1、大鼠肢體缺血再灌注早期血栓前狀態的研究(一)    作者：楊敏，馬平，徐文會，張宏江【摘要】 目的 探討大鼠急性下肢缺血再灌注早期血栓的形成情況。方法 將大鼠隨機分為假手術組、下肢缺血再灌注組兩組。夾閉大鼠股動脈并用張力帶綁扎下肢，建立急性下肢缺血再灌注大鼠模型。觀察急性下肢缺血再灌注大鼠血小板膜糖蛋白GPb/a和血管內皮細胞血栓調節蛋白(thrombomoclulin，TM)的表達。結果 缺血再灌注組大鼠血小板膜糖蛋白GPb/a表達高于假手術組(P0.05)；缺血再灌注組大鼠血管內皮TM表達低于假手術組(P0.05)。結論 急性下肢缺血再灌注可能導致大

2、鼠血栓前狀態的形成。 【關鍵詞】 肢體缺血再灌注；血栓前狀態；血小板膜糖蛋白；血栓調節蛋白Abstract：Objective To investigate the emerge condition of thromb in rats after ischemiareperfusion of limb.Methods The rats were randomly divided into 2 groups：sham operation group(N group)；the hind limb ischemia reperfusion group (IR group).An animal mod

3、el of acute hind limb ischemiareperfusion was developed by clamping femoral artery and banding hind limb of rats.Changes in the expression of GPb/a of platelet membrane and TM of vascular endothelial cell in rats after ischemiareperfusion of limb were observed.Results The expression of GPb/a of plat

4、elet membrane in the IR group was significantly higher than that of the N group (P0.05).The expression of TM of vascular endothelial cell in the IR group was significantly lower than that of the N group (P0.05).Conclusion Acute hind limb ischemiareperfusion may induce the formation of prethrombotic

5、state in rats.Key words：limb ischemiareperfusion；prethrombotic state；platelet membrane lycoprotein；thrombomodulin缺血再灌注損傷是臨床肢體血運重建后出現意外致殘、致死的主要原因之一，是當今外科臨床醫生所常面對的具有挑戰性的問題之一。創傷、斷肢再植、術中使用止血帶時間過長、腹主動脈瘤手術中鉗夾血管及大血管栓塞再通等都可引起肢體缺血再灌注損傷。肢體缺血再灌注損傷是處于頓抑、休眠的肢體在血運重建之后的損傷導致的機體生理、生化改變和各器官的病理改變，這種損傷幾乎影響到整個機體，進一步導致如心

6、、肺、腎等遠隔器官的損傷13，甚至發生多器官功能障礙4。盡管近來手術技術得以改善且圍手術期管理水平有所提高，但死亡率和截肢率仍居高不下。如何認識再灌注損傷的預防和治療，降低致殘率和死亡率，將是我們長期所要研究的課題。缺血再灌注損傷的機制是多因素和錯綜復雜的，其中微血栓的形成可能起到重要作用。研究證實再灌注時血管內皮細胞和白細胞激活，內皮細胞釋放多種黏附分子，激活的內皮細胞與白細胞相互作用，對微血管和細胞損傷產生影響。150多年前，Virchow就指出血管壁的損傷、血液流動的變化、血液性質的改變是形成血栓的三要素，而血栓前狀態是很多因素引起的止血、凝血和抗凝系統失調的一種病理過程，具有易導致血栓

7、形成的多種血液學變化，是血栓形成的前期階段。本試驗通過黏附分子血小板膜糖蛋白GPb/a和血管內皮細胞血栓調節蛋白(thrombomoclulin，TM)的測定，從血管內皮損傷、血小板活化、抗凝作用減弱三個方面對肢體缺血再灌注后血栓前狀態進行研究。1 材料和方法1.1 實驗材料1.1.1 實驗動物 健康成年雄性SD大鼠，體重(200±30)g，購于山西醫科大學實驗動物中心。1.1.2 主要試劑及儀器 山羊抗大鼠GPb/a抗體，SANTA CRUZ公司；抗大鼠TM抗體，LAB VISION公司；FITC標記兔抗山羊IgG，北京中山金橋公司；SABC免疫組化試劑盒，北京中山金橋公司；Oly

