1、探討甲氨蝶呤對大鼠輸卵管雌孕激素受體的影響摘要： 目的觀察不同劑量甲氨蝶呤（MTX）對假孕SD大鼠輸卵管雌孕激素受體的損傷，探討MTX治療后對后續妊娠的潛在影響，為臨床使用甲氨蝶呤保守治療異位妊娠提供理性的合理選擇。方法 40只SD雌性大鼠，致假孕狀態后再MTX腹腔注射，隨機分為1mg/kg組、2mg/kg組、5mg/kg組及對照組(腹腔注射生理鹽水)，10d后處死各組大鼠，取雙側輸卵管壺腹部組織，進行雌、孕激素受體的免疫組化染色。結果 ER陽性表達率在不同劑量組的差異具均有統計學意義(P0.05）。結論 MTX可損傷輸卵管雌激素受體，且損傷效應存在一定的量-效關系，提示臨床中使用MTX保守治

2、療異位妊娠時，應減少劑量，否則可能會造成后續的再次異位妊娠或繼發不孕。 關鍵詞： 甲氨蝶呤 輸卵管 雌激素受體 孕激素受體 近年對輸卵管妊娠的早期診斷率顯著提高，使得藥物保守治療得以應用。目前，甲氨蝶呤（methotrexate, MTX）是輸卵管妊娠的藥物保守治療中常用和首選的藥物，該藥可抑制滋養細胞增生，破壞絨毛，促使胚胎組織壞死、脫落，從而達到保守治療輸卵管妊娠的目的1。雌、孕激素受體廣泛存在于女性生殖道組織中，兩者的的協調表達狀態與胚泡著床機制密切相關。本文首次系統研究不同劑量MTX對雌性假孕SD大鼠輸卵管黏膜雌、孕激素受體的損傷效應及可能的量-效關系，探討MTX治療后輸卵管損傷對后續

3、妊娠的潛在影響，為臨床使用MTX保守治療異位妊娠提供理性的合理選擇。 1 材料與方法 1.1 實驗動物及試劑 雌性未孕SD(sprague dawley)大鼠40只，68周齡，體重180200g，由溫州醫學院實驗動物中心提供；甲氨蝶呤購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；妊馬血清促性腺激素(Pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)購自杭州動物藥品廠；人絨毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin，HCG)購自麗珠集團制藥廠；雌激素受體(estrogen receptors，ER)、孕激素受體(progesterone receptors

4、，PR)單抗免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程公司。 1.2 方法 （1）假孕大鼠模型的制備及MTX處理：40只雌性SD大鼠，清潔實驗動物條件下飼養，置于室溫25，正常的晝夜光照，實驗前參照文獻中使用的方法制作假孕模型2，所有大鼠皮下注射PMSG 50U，48h后再次皮下注射HCG 100U。致假孕狀態后再行MTX腹腔注射，依劑量不同，假孕大鼠被隨機分為1mg/kg（組，10只大鼠）、2mg/kg（組，10只大鼠）、 5mg/kg（組，10只大鼠），另設置腹腔注射生理鹽水0.5ml為對照組（組，10只大鼠）。MTX處理后10d，處死各組大鼠，因輸卵管妊娠多發生在壺腹部，因此本研究取鄰近卵巢部

5、位的雙側輸卵管壺腹部組織。所有標本用10%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，制成5m厚的石蠟切片，進行雌、孕激素受體的免疫組化染色，觀察不同組中MTX對輸卵管雌孕激素受體的損傷效應與量-效關系。本研究中所有的動物實驗均按照我國有關動物實驗的立法進行。（2）免疫組織化學染色及判斷標準：采用免疫組化SP二步法，參照文獻中的方法判定染色結果3。每張免疫組化切片在200倍光鏡下觀察5個視野，陽性細胞表達占30%為(+)，占50%以上為(+)，兩者之間為(+)，未見陽性表達或只有極少數陽性細胞染色為陰性表達(-)。以PBS代替一抗作為陰性對照。 1.3 統計學處理 ER、PR的陽性表達率為計數資料，采用SPS

