1、            作者：閆珠君 崔曉龍 李銘剛 李一青 彭謙 文孟良【關(guān)鍵詞】  藥物發(fā)現(xiàn)；,環(huán)境基因組；,未被純培養(yǎng)微生物；,土壤DNA文庫；,生物活性物質(zhì)       摘要： 土壤是微生物最重要的生境，土壤微生物具有極大的多樣性。然而傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)只能得到約1%的微生物純培養(yǎng)，其余都是未被純培養(yǎng)微生物。利用土壤環(huán)境基因組技術(shù)，可以把未被純培養(yǎng)微生物的基因克隆到載體中并在宿主中進(jìn)行表達(dá)，獲得比已培養(yǎng)微生物豐富的

2、代謝產(chǎn)物多樣性，這為我們發(fā)現(xiàn)新穎結(jié)構(gòu)先導(dǎo)化合物以及新藥開辟了新的道路。本文介紹應(yīng)用環(huán)境基因組技術(shù)構(gòu)建土壤DNA文庫的思路和方法。關(guān)鍵詞： 藥物發(fā)現(xiàn)； 環(huán)境基因組； 未被純培養(yǎng)微生物； 土壤DNA文庫； 生物活性物質(zhì)    Soil metagenomics and its application for new drug discovery    ABSTRACT Soil is the most important habitat for microbes. Soil microbes are of considerable div

3、ersity. However, only about 1% of soil microbes are cultivable with traditional techniques, others are all uncultured microorganisms. The gene of uncultured microorganisms can be cloned to vectors and expressed in host by soil metagenomics. Highly diversified metabolites can be obtained than those o

4、btained from cultured microorganisms, which pave the way of discovering lead compounds with novel structure or even new drugs. In this review, the idea and method of constructing a soil DNA library by metagenomics is introduced.KEY WORDS Drug discovery; Metagenomics; Asyet uncultured microorganisms;

5、 Soil DNA library; Bioactive substance     自從1928年Alexander Fleming發(fā)現(xiàn)點(diǎn)青霉中存在抗菌物質(zhì)后，在微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物中尋找藥物就一直是藥物發(fā)現(xiàn)的熱點(diǎn)之一。傳統(tǒng)的微生物藥物篩選方法是從環(huán)境中分離培養(yǎng)微生物，并對(duì)純培養(yǎng)進(jìn)行發(fā)酵以獲得特定生理?xiàng)l件下的次級(jí)代謝產(chǎn)物，最后對(duì)產(chǎn)物中的活性成分進(jìn)行分離、純化和表征，以獲得有臨床價(jià)值的先導(dǎo)化合物。在經(jīng)歷了大規(guī)模抗生素篩選的黃金時(shí)代以后，微生物藥物發(fā)現(xiàn)進(jìn)入低速發(fā)展階段。抗生素濫用導(dǎo)致的耐藥性問題使得人們努力從微生物中尋找新的抗生素，尤其是具有新結(jié)構(gòu)的抗生素先

6、導(dǎo)化合物。然而，傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法的局限性，從環(huán)境中分離得到新類群越來越困難，即使分離得到的微生物，菌株的排重問題也難以得到解決。傳統(tǒng)技術(shù)越來越難以增加微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的多樣性，也不能滿足高通量篩選的需求。決定微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物多樣性的因素主要有：待篩選物種數(shù)量及其多樣化程度；物種的新穎性及其產(chǎn)生新次級(jí)代謝產(chǎn)物的潛力1。天然產(chǎn)物的復(fù)雜性和新穎性永遠(yuǎn)超乎人們的想象，自然環(huán)境中存在的微生物多樣性也遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出人們的常識(shí)。實(shí)際上，可培養(yǎng)的微生物只占整個(gè)微生物類群很小的一部分，未被純培養(yǎng)微生物(asyet uncultured microorganism)蘊(yùn)藏著一大批未開發(fā)的藥物資源。通過環(huán)境基因組(me

