1、地錦草總黃酮預防四氯化碳所致急性肝損傷的實驗研究(一)作者：曹瑞珍， 魏永春， 強欣， 喬偉【關鍵詞】 地錦草；,總黃酮；,急性肝損傷；,四氯化碳摘要：目的研究地錦草總黃酮(total flavonoids of Euphorbiae humifusae，TFEH) 對四氯化碳造成的小鼠急性肝損傷的保護作用。方法四氯化碳造成小鼠急性肝損傷模型,測定血清谷丙轉氨酶(serum glutamic pyruvic transaminase,SGPT)、肝組織谷丙轉氨酶(liver glutamic pyruvic transaminase,GPT)、超氧化物歧化酶(superoxidase dism

2、utase,SOD)活性及丙二醛(malonaldehyde,MDA)、還原性谷胱甘肽（GSH）含量,采用光鏡觀察肝臟組織學變化。結果與四氯化碳模型組比較,經TFEH預防性治療后,GPT、LGPT活性和MDA含量均明顯降低(P0.05或P0.01),而GSH含量和SOD活力明顯增高(P0.05)。通過病理學切片觀察,TFEH明顯改善肝組織的病理變化。結論TFEH對四氯化碳造成的小鼠急性肝損傷具有保護作用。關鍵詞：地錦草； 總黃酮； 急性肝損傷； 四氯化碳Protective Effect of Total Flavonoids of Herba Euphorbiae humifusae aga

3、inst Hepatic Injury Induced by CCl4 in MiceAbstract：ObjectiveThe protective effect of total flavonoids Euphorbiae humifusae against CCl4-induced hepatic injury in mice was observed. MethodsAcute liver injury model in mice was made by using CCl4. The levels of SGPT, LGPT in serum and MDA, SOD,GSH in

4、liver and hepatic pathological tissue were observed. ResultsCompared with model control group, the levels of serum SGPT, LGPT, liver MDA of the mice treated with TFEH significantly decreased(P0.05 or P0.01),while the activity of SOD and the level of GSH increased greatly(P0.05). By observation of pa

5、thological slices, TFEH could improve hepatic pathological changes distinctly. ConclusionTFEH can prevent CCl4-induced hepatic injury.Key words：Herba Euphorbiae humifusae; Total flavonoids; Acute liver injury; Carbon tetrachloride地錦草為常用的中蒙藥材，具有清熱解毒、燥濕、活血等功效1，2，通過現代藥理學研究證實地錦草主要含有槲皮素及其苷、山奈素及其苷等黃酮類化合物3

6、。文獻報道地錦草治療病毒性肝炎取得療效4；本課題組前期研究了TFEH藥理學活性5，6，發現其水及乙醇提取物具有良好的抗脂質過氧化等作用。在此基礎上,我們研究了TFEH對四氯化碳造成的小鼠急性肝損傷的保護作用,并探討其可能作用機制及其應用前景。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 動物純系昆明種小鼠50只，體重 (252) g，雌雄各半,由錦州醫學院實驗動物中心提供。飼養環境:溫度2225,濕度70%。1.1.2 藥品與試劑地錦草購于內蒙古民族大學附屬醫院蒙藥制劑室，由蒙藥系布和巴特教授鑒定。測定試劑盒均來自南京建成生物工程研究所。1.1.3 儀器7230分光光度計(上海第三分析儀器廠),光學分

7、析天平、FA160電子天平（上海天平儀器廠),IGL-16臺式高速離心機（上海安亭科學儀器廠),旋轉蒸發器(上海青浦滬西儀器廠)。1.2 方法1.2.1 藥物配制取地錦草粗粉（20目）150 g加75%乙醇900 ml，浸泡12 h，回流提取1.5 h，提取3次，合并提取液，回收乙醇，加蒸餾水溶解并定容至400 ml，配成1 ml含生藥0.375 g，黃酮含量為16.7 mg/ml(經蒙醫藥學院蒙藥分析化學教研室檢測)，再21稀釋成0.25 g生藥/ml，以此作為高劑量組的給藥濃度。再配制低劑量組的給藥濃度0.125 g生藥/ml。1.2.2 動物分組及給藥方法小鼠40只,按隨機數字表法分為4

8、組,每組10只:組為正常對照組, 每次1ml蒸餾水灌胃;組為模型對照組,灌胃等容積常用水;、組分別為TFEH高、低劑量治療組, 1次/d，1 ml/次，濃度分別為0.25 g生藥/ml，0.125 g生藥/ml；上述各組均給藥1次/d,連續1周。末次給藥后,組小鼠按10 ml/kg腹腔注射0.15%四氯化碳豆油溶液1次,建立急性肝損傷模型。注射四氯化碳后禁食20 h,斷頭取血,離心得血清,并快速取肝臟,取肝左葉組織約0.5 g,在冰冷的生理鹽水中漂洗,濾紙拭干,以生理鹽水用組織勻漿器制成10%肝組織勻漿,離心,取上清液,準備檢測各指標。1.2.3 生化指標檢測血液及肝檢測指標:SGPT，LGP