6、S 10.0軟件包建立數據庫，進行統計分析；不同劑量MTX處理后的陽性表達率比較采用Kruskal-wallis檢驗。以P0.05為差異有統計學意義。 2 結果 ER和PR陽性表達主要位于輸卵管黏膜組織的上皮細胞核中，為棕黃色顆粒染色，空白對照中未見棕黃色染色，另外在輸卵管壁肌纖維核中亦有少量ER和PR的陽性表達。結果顯示，不同劑量MTX處理均下調了大鼠輸卵管黏膜上皮組織中ER表達，經Kruskal-wallis檢驗，差異具有統計學意義 (P0.05），詳見表1和圖2。表1 不同劑量MTX作用后假孕大鼠輸卵管中ER、PR表達情況3 討論 3.1 MTX在輸卵管妊娠保守治療中的應用 近年來，隨著

7、盆腔炎癥性疾病的增多，異位妊娠的發生率呈上升趨勢。究其原因，主要的致病因素是各種原發、繼發的輸卵管器質性或功能性病變，如盆腔炎、盆腔手術、輸卵管發育不良等機械性病變可損害輸卵管結構及生理功能的完整性，影響輸卵管內膜纖毛細胞的分泌和擺動，影響管壁平滑肌層的節律性收縮，干擾受精卵在輸卵管中的輸送，導致宮外孕或不孕癥發生4。進一步的研究發現，輸卵管壁的肌層收縮和纖毛細胞的擺動功能在一定程度上受輸卵管局部組織中雌、孕激素的雙重調節，局部平衡的激素環境對于協調受精卵的輸送與完成正常的受孕過程至關重要，而雌、孕激素的協調作用紊亂，容易致輸卵管妊娠5。甲氨蝶呤是輸卵管妊娠的藥物保守治療中常用，并作首選的藥物

8、，該藥可抑制滋養細胞增生，破壞絨毛，促使胚胎組織壞死脫落，從而達到保守治療輸卵管妊娠的目的1。有臨床研究報道，MTX在保守治療輸卵管妊娠中獲得了確切的療效，可使輸卵管內的異位妊娠組織完全溶解，無輸卵管組織的損傷，特別適合年輕且希望保留生育功能的育齡婦女6。但亦有報道MTX治療輸卵管妊娠時有一定的遠期并發癥，如輸卵管阻塞、復發性宮外孕等7。目前的研究較多集中在甲氨蝶呤對卵巢功能、月經恢復及生育功能的影響4，尚無甲氨蝶呤對輸卵管結構與功能損傷的相關基礎或臨床研究報道。如今隨著未生育輸卵管妊娠患者的日漸增多，在使用 MTX保守治療異位妊娠的同時，保留和恢復輸卵管正常結構與生理狀態、維護患者的生育功能

9、，逐漸成為臨床治療的需要。關于輸卵管妊娠的動物模型，有報道人類與非靈長類動物在子宮與輸卵管解剖、生理方面存在較大差異，目前無論在自然界或在實驗室中，非靈長類動物的輸卵管妊娠發生率很低8，Lee等9報道即使結扎大鼠輸卵管后也很難制造出輸卵管妊娠的動物模型。可見目前尚缺乏成功建立輸卵管妊娠的確切動物模型10，11。故而本研究參照文獻中采用的方法2，使用假孕SD大鼠，觀察不同劑量MTX 對在體輸卵管雌、孕激素受體的損傷效應，首次系統研究甲氨蝶呤對假孕SD大鼠輸卵管黏膜結構與功能的損傷效應，以及可能的量-效關系。 3.2 甲氨蝶呤對輸卵管黏膜雌、孕激素受體的影響 雌、孕激素受體廣泛存在于女性生殖道組織

10、中，通常，ER、PR在子宮內膜腺上皮中的表達呈現周期性變化，增生期高表達、分泌期低表達，尤其PR在分泌期的子宮內膜腺上皮中表達迅速降低，甚至消失12；而分泌期是子宮著床窗開放時期，此時PR的低表達是子宮建立容受的前提之一13。可見，子宮內膜中的雌、孕激素受體的協調表達狀態與胚泡著床機制較為明確。輸卵管和子宮皆起源于苗勒氏管，故推測二者的受精著床機制相似。前述輸卵管局部均衡的雌、孕激素環境對輸卵管功能性運動和正常受孕的調節擔任重要角色作用。生理狀態下，輸卵管黏膜及平滑肌的節律性收縮均隨雌、孕激素水平呈周期性變化，雌激素可使輸卵管肌層向傘端方向蠕動，并使輸卵管峽部收縮，而孕激素可抑制雌激素的這種作

