1、 TSQ Quantum液質聯用儀使用手冊 賽默飛世爾科技(上海有限公司2007.5目 錄 第一章 簡介1.1 ESI或 APCI 哪個更適合分析樣品?1.2 如何將樣品引入質譜儀1.3 使用何種緩沖溶液1.4 不同液相色譜流速下如何調整質譜工作參數第二章 ESI/MS/MS模式下調諧校準質譜儀2.1 設置直接進樣法引入樣品2.2 調諧校準設置2.3 使用 ESI 源形成穩定的離子束2.4 ESI/MS模式下的檢驗操作2.5 ESI/MS/MS正離子模式下自動調諧校準2.6 ESI/MS/MS負離子模式下自動調諧校準2.7 調諧校準后沖洗系統第三章 ESI/MS/MS模式下優化目標化合物的質譜

2、條件3.1 ESI模式下過定量環引入樣品3.2 ESI/MS/MS模式下優化目標化合物的質譜條件 3.3 ESI/MS/MS模式下自動優化目標化合物的質譜條件 第四章 使用 Tune Master采集 ESI/MS/MS數據4.1 ESI模式下通過手動定量環引入樣品4.2 SRM掃描模式下采集 ESI/MS/MS數據第五章 Xcalibur 使用5.1 Instrument Setup 儀器方法的設置5.2 Sequence Setup 進樣序列的設置5.3 Processing Setup 數據處理方法的設置(定量和定性 5.4 Libray Browser 譜庫檢索瀏覽器5.5 Xrepo

3、rt第六章 儀器維護6.1 Surveyor As 自動進樣器6.2 Surveyor LC Pump 液相泵6.3 Surveyor PDA 二極管陣列檢測器6.4 TSQ Quantum6.5 機械泵附錄 1 溶液配制 .A-1A.1 調諧和校準溶液 . A-2 使用預混合瓶制備聚酪氨酸 1, 3, 6調諧校準溶液 A-2 使用化學干粉制備聚酪氨酸 1, 3, 6調諧校準溶液 . A-3A.2 利血平溶液 . A-4 利血平儲備溶液 .A-4 利血平試樣溶液 .A-4附錄 2 儀器方法建立指南 .B-1 附錄 3微流操作 .C-1第一章 簡 介TSQ Quantum是一種高性能三級四極桿質

4、譜儀,包括一臺注射泵、一個六通閥、一個大氣壓電離 (API源和 Xcalibur ®數據系統。在一個典型的分析實驗中,可以采取下面任意一種進樣方法:使用注射泵,不經過六通閥或者 LC 系統(直接進樣 。注射泵可以直接連接至離子源,為樣品溶 液或調諧校準溶液提供一個穩定的進樣狀態。使用注射泵和 LC 系統(直接注射至 LC 流動相 ,不經過六通閥。注射泵可以用于直接向 LC 系統出 來的流動相中注射樣品。使用六通閥(切換到 Load 端及 LC 系統 (流動注射分析 。可用注射泵填充回路 (定量環進樣 ,或者 也可以手動填充回路 (手動定量環進樣 。使用六通閥(切換到 Waste 端和

5、安裝有分析柱的 LC 系統。 可以對數據系統進行配置, 使流動相流 向廢液,以避免由于帶有不希望有的樣品物質對質譜儀造成的不必要的沾污。使用不帶六通閥的 LC 系統。為減少 LC 系統的空體積, LC 系統可以直接連接至離子源。使用 LC/MS進行分析時,樣品注射至 LC 柱,然后分離成不同的組分。不同組分從 LC 柱流出,進 入質譜儀進行分析。使用直接注射或者流動注射分析時,在樣品進入質譜儀前,樣品組分沒有經過色譜 分離。隨后從質譜儀得到的數據被 Xcalibur 系統存儲并處理。1.1 ESI 或 APCI 哪個更適合分析用戶的樣品電噴霧電離 (ESI大氣壓化學電離 (APCI通常,極性化

6、合物,如胺、肽和蛋白質最好使用 ESI 進行分析;非極性化合物如類固醇最好使用 APCI 進行分析。樣品離子可能攜帶一個或者多個電荷, 樣品所攜帶電荷的數量取決于目標分析物的結構、 流動相和 電離模式。ESI/MSESI 模式通常產生由單電荷離子組成的質譜圖,但是還要取決于被分析物的結構和溶劑類 型。當產生多電荷離子時,質譜譜圖結果可進行數學轉換從而表示樣品的分子量。ESI 模式將溶液內的離子轉換成氣態。許多此前并不適合質譜分析的樣品 (例如,熱穩定性差的化合 物或者高分子量的化合物 可以通過 ESI 模式進行分析。 ESI 可用于分析任意在溶液中已經預成離子的極 性化合物,預形成離子可以包括

7、加合離子。例如聚乙二醇可以在有醋酸銨存在的溶液中分析出來,因 為, NH 4+和聚合物中的氧原子可以形成加合離子的形式。由于多次放電,使用 ESI , TSQ Quantum Discovery MAX質譜儀可以分析分子量超過 100,000 u的化合物。 ESI 特別適用極性化合物的質譜分析, 包括生物聚合物 (例如,蛋白質,肽,糖蛋白類和核苷 、藥物及其代謝物和工業聚合物。用戶可以在正負兩種離子掃描模式下使用 ESI 源。離子的掃描模式取決于溶液中預形成離子的極 性:酸性分子在高 pH 值溶液中形成負離子,堿性分子在低 pH 值溶液中形成正離子。正電壓的 ESI 探針用來產生正離子,負電壓

