1、MAPK 信號通路在新生隱球菌致病機制中的作用     MAPK 信號通路在新生隱球菌致病機制中的作用【摘要】新生/格特隱球菌是一種雙相擔子類病原真菌.隱球菌性腦膜炎是最常見的隱球菌病,致殘率和死亡率極高.和宿主環境有效交流對隱球菌的生存至關重要.隱球菌利用復雜的信號系統來感應外界環境的變化并調控繁殖、發展和毒力.已知多種信號通路參與新生隱球菌對宿主環境的應答,調控新生隱球菌毒力.MAPK 通路( mitogen-activated protein kinase)是其中最重要的信號通路之一,包括高滲透性甘油促分裂原激酶信號轉導通路( high

2、osmolarity glycerol mitogen activatedprotein kinase signaling transduction pathway,HOG-MAPK) 、蛋白激酶C 信號轉導通路( protein kinase C mitogen activatedprotein kinase signaling transduction pathway,PKC-MAPK) 及Ste12 轉錄基因通路( sterile12 transcriptors mitogen activated proteinkinase signaling transduction pathway,

3、Ste12-MAPK) .對這些傳導通路各個環節的了解,不僅有助于闡明MAPK 通路的作用機制及其對毒力調控的作用,而且可以為尋找新的藥物靶點、治療新生隱球菌病提供幫助.【關鍵詞】MAPK; 信號途徑; 新生隱球菌; 隱球菌病隱球菌是擔子菌酵母類真菌,在人類和動物中可引起隱球菌病.大部分人類隱球菌病發生在免疫受損人群,但也可在免疫正常人群中發病.隱球菌性腦膜炎由于其高致病性、難治愈性,正引起人們廣泛的關注.樹、鴿糞、土壤等是適宜隱球菌的自然生態環境,這些環境可刺激交配和孢子生長1.新生/格特隱球菌共有四種血清類型: 血清A 型( 新生隱球菌格魯比變種) ,血清B 和C 型( 格特隱球菌) ,血

4、清D 型( 新生隱球菌新生變種) .不同血清型的隱球菌在生態分布、毒力方面存在不同程度的差異.公認的隱球菌毒力因子主要有四種: 莢膜、產生黑素、37 生長、胞外分泌酶2-5.另外,交配型、表型轉換、抗菌藥物敏感性以及應對外界信號應激的胞內信號轉導通路均對毒力有著不同程度的影響.已有越來越多的研究關注這些毒力影響因素.因此,闡明毒力相關的致病機制對隱球菌病的診治具有重要意義.但目前關于這一系統的具體機制還不清楚.本文就促分裂原蛋白激酶信號轉導通路如何調控毒力因子的機制作一闡述.1 MAPK 通路概述隱球菌是一種全球分布的真菌,主要分布于土壤、桉樹、鳥糞中.隱球菌細胞外環境由多種物理和生物因素組合

5、而成,極大地影響著其生存和發展.隱球菌在感染哺乳動物宿主時亦暴露于環境變化中,它必須要感受這些變化、迅速地對胞外信號做出反應使自身能夠靈活地應對這些外界環境變化,以利于定植和繁殖.某些胞外信號可能影響毒力的變化.隱球菌感受并傳遞胞外信號調整自身生理活動需要復雜的信號轉導系統.在進化過程中,真菌類生物已經發展了復雜而敏感的適應機制,使它們能夠通過適當的細胞內信號活動來適應外部環境的變化.促分裂原蛋白激酶( MAPK) 級聯反應是細胞適應機制中的重要部分之一.MAPK 通路由三種序列活化激酶組成.促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶( MAPKKK) 激活并活化促分裂原活化蛋白激酶激酶( MAPKK) ,

6、隨后MAPKK 激活促分裂原活化蛋白激酶( MAPK) .在釀酒酵母菌中,已發現至少五種信號轉導途徑包含MAPK 級聯反應: 細胞壁完整性通路、孢子壁組裝通路、菌絲生長通路、信息素反應通路、高滲透性甘油通路,分別調節其生長、形態改變、繁殖和應激反應6.白念珠菌是最常見的侵襲性真菌,MAPK通路在白念珠菌的致病機制中的作用可能是介導白念珠菌感染中關鍵的形態學變化: 酵母相向菌絲相的轉換7-8.通過基因學分析和表型鑒定發現白念珠菌中存在三種MAPK 通路: Mkc1 ( Mitogen-activatedprotein kinase ) 介導的細胞壁完整性通路、Cek1 /2 ( Candida

7、extracellular regulated protein kinases-like kinase ) 介導的交配和絲化通路和Hog1 介導的高滲透性甘油通路.近來,越來越多的證據表明,隱球菌的MAPK系統與釀酒酵母菌和白念珠菌有高度的相似,然而隱球菌的MAPK 通路在毒力調控方面同時又具有一些自身獨特的表現.類似的MAPK 通路也在隱球菌與宿主的生存中發揮重要作用,如莢膜合成、形態轉換等9,但已有的隱球菌MAPK 通路的研究僅限于新生隱球菌血清A 型、D 型兩種菌株,且該通路在兩種菌株有血清特異性.2 MAPK 通路構成隱球菌的MAPK 通路包括HOG-MAPK 通路、PKC-MAPK

