1、依達拉奉在鼠氧自由基心肌損害和人病毒性心肌炎中的抗氧化作用研究        【摘要】     目的 研究依達拉奉在鼠氧自由基(OFR)心肌損害和人病毒性心肌炎(VMS)中的抗氧化作用。方法 通過檢測大鼠心肌細胞培育液的心肌細胞存活力(CMV)，超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)，肌鈣蛋白T(cTnT)指標以對比依達拉奉、維生素C和輔酶Q10 對經氧自由基預處理的心肌細胞的保護作用。檢測治療前后血清SOD，MDA, cTnT指標以對比依達拉奉、維生素C和輔酶

2、Q10 對VMS患者的治療作用。結果 (1)大鼠實驗示：依達拉奉組CMV高于維生素C組(P<0.05)和輔酶Q10 組(P<0.05),SOD活性高于維生素C(P<0.05);MDA低于維生素C組(P<0.05)及輔酶Q10 組(P<0.05); cTnT低于維生素C組(P<0.05)及輔酶Q10 組(P<0.05)。(2)VMS研究示：經治療，依達拉奉組患者SOD活性上升高于維生素C組及輔酶Q10 組(均為P<0.05); MDA和cTnT下降高于維生素C組及輔酶Q10 組( MDA均為P<0.01，cTnT均為P<0.05)。結論

3、 依達拉奉在鼠OFR心肌損害和VMS的抗氧化治療中有明顯效果。     【關鍵詞】  依達拉奉;氧自由基;病毒性心肌炎    The Anti-oxygen Effect of Edaravone on the Injured Myocardial Cells of Rats by Oxygen Free Radicalsand on Those of Patients with Viral MyocarditisDai Min, Liu Jing, Wu Yi, the Heart Center, th

4、e Central Hospital of Mianyang City, Sichuan Province 621000, P.R.ChinaABSTRACT Objective To study the anti-oxygen effect of edaravone on the injured myocardial cells of rats by oxygen free radicals (OFR) and on those of patients with viral myocarditis. Methods The detected index of cardiomyocytes v

5、iability (CMV), superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) and troponin T (cTnT) of the injuried myocardial cells of rats by OFR were applied in the comparative observation of the protective effect of edaravone, Vitamin C and coenzyme Q10 on the myocardial cells pre-prepared by OFR; the index

6、 of SOD, MDA and cTnT in serum detected before and after treatment were applied in the comparative observation of the therapeutic effect of edaravone, Vitamin C and coenzyme Q10 on patients with viral myocarditis (VMS). Results (1) The experiment on rats showed out: the CMV in edaravone group was hi

7、gher than that in Vitamin C group (P<0.05) and that in coenzyme Q10 group (P<0.05); the SOD activity in edaravone was higher than that in Vitamin group (P<0.05); the MDA and cTnT in edaravone group were lower than those in Vitamin C group (P<0.05) and those in coenzyme Q10 group (P<0.

8、05). (2) The observation of the patients with VMS showed out: the SOD activity of the patients in edaravone group rose higher than that in Vitamin C group (P<0.05) and that in coenzyme Q10 group (P<0.05); the decrease of MDA and cTnT in edaravone group was more significant that that in Vitamin

9、 C group (P<0.01) and that in coenzyme Q10 group (P<0.05). Conclusions Edaravone is of obvious effect on the injuried myocardial cells of rats and in anti-oxygen treatment of the patients with VMS.KEYWORDS edaravone oxygen free radicals viral myocarditis國內外多項研究已證實氧自由基(oxygen free radicals OFR)

10、對心血管系統的損害1-2,OFR參與了心肌炎、心力衰竭、克山病和冠心病等多種心血管疾病的發生發展過程3，尤其在病毒性心肌炎(VMS)的過氧化損害中起重要作用。目前VMS的抗氧化治療主要是大劑量維生素C4,但劑量過大可使血液酸度升高，對心肌亦有損害。其他抗氧化劑如輔酶Q10存在難溶解，易沉淀，質量不穩定等工藝問題。依達拉奉(Edaravon 3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮)是一種新型氧自由基清除劑5，該藥能高效清除病變部位氧自由基，在腦缺血再灌注損傷的治療中有一定療效，因此用于VMS的抗氧化治療應具有很大潛力。本研究旨在觀察依達拉奉對氧自由基所致大鼠心肌損害的保護作用和對人VMS的治療作

