1、生物學抗體免疫技術 基本概念基本概念抗原的制備：顆粒抗原、半抗原、人工抗原抗原的制備：顆粒抗原、半抗原、人工抗原抗體的制備：多克隆抗體、單克隆抗體、基因工程抗體抗體的制備：多克隆抗體、單克隆抗體、基因工程抗體第三第三章章抗原抗體反抗原抗體反應應 可對抗原或抗體進行可對抗原或抗體進行定性、定量、定位的定性、定量、定位的檢測檢測 抗體抗原以非共價鍵抗體抗原以非共價鍵結合結合 不可見反應：幾秒不可見反應：幾秒-幾分鐘幾分鐘 可見反應：數分鐘可見反應：數分鐘（小時、日）（小時、日） 影響因素影響因素 電解質電解質 溫度溫度 酸堿度酸堿度第三第三章章酶聯免疫法酶聯免疫法放射免疫法放射免疫法熒光免疫法熒光

2、免疫法其他其他第三第三章章酶聯免疫法（酶聯免疫法（enzyme immunoassay) 以酶標記抗體或抗原進行的抗體抗原反應以酶標記抗體或抗原進行的抗體抗原反應 酶結合物應具有雙功能：酶結合物應具有雙功能： 高度特異的免疫反應、生物催化放大作用高度特異的免疫反應、生物催化放大作用 基本方法基本方法 間接法間接法 雙抗體夾心法雙抗體夾心法 競爭法競爭法 生物素生物素-親和素系統（親和素系統（biotin-avidin system，BAS） 某些新進展某些新進展酶聯免疫吸附酶聯免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assayenzyme linked immunos

3、orbent assay） 間接法間接法1、將已知可溶性抗原吸附于載體、將已知可溶性抗原吸附于載體2、溫育后清洗、溫育后清洗3、加入可能含特異性抗體的待檢液、加入可能含特異性抗體的待檢液4、溫育后清洗、溫育后清洗5、加入酶標記的二抗、加入酶標記的二抗6、溫育后清洗、溫育后清洗7、加入酶作用底物、加入酶作用底物8、測定反應顏色深淺、測定反應顏色深淺 雙抗體夾心法雙抗體夾心法1、將已知抗體吸附于載體上、將已知抗體吸附于載體上2、溫育后清洗、溫育后清洗3、加入可能含特異性抗原的待檢液、加入可能含特異性抗原的待檢液4、溫育后清洗、溫育后清洗5、加入酶標記特異性抗體、加入酶標記特異性抗體6、溫育后清洗、

4、溫育后清洗7、加入酶作用底物、加入酶作用底物8、測定顏色反應深淺、測定顏色反應深淺酶聯免疫吸附酶聯免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assayenzyme linked immunosorbent assay） 競爭法競爭法1、將已知抗體吸附于載體上、將已知抗體吸附于載體上2、溫育后清洗、溫育后清洗3、加入可能含特異性抗原的待檢液、加入可能含特異性抗原的待檢液和酶標記的已知抗原液和酶標記的已知抗原液4、溫育后清洗、溫育后清洗5、加入酶作用底物、加入酶作用底物6、測定顏色反應深淺、測定顏色反應深淺酶聯免疫吸附酶聯免疫吸附（enzyme linked immunos

5、orbent assayenzyme linked immunosorbent assay） 生物素生物素-親和素系統（親和素系統（biotin-avidin system） 基本概念基本概念 生物素：是一種維生素生物素：是一種維生素H，經活化后，可與抗體、抗原、酶以多，經活化后，可與抗體、抗原、酶以多 配一的方式共價結合，且不影響它們的活性配一的方式共價結合，且不影響它們的活性 親和素：從卵蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，可與酶偶合，以親和素：從卵蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，可與酶偶合，以1配多的方式對生物素有很強的親和力配多的方式對生物素有很強的親和力 BAS用于檢測的基本方法：用于檢測的基本

6、方法： BAB法或法或BRAB法法 BA法法 ABC法法酶聯免疫吸附酶聯免疫吸附（enzyme linked immunosorbent enzyme linked immunosorbent assayassay）酶聯免疫吸附酶聯免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assayenzyme linked immunosorbent assay） 均相酶免疫測定法均相酶免疫測定法 無需無需“固定在載體固定在載體上上”；無需；無需“溫育后清溫育后清洗洗” 斑點免疫結合試驗斑點免疫結合試驗 以微孔薄膜為載體，以微孔薄膜為載體，酶免疫反應陽性結果在酶免疫反應陽性結果在膜上

