1、4號黑體,3倍行距血管內皮祖細胞對共同植入缺血再灌注模型大鼠腦內的神經干細胞增殖、編號 200909194 刊用形式 論著 凋亡和血管形成的調節小五號宋體五號楷體富奇志1，齊志國1,朱曉峰2,謝 鵬3 (400016 重慶，重慶醫科大學：第一附屬醫院神經內科1，神經科學中心3；154002 黑龍江 佳木斯，佳木斯大學神經科學中心2)小五號黑體小五號小標宋小五號縮進左右各2個字符提要 目的 研究血管內皮祖細胞（endothelial progenitor cells, EPCs）與神經干細胞（neuron stem cells, NSCs）構建的復合移植體對移植入缺血再灌注模型大鼠缺血半暗帶的神

2、經干細胞增殖、凋亡和血管重建的影響。方法 線栓法建大鼠腦缺血再灌注模型；血管內皮祖細胞、層粘連蛋白和神經干細胞構建的移植復合體移入模型鼠腦缺血半暗帶；免疫組化觀察Brdu標記的移入腦內神經干細胞和缺血半暗帶血管新生，免疫熒光雙標觀察神經干細胞的凋亡情況。結果 移植后各時間點Brdu標記的神經干細胞數NSCs+EPCs組明顯高于NSCs組（P<0.05）；NSCs+EPCs組在各時間點的凋亡率明顯低于NSCs組（P<0.05）；各時間點NSCs+EPCs組血管新生數量明顯多于EPCs組、缺血對照組和NSCs組（P<0.05）。結論 血管內皮祖細胞可以促進移植入缺血再灌注模型大鼠

3、缺血半暗帶的神經干細胞增殖，減少其凋亡；2種細胞共移植可以促進缺血半暗帶的血管新生。小五號黑體關鍵詞 神經干細胞；毛細血管內皮祖細胞；缺血再灌注中圖法分類號 R322.81;R329.28;R743.31 文獻標識碼 A4號加黑，單倍行距五號Endothelial progenitor cells combined implantation improves proliferation and suppresses apoptosis of neural stem cells and angiogenesis of MCAO/R rats 小五號Fu Qizhi1, Qi Zhiguo1, Z

4、hu Xiaofeng2, Xie Peng3 (1Department of Neurology, First Affiliated Hospital, 3Neuroscience Center, Chongqing Medical University, Chongqing, 400016; 2Neuroscience Center, Jiamusi University, Jiamusi, Heilongjiang Province, 154002, China)Tahoma字體以小五號縮進左右各2個字符英文提要內容5號字體加粗Abstract Objective To investig

5、ate the effect of endothelial progenitor cells (EPCs) which complexed with neuron stem cells (NSCs) after transplanted into ischemia and reperfusion (I/R) rat model on the proliferation and apoptosis of the NSCs and vasal construction. Methods Totally 150 SD adult male rats were randomly and equally

6、 divided into 5 groups, sham operation group, I/R group, I/R+NSCs group, I/R+EPCs group, and I/R+NSCs+EPCs group. The rats were further divided into 5 subgroups according to the time points of 3, 7, 14, 30 and 60 d after transplantation. I/R rat model was established by reversiblyligating middle cer

7、ebral artery occlusion. NSCs were derived from the hippocampus of SD rats born in 24 h and identified with Nestin staining. EPCs were obtained from the artery blood of SD rats and verified with immunocytochemical stainings of CD31, CD34 and KDR after culture. The complex of NSCs and EPCs was produce

8、d with aid of laminin. Then the complex were transplanted into the ischemia penumbra of corresponding model rat brain. The proliferation and apoptosis of NSCs, and the fomation of new vessels were observed through immunohistochemistry and double-labeled immunofluorescence staining. Results The proli

9、feration of NSCs was increased, apoptosis cells were decreased and the new vessels were raised in the complex transplantation when compared with single NSCs or EPCs transplantation groups. Conclusion The complex of NSCs and EPCs transplantation improves the proliferation of NSCs, suppresses cell apo

10、ptosis and promotes the formation of new vessels.加粗Key words neural stem cells; endothelial progenitor cells; ischemic and reperfusion小六號Supported by the National Basic Research Program (973 Program, 2009CB008300). Corresponding author: Xie Peng, Tel: 86-23-68485490, E-mail: xiepeng58_小六號,宋體基金項目 國家重

11、點基礎研究發展計劃（973計劃，2009CB008300）小六號黑號通信作者 謝 鵬，電話：(023)68485490，E-mail: xiepeng58前言五號宋體缺血性腦血管病是人類腦血管疾病中高致死致殘率的疾病之一。缺血性腦血管病包括兩大病理損害，即神經元的缺損和局部血循環結構的破壞。近年來，神經再生和神經干細胞(neural stem cells，NSCs)的發現為干細胞移植療法修復腦梗死病灶提供了依據1。但NSCs移植后成活率和神經元轉化率低嚴重制約了NSCs移植在臨床上的應用2。1997年，血管內皮祖細胞(endothelial progenitor cells, EPCs)分離培

