1、老年人載脂蛋白E基因多態性、骨密度和骨量丟失               作者：周波,王曉紅,王松濤,郭連營,徐超,張卓，闞志英 【摘要】  探討老年人載脂蛋白E（ApoE）基因多態性與髖骨密度（BMD）、骨丟失的關系。方法:隨機選取沈陽市60歲以上漢族健康老年人100名，用聚合酶鏈反應限制性片段長度多態性（PCR?RELP）方法檢測ApoE基因型，用DPX-L雙能X線吸收儀（Lunar,USA）分別在2000年和2005年兩次測量研究

2、對象髖部骨密度。結果：該人群ApoE基因型頻率分布為 E2/3:17%, E3/3:66%,E3/4:15%, E4/4:1%，沒有E2/2和E4/4型。等位基因頻率分部為2：8%，3：84%，4：8%。無論男女攜帶ApoE4基因組和不攜帶ApoE4基因組間年齡、身高和體重均無差異。在2000年，攜帶ApoE4基因組和不攜帶ApoE4基因組兩組股骨頸、大轉子和 Ward區的骨密度經身高、體重和年齡校正后，男女均沒有顯著性差異；相同分析各部位年骨丟失率也沒有顯著性差異。結論：該人群ApoE基因型與髖部骨密度無明顯相關性。 【關鍵詞】  載脂蛋白E；基因多態性；骨密度；骨丟失Abstra

3、ctObjective:To study the association between the ApoE gene polymorphism and bone mineral density (BMD), bone loss in older adults.Methods:One hundred healthy Han volunteers over 60 years old in Shenyang were selected.ApoE gene was measured by polymerase chain reaction?restriction fragment length pol

4、ymorphism (PCR?RELP).BMD at hip was measured using dual-energy X-ray (DPX?L) absorption apparatus (Lunar,USA) in 2000 and 2005, respectively.Results：The ApoE gene phenotype in the population was E2/3: 16%, E3/3: 66%, E4/3:15%, E4/4:1%, while E2/2 and E4/2 was not found. The ApoE all lelomorph freque

5、ncies were 8% for2，84% for3，8% for4. There were no difference in age, height and weight with the presence ApoE4 and absence ApoE4 in women and men. In 2000， after adjustment for height, weight, and age, there was no significant difference of the BMD in the femoral neck, trverosity and Ward areas bet

6、ween presence Apo E 4 and absence ApoE4 women and men. Annualized bone loss rate at hip did not differ by ApoE genotype for women and men. Conclusion:In our data, there is no significant association between Apo E genotype and BMD, bone loss of hip.Key wordsApolipoprotein E gene; polymorphism; bone m

7、ineral density; bone loss    骨質疏松癥是與多種基因相關的疾病，其侯選基因的研究對于評估骨質疏松性骨折的危險性、基因診斷和治療具有重要作用。近年來，國內外學者越來越重視載脂蛋白E（ApoE）基因多態性與骨質疏松的關系。有研究表明ApoE4型基因攜帶者骨量丟失速度快，易導致原發性骨質疏松癥及其骨折1-3。而另一些研究沒有觀察到ApoE基因多態性與骨密度及骨丟失有關4-7。本文探討了沈陽市老年人的ApoE基因多態性與髖部骨密度及骨量丟失的關系。  對象與方法1.1  對象2000年3月在沈陽市某社區內隨機選出無血緣關系6

8、0歲以上的漢族健康老年人作為研究對象，排除患有糖尿病、甲狀腺疾病、腎臟疾病等影響骨代謝的疾病,并未服用維生素D和鈣補充劑，嚴重高脂血癥者也被排除。于2005年3月對上述研究對象進行跟蹤研究，將資料完整者納入本文，共100名，其中男 46名，年齡（66.8±4.7）歲，女54名，年齡（64.6±3.8）歲。1.2  方法1.2.1  ApoE基因型測定 取靜脈血5ml經EDTA抗凝，DNA提取試劑盒（QIAamp DNA Mini Kit ）提取DNA。PCR引物按參考文獻設計8。上下游引物序列分別為：5TCCAAGGAGCTGCAGGCGGCG

9、CA3；5ACAGAATTCGCCCCGGCC?TGGTACACTGCCA3。PCR反應體系為50l，包括基因組DNA3l，10×擴增緩沖液；dNTPs 各200 mol/L；引物各25pmol。二甲基亞楓5l，MgCl22.5mmol/L, Taq DNA 聚合酶2 U （Promega ）。置熱循環儀（Biometra,T3）中按下列程序循環30次，即95變性30s ,60退火30s ,72延伸1min 30s，最后72再延伸10min。限制性酶切反應在40l體系中進行，包括PCR反應產物10l，Cfo I限制性內切酶20U（Promega），37，4 h。采用非變性聚丙烯酰胺電

10、泳（濃度為12%，交聯度29：1），在常溫，離子強度為1×TBE條件下，70V恒壓電泳1.5h，分離Cfo I產物。0.5ml/L 濃度的EB中染色40min，在紫外燈下觀察、照像，分型。基因分析在已知標準物的對照下反復進行多次，以排除錯誤出現。1.2.2  髖部骨密度測定 用DPX?L雙能X線吸收儀（Lunar,USA）在2000年3月和2005年3月分別兩次測定研究對象左測股骨頸、Ward三角和大轉子區的骨密度（g/cm2）。體模反復測定的變異系數為0.45%。1.3  統計學分析用Data Desk 6.1 軟件(Data Description