7、出現色斑點膜上出現色斑點 膠體金標記較酶標記膠體金標記較酶標記更為簡便更為簡便酶聯免疫吸附酶聯免疫吸附（enzyme linked immunosorbent enzyme linked immunosorbent assayassay）豬肉和尿液鹽酸克倫特羅的豬肉和尿液鹽酸克倫特羅的免疫膠體金法快速檢測免疫膠體金法快速檢測瘦肉精中毒事件瘦肉精中毒事件l 20002000年以來，內地相繼發生年以來，內地相繼發生1818起瘦肉精中毒事件，中毒人數達起瘦肉精中毒事件，中毒人數達17001700多人，死亡多人，死亡1 1人（不包括上海人（不包括上海20062006年集體中毒事件）年集體中毒事件）l

8、瘦肉精殘留及危害不容忽視，瘦肉精替代品暗潮涌動瘦肉精殘留及危害不容忽視，瘦肉精替代品暗潮涌動l 上海上海9.139.13瘦肉精食物中毒事件（瘦肉精食物中毒事件（20062006年）年）l “瘦肉精瘦肉精”學名為鹽酸克倫特羅，醫學上又稱克喘素，常用于治療哮學名為鹽酸克倫特羅，醫學上又稱克喘素，常用于治療哮喘。喘。l 由于鹽酸克倫特羅添加于飼料飼喂動物后可明顯促進動物生長由于鹽酸克倫特羅添加于飼料飼喂動物后可明顯促進動物生長, ,提高提高 瘦肉率瘦肉率, , 所以養殖戶稱其為所以養殖戶稱其為“瘦肉精瘦肉精”，曾在國內外廣泛用于動物飼，曾在國內外廣泛用于動物飼養養l 生豬食用瘦肉精后皮毛光亮，呼吸急

9、促，個別會出現腿抽搐，站不生豬食用瘦肉精后皮毛光亮，呼吸急促，個別會出現腿抽搐，站不 穩，爬坡困難；宰后豬的肌肉特別鮮紅，后臀肌肉飽滿，肥肉非常薄穩，爬坡困難；宰后豬的肌肉特別鮮紅，后臀肌肉飽滿，肥肉非常薄瘦肉精介紹瘦肉精介紹瘦肉精介紹瘦肉精介紹l “瘦肉精瘦肉精”化學性質特別穩定，加熱到化學性質特別穩定，加熱到170時才能被分解，故一時才能被分解，故一般家庭廚房加熱不能將其分解破壞般家庭廚房加熱不能將其分解破壞l 食用后在胃腸道吸收快，作用維持時間持久。中毒后主要癥狀表食用后在胃腸道吸收快，作用維持時間持久。中毒后主要癥狀表現為頭疼、頭暈、心悸、心慌、面色潮紅、四肢發抖等癥狀現為頭疼、頭暈、

10、心悸、心慌、面色潮紅、四肢發抖等癥狀l 違法者使用該物質以提高豬的瘦肉率和顏色鮮艷程度，不知情的違法者使用該物質以提高豬的瘦肉率和顏色鮮艷程度，不知情的市民市民 錯誤地認為這樣的肉才是錯誤地認為這樣的肉才是“好肉好肉”而特別喜歡選購而特別喜歡選購l 食品衛生法食品衛生法l食品添加劑衛生管理辦法（食品添加劑衛生管理辦法（GB2760）l動物性食品中獸藥殘留最高限量（農業部公告第動物性食品中獸藥殘留最高限量（農業部公告第235號，號， 2002年年12月月24日）規定：禁用藥物，動物性食品中不得檢出：日）規定：禁用藥物，動物性食品中不得檢出： 瘦肉精、沙丁胺醇、西馬特羅等瘦肉精、沙丁胺醇、西馬特羅

11、等31種種l 違法者的法律責任：民事賠償、行政處罰、刑事處罰違法者的法律責任：民事賠償、行政處罰、刑事處罰法律規定法律規定鹽酸克倫特羅殘留檢測方法鹽酸克倫特羅殘留檢測方法 l 動物性食品中克倫特羅殘留量的測定動物性食品中克倫特羅殘留量的測定 （GB5009.192-2003） 第三法：酶聯免疫法（第三法：酶聯免疫法（ELISA篩選法）篩選法） ，檢出限：，檢出限：0.5ppb l 動物組織中鹽酸克倫特羅的測定動物組織中鹽酸克倫特羅的測定氣相色譜氣相色譜/質譜法質譜法l 動物尿液中鹽酸克倫特羅的測定動物尿液中鹽酸克倫特羅的測定氣相色譜氣相色譜/質譜法質譜法l 尿液中鹽酸克侖特羅的測定膠體金免疫層