11、用，探討其機制，為臨床尋找VMS抗氧化治療的可行方法提供參考。1 材料與方法1.1 研究對象和材料 (1)實驗動物：wistar大鼠乳鼠10只，購于四川大學華西醫學中心，平均體重(250±20)g(合格證號：川實動管第70號)。(2)臨床患者：2007年5月2009年6月間就診于我院滿足：發病1周內，肌鈣蛋白T(cTnT)陽性，特異型柯薩奇B組病毒(CVB)IgM陽性，符合1999年全國心肌炎心肌病專題研討會提出的成人急性心肌炎診斷參考標準的患者30名，平均(18.71±5.62)歲。(3)材料：小牛血清由成都華西生物研究所提供;DMEM培養基、胰蛋白酶由GIBCO公司(美

12、國)提供;依達拉奉注射液(10mg/5ml)由先聲藥業提供(國藥準字H20031342);輔酶Q10注射液(5mg/250ml)由西南藥業提供(國藥準字H10061135);丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)實劑盒均購于南京建成生物工程研究所。1.2 方法1.2.1 動物實驗1.2.1.1 模型制作及指標測定 參考文獻6方法在四川大學華西基礎醫學與法醫學院實驗室進行大鼠模型制作：wistar大鼠無菌條件下開胸取心，剪碎，胰蛋白酶消化成單細胞，用含胎牛血清、青霉素、鏈霉素的DMEM培養基制成心肌細胞懸液。接種于六孔

13、板，密閉靜置37培養，第3天供實驗用。用Mossman法測定心肌細胞存活力(CMV);肌鈣蛋白T(cTnT)測試儀測算cTnT濃度;硫代巴比妥酸(TBA)法測算MDA活性;黃嘌呤氧化酶法測算SOD活力。1.2.1.2 實驗分組及指標測算 大鼠心肌細胞隨機分為5組：第組：對照組;第組：(H2O2組)心肌細胞培養液中加入200mol/L H2O2;第組：(H2O2 加維生素C組)培養液中加入200mol/L H2O2 和50mg/L維生素C;第組：(H2O2 加輔酶Q10組)培養液中加入200mol/L H2O2 和5mg/L輔酶Q10注射液;第組：(H2O2 加依達拉奉組)培養液中加入200mo

14、l/L H2O2 和30mg/L依達拉奉注射液。于20min后測算各組CMV，SOD活力，MDA，cTnT指標。1.2.2 臨床研究1.2.2.1 藥物干預及實驗分組 本研究程序符合人體實驗倫理標準，所有患者均需簽署知情同意書。入院后診斷為VMS的患者按計算機產生的隨機序號分為維生素C組、輔酶Q10組及依達拉奉組，均常規給予臥床休息，利巴韋林抗病毒感染及對癥治療。維生素C組(第組)給予靜脈維生素C 500mg/d;輔酶Q10組(第組)給予靜脈輔酶Q10 5mg/d;依達拉奉組(第組)給予靜脈依達拉奉50mg/d治療;療程7天。1.2.2.2 監測指標 所有患者治療前檢測血清SOD，MDA, c

15、TnT，治療7天后復查SOD，MDA, cTnT，并測算各指標治療前后差值。實驗結束后對三組患者平均年齡、性別比(男/女)、入院cTnT值和CVBIgM滴度等基本情況進行比較。1.3 統計學處理 實驗數據采用“均數±標準差(±s)”表示，應用SPSSl5.0統計軟件對實驗數據進行分析，多組間比較應用單因素方差分析，組間兩兩比較應用q檢驗。2 結 果大鼠心肌細胞實驗示(表1):(1)H2O2組心肌細胞CMV低于對照組(P<0.01)，維生素C、輔酶Q10及依達拉奉組CMV高于H2O2組(各組均為P<0.01)，但均低于對照組(各組均為P<0.01)。依達拉奉

16、組CMV高于維生素C組(P<0.05)和輔酶Q10 組(P<0.05)。(2)H2O2組 SOD活性低于對照組(P<0.01);MDA和cTnT均高于對照組(P<0.01)。維生素C、輔酶Q10及依達拉奉組SOD活性均高于H2O2組(各組均為P<0.01);MDA和 cTnT均低于H2O2組(各組均為P<0.01)。依達拉奉組SOD活性高于維生素C(P<0.05);MDA低于維生素C組(P<0.05)及輔酶Q10 組(P<0.05); cTnT低于維生素C組(P<0.05)及輔酶Q10 組(P<0.05)。VMS患者抗氧化治療實