8、通路及Ste12 轉錄基因通路10.這些MAPK 途徑既可特異性的調節相關毒力因子,又與其他途徑協同調節細胞壁的完整性、在37 生長的能力、莢膜與黑素的生成、交配與絲化、以及對高滲應激、氧化應激和紫外線的抵抗.2. 1 PKC-MAPK 通路PKC /Mpk1-MAPK 通路主要調節細胞壁完整性和高溫下生長,在新生隱球菌抵抗滲透壓、高溫、氧化應激和硝酸化等壓力中扮演重要角色,也在莢膜和黑素生成中發揮作用.此通路的關鍵成分包括小GTP 結合蛋白Rho1、Pkc1、Bck1 ( MAPKKK) 、Mkk1 ( MAPKK) 、Mpk1 ( MAPK) ,其中Mpk1 誘導下游組分影響毒力特征.在白

9、念珠菌中,Mkc1 ( Mpk1 類似物) 參與維持細胞壁合成和保持細胞壁穩定8.在新生隱球菌中也發現類似途徑協同參與應對高溫反應11.該途徑的核心成分是Mpk1,參與維持細胞壁的穩定性,是新生隱球菌在37下生長的重要影響因子.當隱球菌處于氧化應激等細胞壁受損條件下時,Mpk1 被磷酸化激活.激活的Mpk1完全依賴Pkc1 發揮壓力應對反應.新生隱球菌Mpk1突變株在小鼠隱球菌病模型中表現出毒力下降11和對抗菌藥物敏感性的增加12.pkc1 突變株對吡咯類抗真菌藥物的敏感性增加,提示該途徑可能參與新生隱球菌的藥物抵抗.Bahn 等還發現Bck1、Mkk1、Mpk1突變株都表現出對氧化應激、高溫

10、、抗菌藥物相似的高敏感性,說明這3 種基因處于同一信號傳導通路之中13.Gerik 等發現Pkc1突變株中,幾丁質和殼聚糖的錨定受損.Pkc1 突變株和Bck1、Mkk1、Mpk1突變株的細胞壁都受到損害,但Pkc1 突變株的損害更為嚴重14.另外研究發現,Pkc1 突變株表現出了莢膜缺陷和黑素的減少,而Bck1、Mkk1、Mpk1缺陷株的上述毒力特征并沒有受到影響.研究表明在Pkc1-MAPK 通路外,Pkc1可能通過調節多種信號轉導通路或者Pkc1 下游存在某種代償途徑來維持細胞壁的穩定.幾丁質是細胞壁重要組成部分,有研究發現白念珠菌編碼幾丁質合成酶基因的調節依賴與三種信號途徑: 鈣調蛋白

11、、PKC 和HOG 途徑15-16,這些信號途徑并不獨立發揮作用,而是構成交叉、反饋和補償機制組成的相互協調網絡.細胞壁的合成和完整性可以有效應對氧化和氮化應激反應,對真菌的生存至關重要.Kojima 等17發現吡咯類抗真菌藥物引起野生株細胞腫脹、染色質分裂異常,而Hog1 突變株無變化,提示Hog 基因在激活狀態下可能會導致細胞形態異常.鈣調蛋白突變株對吡咯類抗真菌藥物敏感,且吡咯類抗真菌藥物和鈣調蛋白抑制劑FK506 可以協同抑制新生隱球菌生長,提示Mpk1 和鈣調蛋白可能協同調節新生隱球菌細胞壁完整性從而影響其藥物敏感性.故hog1 是否亦參與了Pkc1 對這些應激的反應值得進一步研究證

12、明.另外磷脂酶C 也可活化PKC /MAPK 信號級聯,磷脂酶C 亦介導肌醇-1,4,5-三磷酸鹽的生成,后者作為第二信使在Ca2 + 途徑中起作用發揮對細胞壁完整性的調節.而磷脂酶C 突變株在調節黑素生成、37下生長等致病因子方面存在缺陷.2. 2 HOG-MAPK 通路HOG-MAPK 通路是酵母菌在高滲壓力環境中生存所必須的.真菌生長環境的滲透壓變化形式多樣,在高濃度糖條件下成熟繁殖為其特征.由于酵母菌是非運動性的,不能逃離有害的環境,它們必須要通過不斷調節胞內的活動來適應外部滲透壓力的升高變化,其中涉及多種途徑來提高內部滲透壓,如合成和保留兼容的等滲物質比如甘油等18,調節水分的外流,

13、調節細胞周期的變化.白念珠菌HOG-MAPK 通路至少涉及三種相對獨立的過程: 對外界壓力的反應和適應、形態轉化、細胞壁合成,該通路涉及多種組氨酸激酶,但具體作用機制不明.釀酒酵母的壓力應激反應由高滲透性甘油促分裂原蛋白激酶信號轉導途徑中的促有絲分裂原蛋白激酶Hog1 調節19,Hog1p 是其中關鍵因子.在高滲透性條件下,信號通過兩條途徑匯合,激活MAPKK ( Pbs2) ,后者轉而激活特異性Hog1.激活的Hog1 進入細胞核,調控脅迫應答相關基因的表達( 如甘油合成基因) 來應對高滲壓力,并介導該時期細胞周期的阻滯,從而增強細胞對外界不利環境的適應能力.新生隱球菌HOG 通路保留其他真