11、Inc, Ithaca,NY)進行數據處理。基因頻率采用基因計數法計算，基因頻率比較采用似然比2檢驗。每位研究對象年骨丟失率=（第2次骨密度值第1次骨密度值）/第1次骨密度值5×100%。為校正部分偏態分布數據，將數據（除年齡外）均變成自然對數后再進行分析。各組內的骨密度比較采用配對t檢驗。基因型各組間骨密度均值和年骨丟失率的比較用協方差分析，因為已知身高、體重和年齡是影響骨密度的因素，在分析時均以這些因素校正。 2  結果2.1  ApoE基因型及等位基因頻率分布該人群ApoE基因型分布為E2/3：17 %,E3/3：66%,E4/3：15%，E4/4：1%，沒

12、有E2/2和E4/2型。等位基因頻率分別為2：8%, 3：84%,4：8%。男女間等位基因頻率經2檢驗差異無統計學意義（2=1.81,P>0.05）。2.2  ApoE基因型對髖部骨密度的影響 攜帶ApoE4基因組(E4/3和E4/4)和不攜帶ApoE4基因組(E3/2 和E3/3)人群年齡、體重、身高和人體重指數（BMI）沒有顯著性差異。比較男性、女性攜帶ApoE4基因組和不攜帶ApoE4基因組間股骨頸、大轉子和Ward 區的第1次骨密度，經年齡、身高和體重校正后，差異沒有顯著性。2.3  ApoE基因型對骨丟失的影響 男女各組髖部骨密度第二次均

13、明顯低于第一次。經年齡、身高和體重校正，無論男女攜帶ApoE4基因組和不攜帶ApoE4基因組間股骨頸、大轉子和Ward 區的年骨丟失率差異均無顯著性統計學意義。表Apo E基因型與髖部骨密度、骨丟失情況（略）注：1)與本組第一次比較，P0.013  討論    本研究所分析人群的ApoE基因頻率與國內研究報道的結果相似7，9，具有群體代表性。研究表明ApoE4基因型與一些疾病有關，本研究對象已排除可能與Apo E4基因型有關的疾病，如患有糖尿病、甲狀腺疾病、腎臟疾病等影響骨代謝的疾病,患有嚴重心血管疾病和高脂血癥者也被排除。  

14、60; 一些研究認為AopE基因型通過影響血漿維生素K和骨鈣素水平調節骨代謝，ApoE2型和ApoE3型者血漿維生素K水平高于ApoE4型者，因此骨鈣素羧化程度較高，有利于骨形成10。Masataka等10報道ApoE4等位基因與絕經后日本婦女低骨密度密切相關，攜帶ApoE4等位基因者骨密度低。Villarreal等報道1攜帶ApoE型者骨丟失速率快，陶軍和胡建華2，3均報道中國絕經后婦女原發性骨質疏松患癥者ApoE4型等位基因頻率明顯高于正常對照者。但也有報道沒有觀察到ApoE基因型與骨密度的關系。Schoofs MW 等4對5 857名白人進行2到7年的跟蹤沒有觀察到ApoE4 基因型對髖

15、部骨密度和骨丟失的影響。Wong SY 等7 調查了香港人也沒有發現ApoE基因型與髖部骨密度有關。本文結果顯示該人群ApoE基因型與髖部骨密度、骨丟失無明顯相關性。由于ApoE基因型分布具有種族和地區差異，中國人Apo E4型攜帶者少，在本文中，研究對象人數100名，ApoE4型攜帶者僅16名可能影響結果。因此，關于ApoE基因多態性對骨密度和骨丟失的影響還需大樣本長期的研究。 【參考文獻】  Villarreal E, Bermddez A. Polymorphisms of APO-E in Colombian women with osteoporosis: cor

16、relation with clinical and social risk variablesJ. Biomedica, 2004, 24(1):50-55. 2陶軍，許永武，都麗.原發性骨質疏松癥患者的栽脂蛋白E 基因多態性J.中國臨床康復，2006，10（40)：183-185.3胡建華，黃公怡，王曉霞,等. 載脂蛋白E基因多態現象與原發性骨質疏松癥相關性的初步研究J. 中華骨科雜志，1999,19（10）：597-599Schoofs MW, an der Klife M, Hofman A, et al. ApoE gene polymorphisms, BMD, and fract

17、ure risk in elderly men and women: the Rotterdam study J. J Bone Miner Res，2004, 19(9):1490-1496.5Otsuki T, Sakaguchi H, Hatta E, et al. Effects of genetic and nutritional factors on bone mineral density in young adults J. Int J Mol Med,2004,14(4):669-6766Beavan SR, Prentice A, Stirling DM, et al. E

18、thnic differences in osteocalcin gamma?carboxylation, plasma phylloquinone (vitamin K1) and Apolipoprotein E genotypeJ . Eur J Clin Nutr, 2005 ,59(1):72-81.7Wong SY, Lau EM, Li M, et al. The prevalence of Apo E4 genotype and its relationship to bone mineral density in Hong Kong Chinese J. J Bone Miner Metab, 2005, 23 (3)261-265.8Philip RW, William HP, Gil