1、淺談PCK溫度校準的必要性及方法作者:日期:淺談PCR儀溫度校準的必要性及方法 朱晨彬，朱毅晨，姚麗芳，張麗萍，陳宇，朱學平 （上海市計量測試技術研究院）摘要：本文分析了 PCR儀使用的現狀及其進行溫度校準的必要性。提出了PCR儀溫度校準的方法和校準項目（溫度準確性，溫場均勻性，升降溫速率，最大超調溫度）以及數據處理方法， 并分析了每一校準項目的重要性。關鍵詞：PCR儀，溫度校準，溫度準確性，溫場均勻性，升降溫速率，最大超調溫度一、 引言PCR1聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction）的簡稱，是在短時間內體外大量擴增特定的DN砧段的分子生物學技術。自動完成聚合酶鏈反應

2、，提供DNA擴增 的溫度條件而設計的儀器稱為PC敢。PC以主要用于DN砧段的放大，可將DN冊子或某一 DN射段于數小時內擴增至 十萬乃至百萬倍，在這過程中主要是3個特征溫度循環：1 .高溫變性：把樣品加熱至9095c讓DNA®板變性變成單鏈。2 .低溫退火：讓樣品的溫度迅速下降至5065C,引物就可以結合到模板上去。3 .適溫延伸：讓樣品的溫度上升至7075C,DNAK合酶就可以從引物開始用底物復 制出新鏈。因此，在PC©應過程中對溫度控制的要求很高，良好的溫度控制是 PCR：質量 好壞的關鍵。二、PCFS因擴增儀校準的現狀PC取的控溫精度、升降溫速率以及溫場的均勻性等直接

3、影響DN射段擴增的結果。PC取經使用后，其溫度傳感器的計量特性會發生變化，作為計量設備一般須經 定期校準后方能繼續使用。幾乎進行聚合酶鏈反應試驗的實驗室（如基因判別、親子鑒定、DN2體識別）都會使用多臺擴增儀以滿足實驗需求。 而且，實驗室內的基因擴增儀都是常開常用， 使用頻率高，很難保證其性能指標符合實驗要求。各實驗室對PCF的質量控制還停留在自檢自校和依賴于廠商的售后支持。我院于2006年編寫了基因擴增儀（PCFRZ）的校準規范JCJ/E111025.1/0-2006 , 早已開展PCR：的溫度校準項目。使用標準裝置：名稱性能（PCR儀）校準儀特點加熱槽溫度動態實時檢測適用工況任何工況測溫通

4、道數16溫度測量范圍(0-110) C系統分辨率0.01C測溫準確度±0.10C米樣頻率2Hz由于需要PCR：升降溫速率較快,故要求溫度傳感器的熱慣性小（滯后要小），反 應靈敏。因此，校準過程使用熱敏電阻作為測溫傳感器。標準測試程序為：序號溫度點持續時間步驟130° C1:00分鐘步驟295° C3:00分鐘步驟330° C2:00分鐘步驟490° C3:00分鐘步驟550° C3:00分鐘步驟670° C3:00分鐘步驟760° C3:00分鐘步驟830° C1:00分鐘通過專用軟件進行數據處理及分析，

5、并繪制溫度循環測試曲線。見圖一圖一pcr溫度循環測試曲線PCRZ溫度校準的項目及必要性一個穩定的溫度循環是成功實現PC所必需的。其中溫度控制的動、穩態特性是 影響PCFT增結果正確與否白最重要因素之一,這包括溫度準確性、升降溫速度、溫 場均勻性、最大超調溫度。（一）、溫度準確性溫度準確性是PC取最重要的性能指標，如溫度準確性低可直接造成非特異性擴 增，甚至是錯誤的擴增結果，造成假陽性和假陰性。市場上各家廠商考核基因擴增儀（PCRZ）性能的主要指標，一般廠家的企業指 標為±0.5C, 一些性能較好的產品可以實現的溫度準確度為土 0.3C。故需對PCRZ 控溫準確度進行測試。nI 一參加