8、的 ESI 探針用來產生負離子。LC 流動相流入質譜儀的流速可以從 1 µL/min (使用納升噴霧離子源 到 1000 µL/min (使用標準 ESI 源 。請參考表 1-1。 (在 ESI 中,緩沖溶液類型和緩沖溶液強度對靈敏度都有非常顯著的影響。因此, 正確地選擇緩沖溶液非常重要 。在分析大分子量的蛋白質或肽時,由于多電荷被測離子的存在,所以所得到的質譜圖通常由一系列峰組成。 ESI 過程受霧滴尺寸、表面電荷、液體表面張力、溶劑揮發性和離子溶解強度的影響。具有較大表面張 力、低揮發能力、較強的離子溶解強度、低表面電荷數和高電導率的大霧滴會阻礙產生良好的電噴霧。混合有

9、機 -水溶劑體系,包括有機溶劑,如甲醇、乙腈和異丙醇比單獨的水溶液更適合 ESI 源。揮發性酸 堿可用于 ESI ,但是不推薦使用超過 10 mM的鹽溶液。強無機酸堿會嚴重損害儀器。要獲得穩定的電噴霧可參考如下建議:溶劑體系避免使用不揮發性鹽和緩沖劑。例如,避免使用含有鈉鹽和鉀鹽,避免使用磷酸鹽。若確實 需要可以銨鹽代替。使用有機 -水溶劑體系。使用揮發性酸堿。如有可能,優化目標被測物溶劑體系的 pH 值。例如,被測物含有一價或二價銨離子,那么流動相應該 為酸性 (pH 2到 5 。 pH 為酸性有助于溶液中正離子的存在。APCI/MS就像 ESI , APCI 也是一種軟電離技術,與電子電離

10、相反。 APCI 可以給出稍具揮發性的、低極性化合 物的分子量信息。 APCI 通常用于分析分子量不超過 1000 u的小分子。APCI 是一種氣相電離技術。 因此, 被分析物和溶劑蒸氣的酸堿度在 APCI 分析過程中起著至關重要的作 用。在 APCI 模式下, LC 系統流入質譜儀的流動相的流速范圍為 0.2到 2 mL/min。請參考的表 1-2。用戶 可以在正負兩種模式下使用 APCI 源。在正離子模式下,帶有堿基的分子會產生強的離子流。帶有酸性基 團的分子,如羧酸和酸式醇,在負離子模式下可產生強的離子流。雖然通常產生的負離子數量比正離子的 數量要少一些,但是,負離子模式是更特殊的。這是

11、因為負離子模式下產生的化學噪音通常低于正離子模 式。因此,在負離子模式下的信噪比要好于正離子模式下的。1.2 如何將樣品引入質譜儀注射泵經常用于在 ESI 模式下自動調諧和調諧校準時引入調諧校準溶液。 用戶也可以在 ESI 模式下使用 該方法以穩定的流速向系統中引入純的被測物溶液。用戶可以使用 T 形連接管將樣品從注射泵中引入 LC 流動相無論是否安裝有色譜柱,然后樣品隨 流動相進入質譜儀。這種方法用于需要進樣流速穩定和流動相流速很高的情況下。特別適用于在 ESI 或 APCI 模式下校準目標分析物。用戶可以在穩定的流速下將純被測物溶液引入 ESI 或 APCI 源。用戶可以使用注射器將樣品引

12、入質譜六通轉化閥上的定量環中。 然后使用轉換閥將樣品引入流動相中, 一起流入質譜儀。這種技術在 ESI 和 APCI 模式下將純分析物集中快速引入質譜儀中。以注射器將樣品引 入轉化閥上的定量環中,這種進樣方法在純品數量非常少量的情況下是非常有用的。用戶也可使用自動進樣器向 LC 流動相中引入樣品。 該方法也用于在 ESI 或 APCI 模式下將純的被測物溶 液快速集中地引入質譜儀中。最后,用戶可以使用液相自動進樣器將混合樣品引入到液相色譜柱中。在 ESI 或者 APCI 模式下,這種 技術可以將被分析混合物在進入質譜儀前得以分離,被分離化合物按順序進入質譜儀。1.3 使用何種緩沖溶液推薦使用揮

13、發性緩沖溶液, 這樣可能會得到最好分析結果。 許多揮發性緩沖溶液都可代替不揮發性緩沖溶液。揮發性緩沖溶液包括以下幾種:醋酸醋酸銨甲酸銨氫氧化銨三乙胺 (TEA三氟乙酸 (TFA有些 LC 應用中使用不揮發性緩沖溶液,如磷酸鹽或硼酸鹽緩沖溶液。然而,使用不揮發性緩沖溶液可能造成離子源結鹽,進而導致靈敏度降低。對 LC 應用而言,使用不揮發性緩沖溶液時,要想得到最佳結果,請遵從如下原則:安裝離子吹掃錐可選配件。z 將緩沖溶液的濃度降至最低。1.4 不同液相色譜條流速下如何設置質譜工作參數ESI 探頭可以在流動相流速為 1 µL/min到 1.0 mL/min的情況下產生離子。這樣的流速范