12、養成功，并發現可以移植EPCs可以促進血管重建。研究發現，成人海馬與脈管系統相連的稠密叢中存在正在分裂的細胞，表明神經再生的發生在血管生成的環境中，腦內血管再生和神經再生有緊密聯系。本實驗研究血管內皮祖細胞和神經干細胞中間填充神經間黏附因子形成微細胞團移入缺血再灌注大鼠缺血半暗帶，觀察神經干細胞的增殖和凋亡情況及缺血半暗區血管形成情況，為二者聯合移植治療缺血性腦血管病提供實驗依據。五號黑體,2倍行距五號楷體,1.5倍行距1 材料與方法1.1 主要試劑和儀器正文分兩欄成年雄性SD大鼠150只，實驗動物包括兩組第一組新生24 h內SD大鼠60只和雄性SD大鼠20只（用于NSCs、EPCs原代細胞培

13、養）成年雄性SD大鼠培養，以上動物均（由重慶醫科大學實驗動物中心提供，符合國家級動物標準)，后者體質量250350 g，隨機分為假手術組、缺血對照組、缺血后神經干細胞移植組（NSCs組）、缺血后血管內皮祖細胞移植組（EPCs組）、缺血神經干細胞加血管內皮祖細胞移植組（NSCs+EPCs組），各組又根椐移植后不同時間點分為3、7、14、30、60 d 5個亞組，每個時間點6只。1.2 藥品及試劑M-199培養基、胎牛血清、纖維連接蛋白（FN）、VEGF、bFGF、兔抗大鼠CD31單克隆抗體、兔抗大鼠CD34單克隆抗體、兔抗大鼠KDR單克隆抗體、羊抗兔(二抗)免疫組化染色試劑盒、濃縮型DAB試劑盒

14、(以上購自美國Sigma公司)；5溴脫氧尿苷（BrdU）、小鼠抗巢蛋白（Nestin）單克隆抗體、表皮生長因子（EGF）、兔抗大鼠VEGF單克隆抗體、小鼠抗大鼠caspase IgG、小鼠抗大鼠Brdu IgG單克隆抗體、抗小鼠免疫組化試劑盒（購自晶美生物工程公司）；層粘連蛋白（LN）（購自美國Invitrogen公司）；DMEM/F12干粉培養基(購自美國Gibico BRL公司)、SABCCY3試劑盒、B27(購自美國 Boster公司)。1.3 大鼠神經干細胞的培養及鑒定在無菌條件，取新生24 h內SD大鼠的海馬組織，剪碎后反復吹打，200目細胞篩網過濾后，離心5 min，棄上清，加入完

15、全神經干細胞培養液（DMEM/F12，2B27，20 g/L, EGF）1 ml，用吸管輕輕吹打成細胞懸液，調整細胞密度為 5×108/L，加入25 cm培養瓶中，放入適量完全培養液，在37 、體積分數為0.05的CO2條件靜置培養7 d，每隔2天換液1次，7 d后傳代，傳3代后備用。采用免疫組織化學法Nestin染色鑒定神經干細胞。1.4 EPCs的體外分離、培養和鑒定 參照Wang等3方法，抽取SD大鼠動脈血1015 ml，室溫下400 r/min離心30 min，吸出第2層的單核細胞層，然后用PBS清洗，細胞吹打成懸液后計數，將單核細胞以(13)×105的密度，分別接

16、種于鋪有FN的塑料培養皿中，加入培養液，放入37 ，5%CO2，濕度100%細胞培養箱，每4天換液1次。對培養的第4、7、10、14天的細胞，用甲醇固定2次，每次20 min，胎牛血清工作液封閉非特異性抗原30 min，分別加入鼠抗人CD31、CD34及兔抗人KDR單克隆抗體（150），37 孵育2 h，滴加生物素標記二抗，37 孵育20 min，滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，DAB顯色。封片后上鏡觀察。1.5 EPCs和NSCs共移植復合體構建 將傳代的EPCs用2.5 g/L胰酶消化20 min，輕輕吹打成單細胞，以3×107/L的密度接種在培養瓶中，12 h貼壁后吸出EPCs