14、菌的這些特征,同時有具備自身的特點.新生隱球菌D 型菌株的HOG 通路與其他真菌類似,在正常條件下,Hog1 基因處于去磷酸化狀態.而大部分新生隱球菌株中,Hog1 基因在正常條件下處于磷酸化狀態,當出現高滲壓力時,Hog1 基因迅速去磷酸化.有趣的是,磷酸化與壓力抵抗性和毒力相關,Hog1 磷酸化越多,壓力抵抗性越高12-13, 20-21.且有研究發現新生隱球菌血清A 型菌株H99 對滲透反應的抵抗力高于血清D 型菌株JEC2122.Bahn 等21發現Pbs2 在Hog1 的磷酸化中發揮重要作用.Hog1的磷酸化高度依賴于Pbs2,因為Pbs2 缺陷株和Hog1缺陷株表現出了高度相似性的

15、表型.另外還發現正常條件下磷酸化的Hog1 基因可能參與負性調解毒力因子如莢膜和黑素的生成、性分化,這可能是通過與cAMP 信號通路和信息素轉導通路的交叉作用來調解的,例如與野生菌株相比,hog1突變株和pbs2 突變株的毒力降低.由于兩種突變菌株的莢膜合成和黑素產生升高,但是卻表現出毒力的減弱,推測在毒力升高的作用上,菌株對壓力應激能力及敏感性的增高能夠抵消一些莢膜、黑素合成增加所造成的毒力變化.但是正常條件下去磷酸化Hog1 基因的新生隱球菌菌株如JEC21 卻沒有這種表現.雙組分信號轉導模式已經引起了醫學真菌界的重視23,此模式構成釀酒酵母HOG 信號級聯的上游途徑.雖然關于新生隱球菌H

16、OG 信號途徑上游部分的具體結構還不明確,其中可能包括七種感受因子激酶,Tco1-Tco7 ( two-components-like proteins),Ypd1 和反應調節因子Ssk1 和Skn713.Ssk1 是主要的的上游信號調節因子.Skn7 主要參與高鹽和氧化應激反應、黑素生成和毒力的調節24.在血清型D 菌株的研究中,Skn7 可能通過抵抗溶酶體殺傷而協助菌體在溶酶體內生存25.在上述七種Tco 蛋白中,Tco1 和Tco2 在磷酸化傳遞系統中扮演最重要作用,兩者在對抗真菌藥物吡咯類的敏感性方面有同樣作用13.并且還發現,Tco1 參與黑素合成及毒力如性分化的調節,而Tco2 在

17、保護細胞壁免遭受氧化應激中發揮部分作用.因此推測雙組分信號轉導模式調節壓力反應、藥物敏感性、有性繁殖和毒力變化.2. 3 Ste12 轉錄因子通路Ste12 主要參與調節酵母菌信息素信號轉導通路,在釀酒酵母和白念珠菌中調節其交配、絲化  和毒力.Ste12 基因編碼Ste12 蛋白,后者在釀酒酵母菌MAPK 通路參與調節交配過程.在白念珠菌中,該蛋白通路涉及形態轉換和絲化過程,在白念珠菌侵襲性擴散中發揮重要作用.類似Ste12 基因同樣存在在隱球菌中,調控MAPK 交配通路.Ste12 基因存在于交配基因位點內,包括Ste12 和Ste12a 兩型,分別特異存在于 細胞和a 細胞中.

18、Ste12 基因參與交配和菌絲生長過程,但并不發揮關鍵作用26-27,可控制已知相關毒力基因如莢膜和黑素相關基因的表達26,28-29,而Ste12 株一般比Ste12a 株毒力更強30.Davidson及其他一些學者發現新生隱球菌MAPK 交配通路的上游成分并不調控毒力變化,Ste12 或者Ste12a 的缺失可導致交配頻率降低26,29.另有研究發現,在血清A 型菌株中Ste12 的缺失未表現出毒力的變化,而在血清D 型中卻表現為毒力的減弱29,31.但是在格特隱球菌中,敲除同樣的基因卻可導致嚴重的毒力下降32.可知,Ste12參與菌株毒力的調控,但卻不是交配通路調節中所必須的,而且存在菌株間差異.Davidson 等27發現,通過交換彼此相反交配型菌株的基因,Ste12 和Ste12a 可以互補彼此功能.但是,在菌絲的形成中,Ste12a 在Ste12 突變菌株中的表達比Ste12 在Ste12a 突變菌株中的表達更有效,表明Ste12 基因在單倍子實體的作用可能受到其他基因等因素影響.在同一研究中發現,Ste12 和Ste12a 調控感染老鼠腦脊液涂片中