12、析法尿液中鹽酸克侖特羅的測定膠體金免疫層析法 豬肉全程監控中瘦肉精檢測方法的選擇豬肉全程監控中瘦肉精檢測方法的選擇生豬飼養生豬飼養屠宰場屠宰場大型批發市場大型批發市場零售市場零售市場飼料檢測飼料檢測豬尿檢測豬尿檢測豬尿檢測豬尿檢測豬肉檢測豬肉檢測豬肉豬肉檢測檢測豬肉豬肉檢測檢測酶聯免疫法酶聯免疫法免疫膠體金免疫膠體金免疫膠體金免疫膠體金酶聯免疫法酶聯免疫法免疫膠體金免疫膠體金篩檢陽性篩檢陽性GC-MSGC-MS確認確認大型儀器確認大型儀器確認政府部門政府部門監督抽檢監督抽檢GC-MS餐飲業餐飲業豬肉豬肉檢測檢測免疫膠體金免疫膠體金銷毀和溯源銷毀和溯源陽性陽性GC-MSGC-MS確認確認大型儀器

13、確認大型儀器確認陽性陽性免疫膠體金快速檢測板的外觀圖免疫膠體金快速檢測板的外觀圖 免疫膠體金快速檢測板免疫膠體金快速檢測板(試劑試劑)的結構圖的結構圖檢測原理檢測原理l 鹽酸克倫特羅快速檢測試劑板的中央膜面上固定有兩條隱形線，克鹽酸克倫特羅快速檢測試劑板的中央膜面上固定有兩條隱形線，克倫特羅抗原固定在測試區作為檢測線（倫特羅抗原固定在測試區作為檢測線（T T線），二抗固定在質控區作線），二抗固定在質控區作為對照線（為對照線（C C線）。線）。l 當待檢樣品溶液滴入試劑板加樣孔后，樣品溶液因層析作用往上擴當待檢樣品溶液滴入試劑板加樣孔后，樣品溶液因層析作用往上擴散。如果樣品溶液含有相應藥物的殘留

14、，藥物將和膠體金顆粒上的散。如果樣品溶液含有相應藥物的殘留，藥物將和膠體金顆粒上的抗體先行反應，因此當膠體金顆粒隨樣品溶液擴散至抗體先行反應，因此當膠體金顆粒隨樣品溶液擴散至T T線時，膠體金線時，膠體金顆粒上抗體活性位點將因被樣品溶液中的藥物占據而無法與顆粒上抗體活性位點將因被樣品溶液中的藥物占據而無法與T T線上藥線上藥物抗原結合；所以當樣品中鹽酸克倫特羅含量物抗原結合；所以當樣品中鹽酸克倫特羅含量1ppb(1ppb(檢測限檢測限) )以上時，以上時，試劑板上的試劑板上的T T線將較線將較C C線顯色淡或甚至無顯色，判定為陽性。反之，線顯色淡或甚至無顯色，判定為陽性。反之，當樣品中鹽酸克倫

15、特羅含量在當樣品中鹽酸克倫特羅含量在1ppb1ppb以下或無殘留時，試劑板上的以下或無殘留時，試劑板上的T T線線顯色與顯色與C C線相近或偏深，判定為陰性線相近或偏深，判定為陰性l靈敏度靈敏度 肉樣或組織樣：肉樣或組織樣：1ppb(1ppb(標準前處理標準前處理) )或或5ppb5ppb（簡單前處理）（簡單前處理） 尿樣：尿樣： 1ppb( 1ppb(標準前處理標準前處理) )l特異性：與沙丁胺醇等苯乙胺類藥物沒有交叉反應；特異性：與沙丁胺醇等苯乙胺類藥物沒有交叉反應；l準確性：與瘦肉精準確性：與瘦肉精ELISAELISA試劑盒的檢測結果符合率試劑盒的檢測結果符合率9090l有效期：半年（冷藏閉光保存）有效期：半年（冷藏閉光保存）膠體金免疫層析法檢測瘦