17、培養液，涂以一層細胞外基質（層粘連蛋白）后接種經1.25 g/L胰酶消化20 min后吹打成單細胞的NSCs（以Brdu標記），密度為6×108/L，加入NSCs完全培養液。培養36 h，經鏡下觀察NSCs完全貼壁后吸出培養液，涂以一薄層細胞外基質，再接種以上相同密度的EPCs，加入神經干細胞完全培養液。70 ml培養瓶分別接種兩種細胞4 ml，共培養1224 h，鏡下觀察最后接種的EPCs貼壁，并由消化后的圓形變為橢圓或不規形。用細胞刮刀將細胞從瓶壁上依次刮起，適力吹打成13個EPCs與518個NSCs相互包繞的細胞團，用150目細胞篩網過濾，取濾液再用500目細胞篩網過濾，取篩網

18、上細胞團即為共移植復合體。然后用免疫熒光方法進行鑒定。1.6 大腦中動脈缺血/再灌注動物模型的制備 除假手術組外，各組均采用Longa等4線栓法建立局灶性腦缺血再灌注動物模型。手術結束麻醉清醒后，神經缺損評分標準觀察大鼠神經癥狀，選擇行走時身體向偏癱側轉圈作為移植對象。假手術組只麻醉，頸部皮膚切口，即縫合、不作其他處理。1.7 EPCs、NSCs及共移植復合體的移植 體溶解于磷酸鹽緩沖液中，細胞濃度調整為2×1010/L。EPCs組、NSCs組和NSCs+EPCs組分別移植3種細胞懸液10 l在立體定位儀下，經微量注射器進行移植，移植速度為0.5 l/min，在缺血側缺血半暗帶區(前

19、囟后0.5 mm，矢狀縫右旁開3.5 mm)，垂直進針，在進針5.0 min后緩慢推入細胞懸液，留針10 min后緩慢拔針。1.8 神經干細胞增殖和凋亡的檢測 Brdu陽性細胞免疫組化檢測：切片常規脫蠟至水，微波修復，加入小鼠抗大鼠Brdu一抗（1100）4 過夜，PBS沖洗；生物素化山羊抗小鼠IgG 25 孵育，PBS沖洗，DAB顯色，復染，鏡下計數Brdu陽性細胞數。免疫熒光雙標染色：石蠟切片，按常規下行入水，加Brdu （1100）抗體與Caspase3（1200）的組合抗體，4 過夜，以含0.1% Triton X-100的PBS沖洗3次，加入CY3和FITC的二抗（CY3標記Brdu

20、，FITC標記Caspase-3），37 孵育45 min， 0.05 mol碳酸緩沖液甘油封固。熒光顯微鏡下拍照，計數陽性細胞數。顯微鏡高倍視野(×400)下，在缺血側皮質隨機選取5個不重復視野統計陽性細胞的平均數。凋亡率=NSCs雙陽性熒光細胞/Brdu陽性熒光細胞×100%1.10 統計學分析 采用SPSS 10.0軟件進行統計處理，數據以±s表示，組間比較行方差分析及q檢驗。2 結果2.1 EPCs、NSCs和共移植復合體鏡下所見及鑒定結果 海馬NSCs原代分離后在12 h內單NSC相互聚集成云霧狀，4 d時即可見大量細胞球，由幾十個到上百個懸浮生長的圓球

21、形細胞組成，相差鏡下該細胞球立體感強，周邊光滑，但球中央可見細胞碎片摻雜。經傳代后雜質減少以至消失，克隆后經Nestin免疫熒光鑒定，陽性細胞球呈細胞。新鮮分離的外周血單核細胞呈圓形，體積小浮在培養液中。34 d可見細胞開始增大貼壁，細胞數增加，細胞呈梭形；710 d出現多個細胞團并呈典型線樣排列。培養第4、7、10天時EPCs CD31、CD34及KDR免疫組化染色細胞呈陽性，1014 d細胞免疫熒光染色CD31、CD34及KDR表達在95%以上。顯微鏡下可見共移植體細胞團不規則，NSCs被EPCs包繞或相互粘貼，平均每個共移植體復合細胞數815個，其中EPCs平均2.8個。免疫熒光可見紅色

22、EPCs包被綠色NSCs，或相互粘貼（圖1）。一般單張照片高為5 cm，兩張排單欄，多張圖片,看版而排（可排通欄）圖表題目文字字體, 六號,中文黑體圖1免疫熒光觀察神經干細胞和血管內皮組細胞構建的共移植復合體 （熒光顯微鏡 ×200）2.2 NSCs增殖情況假手術組、缺血對照組和EPCs組各時間點未見Brdu陽性細胞；NSCs組和NSCs+EPCs組3、7 d Brdu陽性細胞主要集中在針跡部位；14 d Brdu陽性細胞數最多，散在分布，部分與周圍組織整合；30、60 d陽性細胞數有所下降，細胞與周圍組織充分整合；各時間點Brdu陽性細胞數NSCs+EPCs組明顯高于NSCs組（P