14、圍可以采用不 同的分離技術:毛細管柱 LC 、微分離柱 LC 和分析柱 LC 。我們還提供一種可選配件納升噴霧離子源, 適用于 ESI 模式下的次微分析。APCI 探頭可以在流動相流速低至 50 µL/min的情況下產生離子,但是通常流速范圍為 0.2到 2.0 mL/min。在這樣的流速范圍內可以采用如下分離技術:微分離柱 LC 、分析 LC 和半制備 LC 。當用戶改變了進入質譜儀的流動相流速時,需要調節如下質譜儀參數:對于 ESI ,需要調節離子傳輸管溫度和鞘氣、輔助氣流速。對于 APCI ,需要調節離子傳輸管和霧化器溫度,還要調節鞘氣和輔助氣流速。通常,流入質譜儀的液體的速度

15、越高,離子傳輸管 (霧化器 的溫度就越高,并且氣體流速也就越高。表 1-1給出了在 ESI 模式下,不同 LC 流動相流速情況下的離子傳輸管溫度和氣體流速設定的指導原 則。表 1-2給出了在 APCI 模式下,設定離子傳輸導管和霧化器的溫度及氣體流速的指導原則。表 1-1 LC/ESI/MS設置操作參數指導原則 (噴霧電壓 3到 4.5 kVLC 流動相流速 (µL/min 建議色譜柱內徑(mm毛細管溫度(°C鞘氣(psi輔助氣 (arb 10 毛細管 到 到 30 關閉 50到 100 1.0 250到 到 到 10 200到 到 到 到 到 20 400 30到 到 4

16、0表 1-2 LC/APCI/MS操作參數設定指導原則 (電暈放電 4 µALC 流動相流速 (mL/min 毛細管溫度(°C霧化器溫度(°C鞘氣 (psi 輔助氣 (arb0.2到 到 到 到 到 567第二章 ESI/MS/MS模式下調諧和校準質譜儀本章講述了如何調諧和校準質譜儀。這些步驟是使用調諧校準溶液進行的,溶液在低流速模式下直接 引入到質譜儀中。每一到三個月需要對質譜儀進行調諧校準,以使檢測器在整個質量范圍內都能達到最佳 檢測效果。按照本章講述的如下步驟調諧校準質譜儀: 使用注射泵將低濃度的聚酪氨酸調諧校準溶液直接注射到 ESI 源。 檢查調諧校準溶液

17、噴入質譜儀的霧化效率和噴霧穩定性。可以觀察到聚酪氨酸單體、三聚物和六聚物一價 正離子的質荷比分別為:m/z=182, m/z=508, m/z=997。 開始執行自動調諧校準步驟。2.1 設置直接進樣法進樣ESI 調諧校準所用的進樣設備是注射泵。注射泵可以長時間將調諧校準溶液直接注射到 ESI 源。 注射泵位于 TSQ Quantum Discovery MAX質譜儀的前面板上。 圖 2-1顯示的是從注射泵向 ESI/MS引入 樣品的管路連接圖。圖 2-1. 用 注射泵直接引入樣品的 ESI/MS管路連接圖接地組件樣品傳 輸管廢液管LC 接頭注射泵8開始此步驟之前, LC/MS必須為待機狀態。

18、按下列步驟設置注射泵,將調諧校準溶液引入 ESI 源:1. 在注射器接頭組件上的 LC 接頭和離子源上的接地接頭之間安裝樣品傳輸管。 (圖 2-1注意:為將交叉污染的可能降低到最小,調諧校準溶液、樣品溶液和優化化合物溶液,請使用不同的注射器和不同的樣品傳輸管。 為將 交叉污染的可能降低到最小,在重新將注射器插入注射器接頭組件中前,一定要用無塵紙擦拭注射器的端部。2. 裝上一個盛有 420 µL聚酪氨酸 -1, 3, 6調諧校準溶液的干凈的 500-µL Unimetrics®注射器。 (參考 附錄 A 溶 液配制, 了解調諧校準溶液準備過程。 3. 將注射器針頭插

19、入注射器接頭組件上的 Teflon ®管中,見圖 2-2。圖 2-2. 注射器和注射器接頭組件4. 將注射器裝入注射泵上的注射器夾套中。5. 按下注射泵手柄上的黑色釋放按鈕的同時,將泵柄下壓,直到它剛好接觸到注射泵活塞。2.2 調諧校準設置為確保得到最佳的自動調諧校準效果,需要正確設置儀器。按如下步驟設置質譜儀,進行調諧校準:1. 在 Tune Master中點擊 Control/Scan模式工具欄上的 On/Standby按鈕,打開質譜儀。當質譜儀處于 On 狀態 時: 質譜儀開始掃描 開始對 ESI 探頭供應氮 ESI 探頭已加高壓 Tune Master顯示實時譜圖2. 在使用

20、 ESI 源進行樣品分析之前, 一定要將 Tune Master置于 ESI 源模式。 當前離子源的模式顯示在標題欄 上,如圖 2-3所示。選擇 Setup > Change Ion Source > ESI, 將 Tune Master置于 ESI 源模式下。 3. 在 Control / Scan 模式工具欄上點擊 Compound Optimization Workspace按鈕,顯示該化合物優化工作區域,如圖 2-3。LC 接頭 (00101-18202 手緊接頭 (00101-18201壓蓋箍(00101-18196 Teflon 管 (00301-22915圖 2-3.