8、mpus BX51光學顯微鏡，日本；LeicaRM2015切片機，德國萊卡公司；IDA2000數碼顯微圖象分析系統，中科院北京空海科技公司；Calibur流式細胞儀，美國BD公司。1.2 實驗方法1.2.1 實驗分組 分為假手術組、缺血再灌注組兩組，采用隨機化原則，每組8只。1.2.2 動物模型制作 術前常規禁食12 h，自由飲水。以20烏拉坦(1 000 mg/kg)行腹腔內注射麻醉。將大鼠仰臥固定于操作臺上，在后肢雙側股三角處剪毛，于腹股溝處沿血管走行縱行切開皮膚、皮下組織，鈍性分離縫匠肌后部，游離股動脈、股靜脈和股神經。在股動、靜脈近端分別用動、靜脈夾夾閉，并用張力帶于股鞘下綁扎肢體阻斷

9、側支循環。右頸部開口分離頸內靜脈，置管建立靜脈輸液系統，接微電腦靜脈微量輸液泵。2 h后撤除血管夾，恢復動、靜脈血流，3 h后進行標本采集。1.2.3 實驗動物的處理 假手術組與缺血再灌組相同的麻醉與手術操作，但未行血管夾閉及張力帶綁扎；缺血再灌注組缺血2 h，再灌注3 h。1.2.4 標本制備和檢測方法 檢測GPb/a需取血，從心臟采血0.5 mL(3.8枸櫞酸鈉19抗凝)，1 000 r/min離心5 min，取上清5 uL加入試管中；加入一抗5 uL，避光孵育20 min；加入熒光標記二抗5 uL，避光孵育20 min；加1多聚甲醛200 uL固定30 min；PBS洗滌4 min，用流

10、式細胞儀檢測，每管收集GPb/a陽性細胞20 000個，記錄GPb/a的陽性率。檢測TM需取血管，取股動脈、股靜脈，脫水、石蠟包埋，用免疫組化方法定性檢測血管內皮細胞上TM的表達。步驟如下：a)切片常規脫蠟至水，二甲苯(20 min)二甲苯(20 min)100酒精(10 min)100酒精(10 min)95酒精(10 min)85酒精(10 min)70酒精(10 min)。b)3H2O2室溫孵育510 min，以消除內源性過氧化物酶的作用。蒸餾水沖洗2 min，沖洗3次。c)熱修復抗原：將切片浸入0.001M枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)，微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔8 min后，重復1次

11、，冷卻2 h，冷卻后PBS液(pH 7.4)洗滌2 min，沖洗2次。d)滴加5BSA封閉液，室溫20 min。甩去多余液體，不洗。e)滴加稀釋150的一抗(抗大鼠IgG)，4過夜。PBS液沖洗2 min，沖洗3次。f)滴加生物素標記的羊抗小鼠IgG，室溫20 min，PBS液沖洗2 min，沖洗3次。g)滴加試劑SABC室溫20 min。PBS液沖洗5 min，沖洗4次。h)DAB顯色，自來水沖洗。i)蘇木素輕度復染、梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。再用BX51型Olympus顯微鏡及IDA2000數碼顯微圖像分析系統進行圖像分析，每組觀察30個高倍視野(×400)，隨機取

12、8個視野，以平均光度為指標進行半定量分析。1.3 統計學分析 用SPSS 11.5統計軟件，實驗數據以(±s)表示，組間均數比較采用t檢驗。檢驗水準取0.05，P0.05差異有顯著性。2 結 果2.1 缺血再灌注組大鼠血小板膜糖蛋白GPb/a表達為(53.84±3.05)，高于假手術組(42.31±6.29)，二者比較具有統計學意義。2.2 缺血再灌注組大鼠血管內皮TM表達低于假手術組(P0.05)(見表1)表1 急性肢體缺血再灌注大鼠血管內皮細胞TM的表達注：假手術組與缺血再灌組比較P0.053 討 論早在1944年，Jesse等5對止血帶引發休克研究發現，止血