23、<0.05）（表1、圖2）。表1 NSCs組和NSCs+EPCs組移植后不同時間點神經干細胞的增殖數比較 （個，n=6，±s）組別表格內容：一般為三線表小六號，宋體3 d7 d14 d30 d60 dNSCs組20.96±3.5828.74±3.2539.28±5.5222.65±3.7810.25±2.63NSCs+EPCs組38.64±4.33b45.38±4.97a圖表注釋：六號，楷體58.32±6.04a30.56±5.42a19.35±1.68ba：P<0.05，

24、 b：P<0.01，與NSCs組比較3 討論討論：5 號宋體神經干細胞的移植在缺血性腦血管疾病治療中的作用已經明確，但植入缺血區的神經干細胞分發生依賴于bax基因啟動的凋亡和“失巢”凋亡。其原因單純將神經干細胞植入缺血半暗區，神經干細胞不具備足夠的神經因子分泌能力使細胞營養供應不足和細胞間微信號調節中斷而引發了相關基因表達。這使神經干細胞在缺血性腦血管疾病的應用受到限制的主要因素。Asahara等5首次從人外周血中分離EPCs，并可分化為成熟內皮細胞的特殊血細胞，具有歸巢能力、分泌功能和參與出生后血管再生等特性。Rehman等6研究發現EPCs能夠分泌多種細胞因子，如血管內皮生長因子、粒

25、細胞克隆刺激因子、粒巨細胞克隆刺激因子等。其分化成熟后也可以分泌一些可溶性細胞因子，如胰島素樣生長因子（insulinlike gowth factor 1，IGF-1）、白細胞干擾素、血小板衍生生長因子、轉化生長因子、粒細胞克隆刺激因子等7。在EPCs及其分化成熟細胞分泌的一些因子中，如胰島素樣生長因子、血管內皮生長因子等能促進神經干細胞的增殖抑制其凋亡8,9。層黏連蛋白是一種神經細胞外基質，其對神經干細胞有保護作用減少其凋亡，還模擬類神經生長因子的營養神經的作用，促進神經干細胞增殖，并通過模擬體內環境解決失巢凋亡的發生10。本實驗結果顯示，在早期將EPCs、層粘連蛋白和NSCs復合體移入大

26、鼠缺血半暗帶后，神經干細胞增殖較單純神經干細胞移植增多且凋亡減少，這與EPCs的旁分泌和其與層黏連蛋白共同構成神經干細胞生存的微環境有關。后期由于移入的內皮祖細胞加快了腦缺血區血管重建的發生，進一步改善了移入腦內神經干細胞的生存條件。本實驗也發現在復合體移植1個月后腦缺血半暗區仍有移入的神經干細胞增生，且凋亡細胞明顯少于單純神經干細胞移植組。血管新生和神經再生是通過相同的因子進行調控協同和信號的相互聯系，這些因子主要括包括堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growthfactor，bFGF)、血管內皮生長因子、IGF-1和轉化生長因子Q等，內皮細胞分泌的已知可作用于神經

27、元的有絲分裂原和分化存活的因子有bFGF、IGF-l、血管內皮生長因子、血小板源性生長因子和腦源性生長因子(brainderived neurotrophicf-actor，BDNF)。在血管新生中產生的神經因子對神經干細胞保護作用的同時，神經干細胞分泌的因子如BDNF、膠質源性生長因子和神經因子等11,12，也可以促進新生血管的形成。本實驗發現EPCs、層黏連蛋白和神經干細胞復合體移入缺血半暗帶后血管新生的度明顯高于單純EPCs移植。這也說明血管新生和神經發生具有協同作用。6號宋體段落：懸進縮進（與首行文字對齊）參考文獻：1Taupin P. Strokeinduced neurogenes

28、is: physiopathology and mechanismsJCurr Neurovasc Res, 2006, 3(1): 67-722Toda H, Takahashi J, Iwakami N, et al. Grafting neural stem cells improved the impaired spatial recognition in ischemic ratsJ. Neurosci Lett, 2001, 316(1): 9-123王肅生, 冀航, 梁剛, 等. 鼠外周血內皮祖細胞體外培養鑒定與誘導分化J. 中國美容整形外科雜志, 2007, 3(18): 23

29、7-239.4Longa E Z, Weinstein P R, Carilson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in ratsJ. Stroke, 1989, 20(1): 84-91.5Asahara T, Masuda H, et al. Bone marrow qrigin of endothelial progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and patho

30、logical neovascularizationJ. Circ Res, 1999, 85: 221-228.6Rehman J, Li J, Orschell C M, et alPeripheral blood “endothelial progenitor cells” are derived from monocyte/macrophages and secrete angiogenic growth factorsJ. Circulation, 2003, 107(8)： 1164-1169. 7Kucknoor A S, Mundodi V, Alderete J FThe proteins secreted by Trichomon