21、 化合物優化工作區域,圖中顯示當前質譜儀處于 ESI 模式離子源模式9 104. 為 Compound Dependent Device設置數值:a. 更改鞘氣壓力:i. 在工作區域右上角 Optimize Compound Dependent Devices視圖的 Device Display框中點擊 Sheath GasPressure 。該操作將設備微調框標題改為 Sheath Gas Pressure并允許用戶更改鞘氣壓力,見圖 2-4。 ii. 將鞘氣壓力設置為 5 psi。圖 2-4. 優化化合物敏感裝置視圖b. 更改輔助氣流速:i. 在裝置顯示框中點擊 Aux Valve Flo

22、w。ii. 將輔助氣流速設置為 5arb 。 (輔助氣流速將在 0到 5的范圍內進行調節,以達到最佳離子束密度和穩定性 c. 更改離子傳輸毛細管溫度:i. 在裝置顯示框中點擊 Capillary Temperature。ii. 將毛細管溫度設置為 270 。 (需要等待幾分鐘,毛細管溫度才能穩定在所設置的溫度。 d. 更改離子源裂解(CID 碰撞能量: i. 在設備顯示框中點擊 Source CID。ii. 將碰撞能量設置為 0 V。5. 配置注射泵以注入聚酪氨酸 -1, 3, 6調諧校準溶液,開啟注射泵:a. 選擇 Setup > Syringe Pump & Sample L

23、oop在工作區域右上角顯示注射泵和進樣定量環視圖,見圖 2-5。 b. 在 Syringe Flow Control單選框中選擇 On 選項,激活流速微調框。c. 將流速設置為 5.00 µL/min。 (流速可以在 1.00到 10.00 µL/min的范圍內進行調節,以達到最佳的離子束密度和穩定性。 設備滾 動框 設備名稱 設置值讀回值輸入值鞘氣壓力 圖 2-5. 注 射 泵 和 定 量 環 視 圖如果用戶使用的是 Unimetrics 或 Hamilton 注射器,轉到步驟 5.d 。如果使用的不是 Unimetrics 或 Hamilton 注射器,轉到步驟 5.f

24、 。d. 在注射器類型框中選擇 Unimetrics(或 Hamilton 選項,指定 Unimetrics (或 Hamilton 注射器。e. 在注射器大小群組框中,從體積下拉列表框中選擇 500 (或者用戶所用注射器的尺寸 ,指定注射器 體系為 500 µL。當指定好注射器類型和注射體積后, Tune Master自動設置合適的注射器內徑數值。轉到步驟 5.g 。 f. 如果用戶使用的不是 Unimetrics 或 Hamilton 注射器,需要按以下步驟手動設置注射器內徑:i. 在注射器類型群組框中選擇 Other 選項,指定用戶所用的不是 Unimetrics 或 Hami

25、lton 注射器,并激 活注射器內徑微調框。ii. 在注射器大小群組框中,從下拉列表框中選擇用戶所用注射器的體積。iii. 在注射器內徑微調框中輸入所用注射器的內徑尺寸數值。g. 點擊 Apply 按鈕應用上述設置,然后開啟注射泵。現在聚酪氨酸 -1, 3, 6調諧校準溶液將流入離子源。 2.3 ESI 得到穩定的噴霧開始調諧校準之前,需要得到穩定的噴霧束。噴霧束密度和穩定性很大程度上依賴離子源的性能。用 戶通過調節鞘氣壓力優化噴霧束密度和穩定性。按下述步驟建立 ESI 源穩定的噴霧束:1. 設置掃描參數,為觀察噴霧束密度和穩定性做準備:a. 在 Tune Master窗口中,在 Contro

26、l / Scan Mode工具欄上 點擊 Instrument Method Development Workspace按鈕顯示該工作區域,見圖 2-6。圖 2-6. Instrument Method Development Workspaceb. 在工作區域右上角的定義掃描視圖中選擇 Scan Type:點擊 Full Scan按鈕顯示 Scan Parameters, 見圖 2-7。c. 選擇 Scan Mode: Q1MS掃描模式。d. 在 Scan Parameters的 Scan Range框中選擇 Entry Mode:Center Mass選項按鈕顯示 Center Mass和

27、 Scan Width 。e. 在 Center Mass列表框中輸入 508.208, 設置掃描范圍的中心點為 508.208 u。f. 在 Scan Width微調框中輸入 10.000,設置掃描寬度為 10.000 u。g. 在 Scan Time微調框中輸入 0.20,設置掃描時間為 0.20 s。h. 在 Peak Width群組框的 Q1微調框中輸入 0.70,設置峰寬為 0.70 u。i. 確認沒有選中 AutoSIM(自動選擇離子監測 , Source CID, Data Processing和 Q2 CID Gas 復選框,確保 這些功能為 Off 。j. 確認 Micro