9、T，MDA，SOD和GSH,按試劑盒要求進行測定。1.2.4 病理學檢查取部分肝右葉組織做病理學檢查,將其放于10%甲醛溶液中,石蠟包埋切片,HE染色,光鏡下觀察。1.3 統計學處理所有實驗數據以 s表示,采用t檢驗。2 結果2.1 急性肝損傷小鼠生化指標檢測由表1可以看出, 與模型組比較TFEH能顯著降低血清和肝臟GPT活力(P0.01);由表2可以看出,與模型組相比較,TFEH能明顯降低MDA的含量(P0.05),還能明顯提高SOD活性(P0.05),高低劑量之間沒有顯著性差異;同時,TFEH能增加肝臟GSH的含量,與模型組比較,高劑量組有明顯差異(P0.05)。表1 TFEH對急性肝損傷

10、小鼠SGPT,LGPT的影響（略）與正常對照組比較,P0.01;與模型對照組比較，#P0.05,#P0.01；n=10表2 TFEH對急性肝損傷小鼠MDA、SOD和GSH的影響（略）與正常對照組比較， P0.05,P0.01;與模型對照組比較，#P0.05；n=102.2 急性肝損傷小鼠肝臟病理學改變正常對照組小鼠肝臟外觀呈紅褐色,質地軟而富有彈性; 鏡下見肝小葉結構清晰,細胞排列整齊,大小均勻,分界清楚,細胞核位于細胞中央,圓而清晰（見圖1）；模型對照組小鼠肝臟體積增大,質脆,邊緣鈍而厚,表面呈黃褐色; 鏡下可見肝細胞水腫及小葉中心區肝細胞壞死,壞死的肝細胞發生核固縮、碎裂及溶解，致肝細胞索

11、分離（見圖2）；TFEH高、低劑量組肝臟略有水腫,質地柔軟; 鏡下見肝小葉結構基本完整,細胞排列較整齊,肝細胞輕度水腫，小葉中央區散在少許點狀壞死灶，淋巴細胞浸潤，變性、壞死較模型組顯著改善,且高劑量組比低劑量組的更輕一些（見圖34）。圖1 正常對照組肝組織 HE染色100 （略） 圖2 模型對照組肝組織 HE染色100 （略） 圖3 低TFEH組肝組織 HE染色100 （略） 圖4 高TFEH組肝組織 HE染色100 （略） 3 討論肝病是一種發病率高、難以根治的疾病,對人類健康危害極大,而且不良的飲食習慣、藥物、毒物等均能導致肝臟疾病,損害肝細胞。大量研究表明,在肝細胞病變過程中,自由基、

12、酶以及脂質過氧化等均發揮重要作用。四氯化碳致小鼠肝損傷模型,一直被廣大學者所應用,其機制為:四氯化碳在肝內經微粒體細胞色素P450分解活化,形成三氯甲基自由基(CCl3?)和氯自由基(Cl?),導致肝微粒體的脂質過氧化7。由于脂質過氧化反應增強而抗氧化能力下降,導致自由基生成增加,通過過氧化細胞膜脂質,使肝細胞結構和功能受到損害8。文獻9報道化合物中的酚羥基是抗脂質過氧化作用的功能基團,地錦草所含黃酮類化合物槲皮素及其苷、山奈素及其苷等,含有酚羥基結構基團,因而發現黃酮類化合物具有保肝護肝作用。實驗顯示,TFEH能顯著降低血清和肝臟GPT活力(P0.01),從而減少丙酮酸生成,使還原型NADP

13、H含量增高,以此增強肝細胞抗氧化、清除自由基、抑制脂質過氧化的能力。TFEH還明顯降低MDA含量(P0.05),增加GSH含量,是由于所含酚羥基的抗脂質過氧化作用,直接捕捉、清除自由基,生成自由基中間體,阻斷或終止自由基連鎖反應鏈,從而阻止或抑制氧自由基反應和脂質過氧化反應,最終抑制脂質過氧化終產物MDA的生成,減輕肝臟還原型GSH的耗竭10，但GSH含量增加不明顯,與模型組比較,無統計學意義。TFEH同時明顯提高肝臟SOD活力(P0.05),這與黃酮類化合物參與調節和提高體內抗氧化酶的活性有關11。病理學檢查表明,TFEH能明顯預防急性肝損傷,減輕肝細胞形態結構的損傷,提示TFEH具有保護損

14、傷肝細胞的作用。參考文獻：1 中國醫學百科全書編輯委員會.中國醫學百科全書蒙醫學M.上海：上海科技出版社，1992：227.2 馬清鈞.常用中藥現代研究與臨床 M.天津：天津科技翻譯出版社，1995：166.3 柳潤輝.地錦草化學成分的研究J.中草藥，2001，32（2）：107.4 汪仁柏.地錦草治療病毒性肝炎65例臨床觀察J.中國農村醫學，1987，（3）：12.5 曹瑞珍.大戟科植物地錦草的藥效學研究探討J.中醫藥學刊，2003，21（6）：892.6 曹瑞珍，魏永春，佘集凱，等.地錦草提取物對小鼠血液SOD和MDA的影響J.內蒙古民族大學學報，2002，17（4）：342.7 辛 念，熊建新，韓淑英，等.蕎麥種子總黃酮對四氯化碳所致急性肝損傷的保護作用J.第三軍醫大學學報，2005，27（14）：1456.8 RouachH,FataccioliV,GentilM,etal.Effect of chronice than olfeeding on lipid peroxid ationand protein oxidation inrelationtoliverpathologyJ.Hepatology,1997,25(2):