13、帶使用時間不超過3 h，引發止血帶休克可能性極小，相反止血帶使用時間超過3 h，則較易導致止血帶休克，這種止血帶休克不能通過靜脈補充容量來預防。后來人們對動物骨骼肌缺血代謝變化進行研究發現，隨著缺血開始，骨骼肌的無氧代謝開始，細胞內的三磷酸腺苷、磷酸肌酸進行性耗竭，缺血3 h三磷酸腺苷就完全水解，而在缺血后1 h磷酸肌酸就完全水解。在28下，如果止血帶時間不超過3 h，隨著再灌注開始，細胞內三磷酸腺苷在再灌注2 h后恢復正常水平，而磷酸肌酸則在再灌注后1 h恢復到正常水平。如果缺血超過3 h，而缺血的肢體溫度保持在2，也不會導致細胞內三磷酸腺苷、磷酸肌酸的耗竭，從而避免了細胞損傷。這可能與低溫

14、下細胞能量代謝降低有關6。Raymond等7用無創性P標記核磁共振分光鏡觀察細胞缺血再灌注時代謝改變得出，在肢體長時間的缺血中，如果每缺血1 h插入10 min再灌注，則可維持細胞內三磷酸腺苷正常水平，快速恢復細胞代謝，保護細胞不受傷害；而Miller8等則認為插入5 min就可以恢復細胞正常代謝。臨床手術中，使用止血帶的最大時限為1.5 h，因此本實驗選擇室溫下缺血2 h再灌注3 h造模以更加接近于臨床研究。近年來研究表明，肢體缺血再灌注可致微血管和細胞損傷。a)微血管血液流變學改變：缺血再灌注早期可見中性粒細胞黏附在血管內皮細胞上，隨后可有血小板沉積和紅細胞緡線狀聚集；再灌注期，激活的血管

15、內皮細胞和中性粒細胞表面可表達黏附分子，增強細胞間的親和力，使細胞在微血管內流速減慢，造成“滾動”現象；隨著再灌注時間延長，中性粒細胞、血管內皮細胞表面的黏附分子表達進一步增加，中性細胞與內皮細胞發生黏附。黏附的中性粒細胞釋放化學趨化物質，如白三烯、血栓素A2和血小板激活因子等，加重細胞間黏附和微血管堵塞。b)微血管口徑的變化：損傷的內皮細胞腫脹、激活的血管內皮細胞和中性粒細胞釋放縮血管物質、擴血管物質合成與釋放減少等作用共同導致微血管口徑變小。c)微血管通透性增高：自由基損傷和中性粒細胞黏附是微血管通透性增高的的主要原因。150多年前，Virchow就指出血管壁的損傷、血液流動的變化、血液性

16、質的改變是形成血栓的三要素，而血栓前狀態是很多因素引起的止血、凝血和抗凝系統失調的一種病理過程，具有易導致血栓形成的多種血液學變化，是血栓形成的前期階段9。表現在：a)血管內皮細胞受損或受刺激；b)血小板和白細胞被激活或功能亢進；c)凝血蛋白(凝血因子)含量增高或被活化；d)抗凝蛋白(抗凝因子)含量減少或結構異常；e)纖溶因子含量減少或活性減弱；f)血液黏度增高和血流減慢10。目前肢體缺血再灌注動物模型很難造成與臨床情況完全相同，因此都有一定的局限性。主要的造模方法有11：a)止血帶模型：是將橡皮止血帶或氣囊止血帶扎于肢體近端阻斷血流，造模操作簡單。b)改良止血帶模型：在麻醉下游離出肢體動、靜

17、脈，用血管夾阻斷動、靜脈，并用橡皮止血帶環扎肢體以阻斷側支循環，此方法造模復雜，易出現傷口感染。c)將肢體某塊肌肉分離出，保留或不保留血管束或血管神經束與活體相連。因分離肌肉時已將組織切開且一塊肌肉很難代表整個肢體，目前此模型較少應用。d)顯露某條肌腱而不破壞表面微血管，觀察缺血再灌注后的微循環變化。本研究采用改良止血帶模型。臨床手術中，使用止血帶的最大時限為1.5 h，因此本實驗選擇缺血2 h再灌注3 h造模足以反映缺血及再灌注對機體造成的影響。血小板參與血栓形成主要與血小板具有的功能有關，包括黏附、聚集、釋放、促凝血功能。在血栓性疾病中，血小板活化與血栓形成存在密切關系。血小板膜糖蛋白GP