6、檢測的溫度探頭序號；n一參加檢測的溫度探頭的數量（二）、溫場均勻性由于PC雙加熱器加熱不均勻，導致PCRZ模塊上各孔存在一定溫差。造成試驗 結果偏差。一般PCRWi緣點的溫度低于中間區域，所以均勻性為 PCRZ重要的性能 指標。一般廠家的企業指標規定均勻性為±0.5C, 一些性能較好的產品可以實現的溫度均勻度為± 0.3C。校準實驗時，通過選取孔板中16個特殊反應位置（如圖2所示）來測量溫度, 并得出孔板的溫度均勻性。均勻性為各個探頭在同一時刻最大溫度與最小溫度的差 值。均勻度計算公式為：tmaxt min （ t max=最大溫度；t min=最小溫度）Lit you t

7、. 15 >12 M 45 后 7 R 。1 O 1212圖二96孔板探頭布點示意圖（三）、升降溫速率PCRT增產物數量白多少決定了 PCR勺效率。為了在短時間內獲得盡可能多的產物，需要儀器在升降溫段具有按照預設升降溫速率快速升溫和降溫的能力（最大升 溫速率達1520C）。一個完整的PCRi程，是由若干個升溫一恒溫一降溫循環構成的。 因為“變性”，“退火”和“延伸” 3個階段是必須要保證的。因此，只有使升降溫的 過程盡可能地迅速，才能縮短每個PC既環以及整個PCR過程所需時間。一般廠家的 企業指標規定升溫速率為± 3C/sec。儀器校準實驗時，升溫速率為溫度從 40c到90c的

8、時間；降溫速率為溫度從 70c至ij 35c的時間。詳見圖三圖三PCR降溫速率計算示意圖（四）、最大超調溫度當溫度從一定點溫度調節到另一定點溫度，就會產生溫度的超調。超調溫度過大 同樣會對試驗產生影響，所以校準實驗時，需要計算最大超調溫度和平均超調溫度。 見圖四圖四溫度曲線超調溫度部分四、結束語聚合酶鏈反應(PCR技術由于其極高的檢測靈敏度和特異性已經越來越多地應 用于臨床檢驗、司法鑒定等工作中。有多種原因會造成PCR擴增的錯誤結果，排除實驗過程中人為因素造成的誤差，PCR儀溫度控制系統工作性能的優劣是造成檢驗 結果出現偏差甚至錯誤的至關重要因素。通過對PCR儀的定期校準可以極大的避免PCR過

9、程中假陽性或假陰性結果的產生，提高PCR式驗的準確性和穩定性。參考文獻1王宇松，佟慧艷，張文超影響PC致溫度控制精度的因素分析J,生命科學儀器,2007, (02).2陳居德，楊明.PCFT增基因檢測中的溫度控制J.儀器儀表用戶，2004, (01).3張文超，劉曉光，吳勤勤.基因擴增分析(PCR風溫控系統的研究與應用J.華東理工大學學報， 2004, (02).4陳居德，楊明.PCFT增基因檢測中的溫度控制J.儀器儀表用戶，2004, (01).5薛生虎，李東升，葉子弘，俞曉平，方榮瑞.基于多傳感器融合技術的PC取溫度校準系統J.儀器儀表學報,2011,(06)Introduction to

10、 the necessity and method of temperature calibration forPCR instrumentZhu Chenbin, Zhu Yichen, Yao Lifang, ZhangLiping, Chen Yu, Zhu Xueping Abstrat: The situation of using PCR intrument and the nessity of its temperature calibration is introducted. The mathod of PCR instrument 's temperature ca

11、libration is given by this article. The temperature calibration items for PCR instruments that contain the temperature accuracy, temperature uniformity ,velocity of temperature change,max overshoot temperature and mathods of data analysis are also introducted. So is the temperature analysis of each cal