7、tagenomics)的方法，即從土壤樣品中提取總DNA，純化，部分降解，把酶切片斷放入載體中，在諸如大腸埃希菌等容易發(fā)酵的微生物中表達(dá)。人們已開始探索這一未知領(lǐng)域，并報(bào)道了由新穎序列編碼的表達(dá)酶活性和抗生素活性的克隆2。    1 土壤中微生物的多樣性土壤微生物是最有價(jià)值的天然產(chǎn)物源泉之一，它們提供了許多工業(yè)上十分重要的抗生素以及生物催化劑。芽孢桿菌、絲狀真菌、放線菌以及粘細(xì)菌都有驚人的產(chǎn)生多樣化次級(jí)代謝產(chǎn)物的能力。Hammond估計(jì)地球上的微生物物種多達(dá)16×109，廣泛分布于各種生態(tài)系統(tǒng)中3，其中，土壤無論從微生物數(shù)量和種類上都是首屈一指的生境。運(yùn)

8、用重組動(dòng)力學(xué)的方法，Torsvik等估計(jì)1克土壤中約有大于4000種不同的微生物4，而這個(gè)數(shù)字到2002年已增長為10000種5。但是，運(yùn)用現(xiàn)有的技術(shù)，只有02%2%的土壤微生物是可培養(yǎng)的6，重復(fù)發(fā)現(xiàn)的機(jī)率極高，例如放線菌中抗生素重復(fù)發(fā)現(xiàn)的概率已達(dá)到99%7。對(duì)于細(xì)菌來說，現(xiàn)有的培養(yǎng)技術(shù)無法滿足微生物生長需求是一個(gè)重要原因，許多微生物需要借助土壤中特殊的營養(yǎng)成分、土壤顆粒或者不同細(xì)胞間的信號(hào)來完成重要的生理功能；對(duì)于真菌，取樣不足可能導(dǎo)致了人們對(duì)其多樣性的低估。幸運(yùn)的是，土壤微生物資源并未開發(fā)殆盡，人們正在努力尋找開發(fā)未被純培養(yǎng)微生物或難培養(yǎng)微生物的方法。Button等用稀釋培養(yǎng)的方法培養(yǎng)了貧

9、營養(yǎng)水環(huán)境中的細(xì)菌，并證明添加營養(yǎng)刺激少數(shù)微生物生長的同時(shí)，抑制了絕大多數(shù)微生物的生長8。還有人模擬微生物的自然環(huán)境來優(yōu)化離體的純培養(yǎng)物分離。這些方法一定程度上證明了未被純培養(yǎng)微生物的廣泛存在，同時(shí)也啟發(fā)了研究未被純培養(yǎng)微生物的新思路。    2 環(huán)境基因組技術(shù)隨著基因組技術(shù)的發(fā)展，人們開始用分子生物學(xué)的方法來研究微生物間的進(jìn)化關(guān)系和遺傳信息的功能關(guān)系。環(huán)境基因組又稱多源基因組或宏基因組，是指從環(huán)境中提取總的DNA，對(duì)其進(jìn)行遺傳學(xué)和功能學(xué)的研究。優(yōu)點(diǎn)是不但可以原始地反映環(huán)境樣品中所有生物的遺傳多樣性，避開難培養(yǎng)這一技術(shù)瓶頸，而且可以把細(xì)胞外的DNA一并研究。通過環(huán)

10、境基因組的方法可以獲得越來越多的DNA序列，且大都是新穎的未被純培養(yǎng)微生物的序列。運(yùn)用環(huán)境基因組序列不但可以使我們逐漸了解微生物群落功能的復(fù)雜性，以及微生物間的相互作用關(guān)系，而且可以使我們深入了解未被純培養(yǎng)微生物的生理和生態(tài)特征9。研究藥物發(fā)現(xiàn)相關(guān)的新穎基因，自然要把目標(biāo)鎖定在環(huán)境基因組中編碼新穎次級(jí)代謝產(chǎn)物的基因上。在土壤總DNA中，編碼次級(jí)代謝產(chǎn)物的基因經(jīng)常是成簇存在的，與同一個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物相關(guān)的基因的生物合成區(qū)域和調(diào)節(jié)區(qū)域經(jīng)常是緊密相連的。這些相連的基因使得克隆到載體中整個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物途徑基因是一個(gè)連續(xù)的片段。在藥物發(fā)現(xiàn)中，生物合成基因和抗性基因也是連在一個(gè)片段上的，對(duì)于有毒的代謝產(chǎn)物，