18、b/a(CD41/CD61)歸屬于黏附分子中的整合素家族，70存在于血小板表面，30以隱蔽狀態分布在開放管道系統和顆粒上。當血小板活化時，隱蔽狀態的GPb/a復合物全部表達在血小板膜表面。血小板通過與纖維蛋白原的聯結而產生聚集，而血小板聯結纖維蛋白原的結合點位于GPb/a分子上，是通過精氨酸天冬氨酸天冬酰胺序列與纖維連接蛋白及vWF等結合的。GPb/a與纖維蛋白原的結合過程是多種因素引起血小板聚集的共同通路，故GPb/a可以更直接地反映血小板的活化狀態12。有研究表明血小板活化時可能形成一個黏附蛋白口袋，產生多個結合點，這種現象反映了GPb/a復合物在血小板活化時出現了許多離散的構型狀態。本研

19、究通過流式細胞儀檢測GPb/a的分子數，可直接反映血小板活化狀態。參與血小板黏附反應的因素包括血小板、內皮下組織和血漿成分。血小板黏附受體主要歸GPb，此外，還有其他的黏附蛋白參與，比如GPb/a。在非流動條件下，GPb/a可以與Fn、vWF、Fg、TSP或膠原聯結，但在流動條件下，GPb/a只與vWF結合，并使黏附的血小板在表面伸展，使血小板牢固地黏著在表面上，經得住高切變率時血流的沖刷而不脫落。肢體缺血再灌注損傷與血小板的功能狀態有重要關系。本研究觀察到缺血再灌注組GPb/a表達量較假手術組表達量增加，表明肢體缺血再灌注后血小板有一定程度的活化，其機制可能是在肢體缺血再灌注后，微血管有一定

20、程度的損傷，如內皮細胞受損、血液流變學改變(血液為非牛頓液體，其黏度隨切變率的變化而發生了變化，在低切應力情況下，血液黏度升高血流阻力增大，導致流速減慢)。內皮下膠原暴露，在低切變率情況下GPb通過vWF介導與膠原結合，膠原作為弱激活劑與其他激活劑(如ADP、腎上腺素等)使黏附的血小板激活，同時引起釋放反應，進一步激活血小板。在此過程中TXA2被激活，TXA2作為強激活劑通過以PLC途徑為主的不同途徑激活血小板，活化的血小板膜表面表達更多的GPb/a復合物，兩個相鄰血小板的GPb/a可能會通過與纖維蛋白原的結合，產生“搭橋”作用，使血小板發生聚集。纖維蛋白原是目前已知最重要的GPb/a的配基，

21、其上有兩個GPb/a結合位點，可同時與兩個活化血小板結合，從而導致血小板交聯，介導血小板聚集。這與劉育英等13應用免疫組化技術發現沙土鼠在腦缺血再灌注后1.6 h血小板膜糖蛋白CD61表達水平顯著升高一致。但與趙立明等14研究結果有差別，有待進一步研究。TM是由575個氨基酸組成的單鏈糖蛋白，由中性粒細胞、單核細胞、血小板等合成釋放，廣泛分布于人體內的動脈、靜脈、毛細血管和淋巴管的內皮細胞膜表面，血管內皮細胞受損，TM便從細胞中釋放入血，內皮細胞表面TM減少，因此，近年來已把TM作為血管內皮損傷和破壞的一個新的標志物15，16。在功能上它是凝血酶激活蛋白C的輔因子，TM通過第5、6個上皮生長因子和硫酸軟骨素鏈與凝血酶以11或12形成復合物，使凝血酶的空間構象發生改變，抑制凝血酶活性17，使其失去促纖維蛋白凝塊形成及血小板聚集能力；在Ca離子參與下，促進凝血酶活化蛋白C的效率提高20 000倍以上，其作為TM/PC/PS抗凝系統的效應分子，通過降解凝血因子Va和a，抑制內、外源性凝血反應，產生抗凝作用；TM還可促進抗凝血酶滅活凝血酶。TM由內皮細胞釋放入血后，游離的凝血酶增多，TM的抗凝作用減弱，造成了促凝血作用，有利于血栓的形成。本研究觀察到缺血再灌注組TM表達量較假手術組表達量下降，TM作為血管內皮損傷和