28、Scans設置為 1。k. 點擊 Apply 按鈕。掃描類型 圖 2-7. 定義掃描視圖,圖中顯示的是要得到穩定的離子流的典型設置 2. 在 Control / Scan Mode工具欄上點擊 Display TIC按鈕,開始在工作區域右下角的圖形視圖中開始 離子流跟蹤。3. 確保 Profile/Centroid按鈕在輪廓圖狀態, 以顯示輪廓類型數據。 如果 Profile/Centroid按鈕處于棒狀 圖狀態 ,點擊 Profile/Centroid按鈕將數據類型轉換為輪廓圖。4. 用戶需要將質譜儀置于正離子極性模式下完成此步驟。 通過觀察 Polarity 按鈕, 確定質譜儀的離子極性模

29、 式。確保 Polarity 鈕處于正離子狀態。如果質譜儀已經處于正離子極性模式,請轉到步驟 5。 如果需要更改質譜儀的離子極性模式,請轉到步驟 4。5. 將質譜儀設置為正離子極性模式:a. 關閉噴霧電壓:i.選擇 Display > Compound Dependent Devices在工作區域右上角顯示優化化合物敏感裝置 視圖,見圖 2-8。 ii. 設置噴霧電壓為 0 V。b. 在 Control / Scan Mode工具欄中點擊 Polarity 按鈕,將質譜儀切換至正離子極性模式。 c. 再次打開噴霧電壓:在 Optimize Compound Dependent Devic

30、es的窗口中,輸入 4000設置噴霧電壓為 4000 V。d. 確保其他參數如圖 2-8所示 。掃描模式掃描參數掃描范圍峰寬 圖 2-8. 優化化合物參數 5. 確定是否得到穩定的噴霧束:a. 在工作區域左下角的 Spectrum 視圖中,觀察 m/z為 508.208的質譜圖。b. 在 Spectrum 視圖中任意位置點擊一下,激活 File / Display工具欄上的 Display 按鈕。點擊 Normalize 工具欄按鈕將其轉換為Creep工具欄按鈕。該操作將調用 Y 軸歸一化模式,觀察 m/z 508.208相應的離子強度,見圖 2-9。c. 觀察 m/z 508.208的峰高。

31、如果峰高穩定,則已產生穩定的噴霧,不需要調節鞘氣壓力。每次掃描峰高偏差不應超過 30%。如果峰不穩定,則需要調節鞘氣壓力以產生穩定的噴霧。離子流的波動也 可以在工作區域右下角的 Graph 視圖中觀察到。注意:鞘氣壓力可以在 1到 15 psi的范圍內進行調節。通過調節鞘氣壓力建立穩定的離子束。過 低的鞘氣壓力可能導致信號穩定性的損失,但是 ,壓力過高又會導致峰值強度的損失。噴霧電壓圖 2-9. 儀器方法建立工作區域,判斷噴霧穩定 2.4 ESI/MS模式下的校正操作現在用戶可以確認質譜儀操作的準確性。直接將聚酪氨酸調諧校準溶液引入 ESI 源,并檢查溶液的 質譜圖。按下列步驟檢查調諧校準溶液

32、的質譜圖:1. 在工作區域左上角的 Define Scan視圖中,為檢驗 Q1質譜儀的正確操作設置掃描參數:a. Scan Parameters的 Scan Range框中,選擇 Entry Mode:FM/LM選項按鈕。顯示 First Mass和 Last Mass,見 圖 2-10。b. 在 First Mass微調框中輸入 150.000,將掃描范圍的下限設置為 150.000 u。c. 在 Last Mass微調框中輸入 1050.000,將掃描范圍的上限設置為 1050.000 u。d. Scan Time中輸入 1.20,將掃描時間設置為 1.20 s。e. 選擇 Data Pr

33、ocessing和 Average 選項按鈕。f. Data Processing中輸入 10。g. 確認沒有選中 AutoSIM , Source CID和 Q2 CID Gas復選框,確保這些選項關閉。h. Micro Scans設置為 1。i. 點擊 Apply 按鈕應用這些掃描參數。 圖 2-10. 定義掃描視圖,圖中顯示的是 Q1MS 掃描模式設置2. 在 Q1全掃描模式下查看調諧校準溶液的質譜峰: a. 在 工 作 區 域 左 下 角 的 Spectrum 視 圖 中 任 意 位 置 單 擊 鼠 標 , 激 活 File / Display工 具 欄 上 的 Display 。b.