11、宿主可以通過共表達(dá)的抗性基因帶來的抗性機(jī)制來避免毒性2。這一特點(diǎn)不但簡(jiǎn)化了對(duì)外源片段進(jìn)行剪切和修飾程序，而且使重組子的篩選更加方便，無疑為功能基因的克隆和表達(dá)提供了便利。應(yīng)用土壤環(huán)境基因組技術(shù)發(fā)現(xiàn)藥物的基本思路是：通過從土壤中的環(huán)境基因組(一般是土壤微生物總DNA)建立DNA文庫10，將其克隆到實(shí)驗(yàn)室條件下可以培養(yǎng)的宿主(一般為通用性較強(qiáng)的大腸埃希菌)中，進(jìn)一步研究未被純培養(yǎng)微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的化學(xué)多樣性(圖1)。這種新方法要求必須從土壤中分離純化DNA片段，并與大小合適的篩選載體和表達(dá)載體連接以實(shí)現(xiàn)克隆。載體在插入大片段的DNA后必須保持穩(wěn)定性，才能在宿主中實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定和大量的表達(dá)。 

12、   3 土壤DNA的分離提取與其他基因工程技術(shù)不同，土壤環(huán)境基因組技術(shù)所需要的DNA片段不是來自已知菌中已熟知的基因片段或基因簇，而是來自完全未知的土壤樣品中，對(duì)其可能具有的潛在功能也并不知曉。從土壤中提取和純化微生物的總DNA是關(guān)鍵性的第一步，因?yàn)镈NA的純度和片段的大小直接決定了后續(xù)基因操作能否順利進(jìn)行。從土壤中提取DNA需要體現(xiàn)完整的基因多樣圖1 土壤DNA文庫的建立步驟性，其方法主要有兩種：(1)對(duì)土壤樣品中的原位細(xì)胞進(jìn)行裂解后直接提取核酸物質(zhì)，然后對(duì)DNA進(jìn)行純化11；(2)從土壤樣品中分離細(xì)菌細(xì)胞，再對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解和純化1214。直接裂解提取環(huán)境總DNA的方法

13、在以往的幾十年中已經(jīng)得到了應(yīng)用，這種方法處理時(shí)間短，DNA的產(chǎn)率較高。首先通過物理、化學(xué)的方法破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜。物理方法主要有珠磨勻漿、煮沸、微波、冷凍解凍循環(huán)和超聲波裂解法2，物理方法破壞較小的細(xì)胞和孢子15效率很高，但同時(shí)也導(dǎo)致大量DNA鏈的斷裂16，17；化學(xué)裂解的試劑和條件包括SDS+加熱、滲壓休克、NaOH、溶菌酶、蛋白酶K或肽酶等處理2，運(yùn)用最多的還是SDS+加熱，佐以螯合劑EDTA和各種Tris或磷酸緩沖液18。裂解后釋放出來的DNA需要經(jīng)過提取和純化，這是關(guān)鍵性的步驟。土壤中的多酚類物質(zhì)(尤其是腐殖酸)可隨DNA一起純化，抑制限制性酶的活性和PCR擴(kuò)增19，以及改變定量雜交的

14、信號(hào)20，還可使生物分子變性，因此在純化過程中必須予以去除。有機(jī)溶劑、羥磷灰石柱、CsCl密度梯度離心都可用于去除腐殖酸，效果較好的當(dāng)推聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)和十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)。在多數(shù)研究中，直接裂解的方法都不能產(chǎn)生長度<20kb的DNA片段，如果用于構(gòu)建插入片段較長的環(huán)境基因組文庫，這種方法顯然不足以勝任21。微生物細(xì)胞提取法主要步驟：(1)土壤顆粒的懸浮；(2)根據(jù)沉降速度、密度或者兩者的不同從土壤顆粒中離心獲取細(xì)胞；(3)提取細(xì)胞的裂解；(4)DNA的純化21。懸浮的方法主要有器皿攪拌懸浮、旋轉(zhuǎn)搗碎、超聲波、震蕩懸浮等，以前兩者的效果為佳。化學(xué)方法常與物理懸浮方

