(wèn)題一、 沒(méi)信號(hào)1. 膜一片空白，沒(méi)有任何條帶，陽(yáng)性對(duì)照樣品也無(wú)條帶：實(shí)驗(yàn)失??？抗體失效？；重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，重新稀釋抗體；2. 膜一片空白，沒(méi)有任何條帶，陽(yáng)性對(duì)照樣品有條帶：實(shí)驗(yàn)樣品降解？實(shí)驗(yàn)樣品無(wú)該蛋白的表達(dá)？轉(zhuǎn)膜效率過(guò)低？；重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，復(fù)核查找上述原因，以尋找對(duì)策；二、 背景過(guò)高1. 目的條帶以外的區(qū)域有信號(hào)，如果是片狀，甚至整塊膜，一般是封閉不好，膜變干，一抗非特異雜交或二抗的非特異雜交導(dǎo)致；如果是條紋狀，一般是由于膜上有壓痕導(dǎo)致，如果是點(diǎn)狀，一般是膜上有雜質(zhì)，或泡膜時(shí)膜沒(méi)有充分浸泡；三、 雜帶1. 目的帶以外的信號(hào)條帶為雜帶，一般由于一抗的特異性不好所導(dǎo)致，如果目的帶比雜帶信號(hào)強(qiáng)，可通過(guò)減低一抗的稀釋比例，并縮短雜交時(shí)間解決；如果目的帶比雜帶信號(hào)弱，在不減低一抗的稀釋比例的前提下，縮短雜交時(shí)間；并提高TBST緩沖液的NaCl的濃度提高到500 nM；2. 雜帶如果與目的帶的位置相距較遠(yuǎn)，可以不優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，直接裁剪即可，雜帶如果與目的帶的位置相距較進(jìn)，應(yīng)調(diào)整膠濃度，并延長(zhǎng)電泳時(shí)間，已經(jīng)采取上述解決方法；四、 目的帶弱1. 一抗效價(jià)低：提