34、 點擊 Creep 工具欄按鈕 ,將其轉換到 Normalize ,該操作將對譜圖進行歸一化處理。c. 在 Spectrum 視圖中,觀察如下調諧校準溶液單電荷離子的質譜圖:聚酪氨酸單體:m/z=182.082聚酪氨酸三聚物:m/z=508.208聚酪氨酸六聚物:m/z=997.398 圖 2-11. 譜圖視圖,圖中顯示的是聚酪按酸調諧校準溶液實時質譜圖3. 確認以下問題是肯定的:三個特征離子峰是否都為主峰。每種酪氨酸聚合物的峰高差值是否都在一個數量級之內。聚酪氨酸峰強度是否高于 107。信號是否穩定,每次掃描的誤差小于 15%。質譜峰形是否對稱,是否能完全分辨,是否完整。注意:為得到良好的聚

35、酪氨酸調諧校準信號,可以調節調諧氣體參數。鞘氣壓力可以在 1到 15 psi范圍內進行調節,輔助氣流速 可以在 0到 5arb 的范圍內調節,調諧校準溶液流速可以在 1到 15 µL/min的范圍內調節。如果上述問題的答案任一個為否” ,則可試著用以下方法排除故障:調節鞘氣壓力或輔助氣流速設置,或者調節調諧校準溶液流速。確保熔融石英毛細管沒有超出 ESI 探針端部。確保離子傳輸毛細管入口是清潔的,沒有被覆蓋。確保進入探頭的溶液沒有氣泡,管線和接頭部分沒有泄漏。4. 設置在 Q3模式下檢驗質譜儀運行的掃描參數:a. 在 Define Scan視圖中選擇 Q3MS 選項按鈕,激活 Q3掃

36、描,見圖 2-12。b. 檢查掃描參數與 Q1模式下的設置是否一致。c. 點擊 Apply 應 用 掃 描 設 置 。4. 在 Spectrum 視圖中再次觀察歸一化離子流信號值。如果符合上面第 3步的要求,則質譜儀可以在 Q3MS 模式下正確運行。 圖 2-12. 定義掃描視圖,圖中顯示的是在 Q3MS 掃描模式設置2.5 ESI/MS/MS正離子模式下自動調諧校準應定期性對儀器進行調諧校準 (每一到三個月 ,以保證質譜儀處于最佳工作狀態。請按照以下步驟在 ESI/MS/MS正離子模式下自動調諧校準質譜儀:1. 在 Tune Master窗口中點擊 System Tune and Calib

37、ration Workspace 按鈕 ,顯示該工作區域,見圖2-13。2. 在工作區域左上角的 System Tune and Calibration視圖中的 Compound 列表中選擇 Polytyrosine1,3,6, 將 自動選擇使用聚酪氨酸三種正離子進行調諧校準 (圖 2-13 。3. 選擇 Auto Tune-Calibration。4. 選擇 Both ,同時校正第一級和第三級四極桿。 圖 2-13. 系統調諧校準視圖,圖中顯示的是聚酪氨酸信號5. 點擊 Start 開 始 執 行 自 動 調 諧 校 準 步 驟 。系統調諧校準的實時信息會顯示在 Status 框內,因此,用

38、戶可以監測每個步驟進行情況。 ¾若自動調諧校準過程中出現錯誤,轉向步驟 6。如果自動調諧校準過程完成,并沒有出現錯誤,轉向步驟 7。6. 如果在自動調諧校準過程中出現錯誤,完成以下步驟再次執行調諧校準過程:¾點擊 Undo 恢復預先的調諧校準設置。¾點擊 Accept 重新為質譜儀加載預先的調諧校準設置。¾處理引起調諧校準進程失敗的問題。¾轉到步驟 5重新開始調諧校準進程。圖 2-14. 自動調諧校準進行中的系統調諧校準工作區域7. 點擊 Accept 按鈕,接受調諧校準過程的結果。接受調諧校準進行結果之后,會出現一個信息框,是否希望將正離子調

39、諧校準的設置拷貝至負離 子模式。如果已經在負離子模式下成功地對儀器進行過調諧校準,則點擊 No 。如果尚未在負離子模式下調諧校準過儀器,則點擊 Yes 。8. 執行如下操作保存校準文件:a. 點擊 Save Calib. As,見圖 2-15。b. File Name文本框中輸入要保存的校準文件名稱。c. 點擊 Save ,保存校準文件。如果在步驟 8中輸入的文件名已經存在,會出現一個信息框提示是否替換現有文件,見圖 2-16。替換已有文件,點擊 Yes ;不替換已有文件,點擊 No 。 File Name文本框中更改文件名, 然后點擊 Save 。此時將顯示 Save As對話框,見圖 2-

40、17。 圖 2-15. 保存校準文件對話框 圖 2-16. 確認替換校準文件信息框注意:用戶可以在 Tune Master中設置密碼保護一些應受限制的工作區域。 可以設置密碼保護的工作區域包括:System Tune and Calibration(系統調諧校準 , Full Instrument Control(完全儀器控制 和 Diagnostics(診斷 。系統提供了三種保護級別:無保護,自動保護和定制密碼保護。無保護意味著所有操作者都可以使用全部工作區域。自 動保護表示 Tune Master使用默認的密碼 lctsq 來保護一些應受限制的工作區域。定制密碼保護表示 ,主要操作 者 (

41、或實驗室管理者 可以選擇密碼保護應受限制的工作區域。如果用戶的 TSQ Quantum Discovery MAX系統已經被密碼保護,則在訪問受限制工作區域 (包括 System Tune and Calibration(系統調諧校準 工作區域 前需要得到密碼。如果丟失密碼,則需要重新安裝 TSQ Quantum Discovery MAX軟 件,重新將密碼設置為默認密碼 (lctsq。 圖 2-17. 調 諧 方 法 另 存 為 對 話 框9. 保存 Tune Method(調諧方法文件:a. 在 File Name文本框中輸入想要保存的調諧方法的文件名。b. 點擊 Save 保存調諧方法文