11、用，雌、孕激素的協同作用，維持受精卵在輸卵管內向宮腔方向正常運行，如某些因素使輸卵管黏膜ER、PR表達下降或失調，輸卵管局部低落的激素環境延緩受精卵在輸卵管內的移行過程，可能發生與宮內妊娠相似的輸卵管著床及妊娠5。還有研究認為分泌期ER、PR在輸卵管上的表達與子宮內膜上相反，即分泌期輸卵管上的高表達可避免受精卵在輸卵管上著床，起到保護輸卵管的屏障作用14。Jolande15和Sadan等16提出，輸卵管妊娠的發生中，由于輸卵管管壁存在某種缺陷，內膜的蛻膜反應差，輸卵管璧中ER、 PR的表達較弱，是導致輸卵管妊娠的內在因素。鄭萍等17的研究亦證實輸卵管妊娠的管壁組織中孕激素含量顯著降低，從而導致

12、米非司酮治療的失敗。還有研究表明促排卵藥物克氯米芬因拮抗雌激素對輸卵管運動的調節作用，從而成為其易致宮外孕的病理因素18。此外，輔助生育技術可能使患者處于高雌激素水平、低孕激素水平的狀態，這種失調的激素狀態亦會影響輸卵管輸送受精卵，從而易致輸卵管妊娠或宮內、外同時妊娠5。本研究，在假孕SD大鼠輸卵管中觀察到不同劑量MTX在急性期、遠期均顯著下調輸卵管黏膜上皮中ER的表達，均弱于對照組（P0.05），MTX對大鼠輸卵管PR的損傷尚不能確定。可見，MTX處理后輸卵管局部出現了不同程度的雌、孕激素受體表達下降或失調，且存在一定的量-效關系。如上所述，這些改變會潛在影響輸卵管黏膜纖毛上皮和肌層的運動功

13、能，失去了黏膜防護屏障的輸卵管可能會在后續妊娠中發生再次輸卵管妊娠或不孕。 總之，多年的臨床實踐證實，MTX在輸卵管妊娠保守治療中有確切療效，但本研究首次揭示了MTX作用后的輸卵管出現了結構及功能的損傷，且損傷效應存在一定的量-效關系，提示臨床診療中使用MTX保守治療異位妊娠時，應減少劑量，力求維持輸卵管局部雌、孕激素受體的正常水平，否則可能會因輸卵管的形態學改變或ER、PR表達下調，造成后續的再次異位妊娠或繼發不孕。【參考文獻】 1 Barnhart KT, Gosman G, Ashby R,et al. The medical management of ectopic pregnanc

14、y: a meta-analysis comparing “single dose” and “multidose” regimens.Obstet Gynecol,2003,101(4):778784. 2 Er-Yao W, Yang YU, Xue-Mei LI, et al. Effects of different nuclear transfer and activation methods on the development of mouse somatic cell cloned embryos. Chinese Science Bulletin,2007,52(2):209

15、214. 3 Amacho-Arroyo I, Gonzlez-Agero G, Gamboa-Domnguez A, et al. Progesterone receptor isoforms expression pattern in human chordomas. J Neurooncol,2000,49(1):17. 4 Barnhart KT, Sammel MD, Gracia CR, et al. Risk factors for ectopic pregnancy in women with symptomatic first-trimester pregnancies. F

16、ertil Steril,2006,86(1):3643. 5 吳效科,周珊英.宮內外同時妊娠.中華婦產科雜志,1999,34(1):5658. 6 Erdem M, Erdem A, Arslan M, et al. Single-dose methotrexate for the treatment of unruptured ectopic pregnancy. Arch Gynecol Obstet,2004,270(4):201204. 7 Merisio C, Anfuso S, Berretta R, et al. Single-dose methotrexate for ectopic pregnancy treatment: preliminary data. Acta Biomed Ateneo Parmense,2005,76(1):3336. 8 Corpa JM. Ectopic pregnancy in animals and humans. Reproduction,2006,131(4):631640. 9 Lee RK, Lin S