17、驗示(表2)：依達拉奉組SOD活性上升高于維生素C組(P<0.05)及輔酶Q10 組(P<0.05);MDA下降高于維生素C組(P<0.01)及輔酶Q10 組(P<0.01);cTnT下降高于維生素C組(P<0.05)及輔酶Q10 組(P<0.05)。經統計學分析，各組患者間平均年齡、性別比(男/女)、cTnT值和CVBIgM滴度均為P>0.05，無統計學差異。表1 各組大鼠心肌細胞生化指標比較表2 各組VMS患者生化指標差值(治療前后差值的絕對值)比較注：*與、組比較P<0.01, 與、組比較P<0.053 討 論正常心肌代謝可產生H2O

18、2、·O-2、·OH等高活性物質，即所謂OFR。OFR可作用于生物膜中多不飽和脂肪酸引發脂質過氧化反應，造成心肌細胞膜脂質過氧化作用和巰基氧化作用，損傷細胞膜，使大量細胞外Ca2+進入細胞內，造成細胞內鈣超負荷，引起細胞致死性損傷。在正常情況下體內存在清除自由基和抑制自由基反應的酶系統，如SOD、GSH-PX(谷胱甘肽過氧化物酶)等，使機體維持自由基產生和清除的動態平衡，防止自由基損傷。當機體感染病毒或細菌時，中性粒細胞在吞噬微生物時耗能增加，產生大量OFR，同時免疫反應過程中產生的抗體復合物、補體等可促進吞噬細胞產生OFR,從而引起心肌過氧化損傷7。故應用抗氧化劑清除OF

19、R以治療急性VMS有一定的療效。近年臨床治療VMS的抗氧化劑主要包括維生素C、黃芪及其提取物8-9和輔酶Q10 10等,而研究發現依達拉奉作為一種新型自由基清除劑除抑制花生四烯酸脂氧合酶途徑11外，尚能有效清除羥自由基(·OH)12，故具有比傳統抗氧化劑更強的抑制過氧化損傷作用。本實驗以維生素C和輔酶Q10 作為對比劑，選擇機體內脂質過氧化的終產物MDA反映過氧化程度、SOD活性反映機體清除OFR的能力、 cTnT反映心肌細胞損傷程度，研究新型抗氧化劑依達拉奉對VMS的治療作用。結果顯示依達拉奉對氧自由基所致大鼠心肌損害的恢復CMV和SOD活性，減少MDA和cTnT升高的療效優于維生

20、素C及輔酶Q10;對VMS患者恢復SOD活性、降低MDA和cTnT的療效優于維生素C及輔酶Q10 。從動物實驗和臨床試驗兩方面證實依達拉奉的抗氧化能力優于傳統抗氧化劑，從而為臨床治療心肌炎開拓了新的治療理論和方法，為依達拉奉在臨床的應用提供了新的依據。我們的研究尚存在一定局限性，如樣本數量較小，不能完全除外入選患者混雜因素的影響。確切結論仍需大樣本多中心研究進一步明確。    【參考文獻】  1 葛 明,王立琴,沈德煒,等. 小兒病毒性心肌炎的氧自由基變化及其相關因素J.山東醫藥,2000,40(10):69-70.2 趙蓮華,燕 秋.過氧化脂

21、質和超氧化物歧化酶與病毒性心肌炎急性期檢測的意義J.大連醫科大學學報,2002,24(2):106.3 翟艷紅,康素玲.氧自由基與心血管系統疾病的關系J.醫學綜述, 2001,7(5):280-282.4 季新義,季 蓓. 病毒性心肌炎的治療近況J.醫學綜述,2003,9(5):293-295.5 Edaravone Acute Infarction Study Group. Effect of a novel free radical scavenger, edaravone(MCI-186),on acute brain infarction. Randomized, lacebo-controlled, double-blind study at multicentersJ. Cerebrovascular Disease, 2003,15(3):222-229.6 王 娜，關 鵬，段相林，等.新生大鼠心肌細胞原代培養方法的改進J.河北師范大學學報：自然科學版，2007，31(2)：256-259，263.7 彭健毫,張連峰.病