42、件。如果在步驟 9.a 中輸入的文件名已經存在,會彈出一個信息框提示是否替換現有文件。覆蓋已有文件,點擊 Yes ;不覆蓋現有文件,點擊 No ,在 File Name文本框中輸入新的文件名,并點擊 Save 。2.6 在 ESI/MS/MS負離子模式下自動調諧校準簡要描述 ESI/MS/MS負離子模式下調諧校準質譜儀:1. 將質譜儀更改至負離子極性模式:a. 關閉噴霧電壓,將噴霧電壓設置為 0 V;b. 切換至負離子模式;c. 將噴霧電壓設置為 3000 V;d. 鞘氣壓力更改為 15 psi;2. 在工作區域左上角的 System Tune and Calibration(系統調諧校準視圖

43、中從 Compound 列表框中選擇 Polytyrosine Neg, 將選擇聚酪氨酸三個負離子進行自動調諧校準,見圖 2-18;3. 選擇 Auto Tune-Calibration;4. 選擇 Both ;5. 點擊 Start ; 圖 2-18. 系統自動調諧校準工作區域,圖中顯示的是負離子模式下6. 點擊 Accept 按鈕,接受調諧校準過程的結果。7. 現在用戶可以執行如下操作保存校準文件:a. 點擊 Save Calib. As;b. 在 File Name文本框中輸入要保存的校準文件名稱;c. 點擊 Save ,保存校準文件;8. 保存 Tune Method文件;2.7 調諧

44、校準之后清洗系統按如下步驟清洗質譜儀:1. 關閉來自注射泵的液流:a. 在 Tune Master中選擇 Setup > Syringe Pump & Sample Loop在工作區域右上角顯示 Syringe Pump and Sample Loop視圖,見圖 2-21。b. 在 Syringe Flow Control框中選擇 Off 選項按鈕,然后點擊 Apply 。 圖 2-21. 注射泵和定量環視圖,圖中顯示注射泵為開啟狀態2. 將注射器從注射泵夾具上拆卸下來:3. 用 50:50的甲醇 /水溶液徹底清洗注射器。4. 清洗樣品傳輸管線、進樣管和 ESI 探頭:注意:用來

45、清洗注射器、 樣品傳輸管線、 進樣管和 ESI 探頭組件的溶劑取決于用戶溶解樣品所用的溶劑體系。 例如,如果用戶使用的是高濃度的緩沖溶液,使用酸性溶液比較合適。a. 注射器中裝入 50:50的甲醇 /水溶液(或者其它適宜的溶劑 。b. 握住注射器活塞適當的位置,小心將注射器針頭插入注射器接頭的 Teflon 管端部。c. 緩慢按壓下注射器活塞,清洗樣品傳輸管線、進樣管和 ESI 探頭。目測當探頭組件內 ESI 探頭有溶 液從端部流出時,使用無塵紙小心吸走多余的溶液。d. 小心地將注射器針頭從注射器接頭上取出。5. 清洗噴霧區域:a. 在噴霧瓶中裝入溶液。b. 將一大塊 Kimwipe 

46、4;紙 (或其它無塵紙 暫時放在區域下。c. 用噴霧瓶將噴霧罩內表面的污物沖洗下來。d. 取下用來吸收溶液的 Kimwipe 紙,再用干的 Kimwipe 紙擦拭噴霧區域表面。第三章 ESI/MS/MS模式下優化質譜條件本章主要介紹用戶如何使用自己的分析物作為校準化合物, 在 ESI/MS/MS模式下優化校準質譜儀的參數, 用戶可以通過自動優化步驟進一步優化質譜儀,提高分析物的檢測靈敏度。TSQ Quantum Discovery MAX系統提供的 Tune Methods(調諧方法的適用范圍很寬,通常不需要進 一步校準質譜儀即可使用。但是,對某些應用,用戶可能需要對質譜儀的若干參數進行優化。

47、例如,如下 參數可能影響 ESI 的性能和信號質量:噴霧電壓鞘氣壓力輔助氣流速加熱金屬毛細管溫度Tube lens電壓3.1 在 ESI 模式下通過定量環進樣引入樣品下述步驟是如何通過定量環引入用戶自己的化合物。圖 3-1顯示的是將注射泵中樣品引入 LC 流動相的管線 連接中。來自 LC至廢液接地兩通LC 兩通圖 3-1. LC 流動相引入樣品的進樣管線連接按下列步驟將注射泵中 ESI/MS樣品引入 LC 流動相的管線:1. 將注射器從注射泵夾具上拆卸下來:LC 接頭 手緊接頭(00101-18202 (00101-18081 壓蓋箍 Teflon 管(00101-18196 (00301-2