15、法相結(jié)合，但也帶來一些負(fù)作用。離心需要經(jīng)過低速和高速兩個(gè)階段，前者可除去土壤碎片、真菌菌絲體和較重的土壤顆粒22；后者除去一些非細(xì)胞物質(zhì)和土壤污染物(如腐殖酸)。提取細(xì)胞的降解方法與直接降解中所用的方法類似，氯化銫溴化乙啶平衡梯度離心的方法已成功地用于大片段DNA(>48kb)的純化23，24。直接裂解獲得的DNA較完整，得率高，工作量小，但DNA易被剪切，含有污染物，為胞內(nèi)胞外混合的基因組。與之相比，較費(fèi)時(shí)的間接降解指向特定的原核生物類群，可以獲得高純度和高分子量的DNA21。    4 土壤DNA文庫的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶部分降解從土壤中純化后的環(huán)境基因組

16、DNA。典型大小片斷的選擇是通過脈沖場(chǎng)凝膠電泳完成，待酶切的DNA片段大小需要比插入片段至少長3倍，即如果需要較大的插入片段(>100kb)，就需要幾百kb的DNA，但如此長的DNA極易斷裂，所以需要不斷的使用修飾的方法來減少降解過程的步驟。Quaiser等用鈍化末端克隆的方法在載體pEpiFOS中建立了一個(gè)土壤環(huán)境基因組文庫，文庫中有25×104個(gè)克隆，隨即插入片段長度從325kb到435kb不等2。由于編碼次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的基因通常成簇存在，大小從十幾kb至上百kb不等，所選用的載體也不同。克隆土壤環(huán)境基因組DNA的載體包括質(zhì)粒、粘粒和人工染色體(BAC或YAC)。質(zhì)粒和粘

17、粒適合插入長度適中的片斷(3852kb)，其克隆效率較高。克隆大片段DNA必須選用BAC作為載體，雖然效率較前者低，但可攜帶>100kb的DNA片段，并在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定保持12個(gè)拷貝。一個(gè)運(yùn)用比較成功的BAC載體是pBeloBAC11，它具有2個(gè)選擇性克隆標(biāo)記：基于顏色的重組體篩選基因Lac Z和氯霉素抗性基因。此外，它有三個(gè)獨(dú)特的克隆位點(diǎn)，位于T7和SP6啟動(dòng)子的側(cè)面，Not切割位點(diǎn)的兩側(cè)。pBeloBAC11的調(diào)節(jié)基因包括oriS和repE，它們可以介導(dǎo)F因子的單向復(fù)制，parA和parB保持每個(gè)細(xì)胞中的拷貝數(shù)為12。通過電穿孔轉(zhuǎn)化大腸埃希菌，人們已成功的用這一載體構(gòu)建了土壤環(huán)境基因

18、組文庫25。大多數(shù)環(huán)境基因組文庫選擇大腸埃希菌作為克隆和表達(dá)的宿主，優(yōu)點(diǎn)在于具有較高的轉(zhuǎn)化效率，產(chǎn)生的初級(jí)代謝產(chǎn)物簡(jiǎn)單，不會(huì)對(duì)異源次級(jí)代謝產(chǎn)物的表達(dá)產(chǎn)生影響，易于擴(kuò)大發(fā)酵規(guī)模。應(yīng)用最廣泛的是一類稱為DH10B的大腸埃希菌突變株26；BAC用于原核生物中異源基因的表達(dá)也有報(bào)道。用革蘭陽性菌蠟狀芽孢桿菌的基因組DNA在大腸埃希菌構(gòu)建BAC文庫。純培養(yǎng)的蠟狀芽孢桿菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物中檢測(cè)到具有10種生物活性，在大腸埃希菌BAC文庫里發(fā)現(xiàn)其中的6種，包括脂肪酶、氨芐西林抗性、淀粉水解和橙色素的分泌27；其他宿主如鏈霉菌和芽孢桿菌的研究近年也有報(bào)道28，提示開發(fā)可以在大腸埃希菌和其他宿主之間穿梭的載體，無疑為擴(kuò)大宿主系統(tǒng)和代謝背景，增加藥物發(fā)現(xiàn)的幾率創(chuàng)造了條件。- 28 焦靈利，倪孟祥，陳日，等. 頭孢唑林鈉聯(lián)合舒巴坦鈉對(duì)產(chǎn)酶和非產(chǎn)酶菌的體內(nèi)抗菌活性J. 中國藥師，2000,3(5):26629 Gavalda J, Torres C, Tenorio C, et al. Efficacy of ampicillin plus