48、2915圖 3-2. 注射器和注射器接頭組件2. 拆卸安裝在注射器接頭組件和離子源接地組件之間的樣品傳輸管線。 3. 在注射器接頭組件和六通閥之間安裝一條樣品傳輸管線: a. 在注射器接頭組件的 LC 接頭上連接一段適當長度的管線。b. 將裝有螺母和壓蓋箍的管線的一端連接到轉向 /進樣閥的 5號端口,見圖 3-3。圖 3-3.六通閥,圖中顯示的是定量環進樣管線4. 將 420 µL濃度為 2 pg/µL的利血平樣品溶液裝入一只潔凈的、 500µL的 Unimetrics 注射器小心地將注射 器針頭插入注射器接頭的 Teflon 管端部。 (圖 3-25. 將注射器

49、裝入蠕動泵的注射器夾具中。6. 在按住注射泵手柄上的黑色釋放按鈕的同時,壓下手柄,直到它剛好接觸到注射器活塞。 7. 在六通閥和離子源接地組件之間安裝一段樣品傳輸管線:a. 安裝樣品傳輸管線,見圖 3-4。b. 將一段長度合適的、末端裝有螺母和壓蓋箍的管線連接到六通閥的 3號端口(圖 3-3 。 c. 將裝有螺母和壓蓋箍的管線的一端連接到離子源上的接地組件(圖 3-1 。來自注射器至離子源來自 LC至廢液 定量環圖 3-4. 樣品傳輸管線,安裝在轉向 /進樣閥和接地組件之間9. 在六通閥的 1號和 4號端口間安裝一個 5 µL、帶有螺母和壓蓋箍的定量環。10. 在 LC 系統和轉向

50、/進樣閥間安裝一條溶劑管線:a. 將一段長度合適、帶有適當接頭和壓蓋箍的管線連接至 LC 系統的出口。 b. 將帶有螺母和壓蓋箍的管線的另一端連接至六通閥的 2號端口。 11. 在六通閥 6號端安裝一條廢液管,并將其出口連接至廢液容器。3.2 在 ESI/MS/MS模式下優化用戶化合物的質譜測定條件如下步驟設置質譜儀,1. 在 Tune Master窗口中點擊 On/Standby按鈕,開啟質譜儀。 2. 設定正離子極性模式:a.關閉噴霧電壓,噴霧電壓設置為 0 V:3. 打開存儲有利血平校準或用戶待測物設置的 Tune Method文件, Tune Master將 Tune Method參數

51、下載至質 譜儀。4. 選擇 Display > Compound Dependent Devices在工作區域右上角顯示視圖如圖 4-7。 5. 設置數值如下:a Device Display框中已選中 Spray Voltage 。 b 將噴霧電壓改為 4000 V。 c. 設置鞘氣壓力:i. Device Display框中點擊 Sheath Gas Pressure,允許用戶更改鞘氣壓力。ii. 將鞘氣壓力設置為 30 psi。 d. 設置輔助氣流速:i. Device Display 框中點擊 Aux Valve Flow。 ii. 將輔助氣流速設置為 10個單位。e. 設置毛細

52、管溫度:i. Device Display 框中點擊 Capillary Temperature。 ii. 將毛細管溫度設置為 350。不銹鋼螺母手緊接頭接地組件至六通閥不銹鋼壓蓋箍 PEEK 管線 壓蓋箍 圖 3-5. Optimize Compound Dependent Devices視圖 ,圖中顯示為正離子極性設置f. 設置 Source CID裂解碰撞能量為 0 V。g. 設置 Collision Pressure為 1.5 mTorr。h. 設置 Collision Energy為 -38 eV。確保 Device Display框中顯示的回饋值約等于設定值。 (用戶可能需要等待幾

53、分鐘, 以使毛細管溫度穩 定在設定值上。 6. 配置 Syringe Pump:a. 選擇 Setup > Syringe Pump & Sample Loop,在 工 作 區 域 右 上 角 顯 示 視圖如圖 3-6。b. Syringe Flow Control 框中選擇 Off 選項按鈕,關閉注射泵。c. Syringe Type框中選擇 Unimetrics (或 Hamilton 選項按鈕。d. 在 Syringe Size框中,從 V olume 列表框中選擇 500,指定注射器體積為 500 µL。當用戶指定注射器類型和注射器體積, Tune Master

54、自動設置適當的注射器 ID 值。請轉到步驟 6.f 。 圖 3-6. 注射泵和樣品定量環視圖,圖中顯示的是自動定量環注射設置e. 如果用戶使用的不是 Unimetrics 或 Hamilton 注射器,需要按以下步驟手動指定注射器內徑: i. Syringe Type框中選擇 Other 選項按鈕。ii. 在 Syringe Size框的 V olume 列表框中選擇用戶所用注射器的體積。iii. 在 Syringe ID框中輸入用戶所用注射器的內徑。f. Sample Loop Size框中輸入 5, 指定定量環大小為 5 µL。g. 點擊 Apply , 注 射 泵 現 在 被 配 置 為 以 適 當 的 樣 品 量 注 入 樣 品 定 量 環 。7. 啟動溶劑流:a. 在 Control / Scan Mode工具欄點擊 AS/LC Direct Control按鈕,在工作區域右上角顯示視圖如圖 3-7。b Surveyor MS Pump傳送 50:50異丙醇 /水溶液,速度設置為 400 µL/min,如下圖所示。 圖