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文檔簡介

1、雙鏈雙鏈DNADNA：一般制備一般制備DNADNA質粒質粒 的方法均可的方法均可單鏈單鏈DNADNA：通過通過M13M13噬菌體或噬菌體或 噬菌粒來制備噬菌粒來制備例子例子：將：將NCBINCBI數據庫中的數據庫中的MADSMADS基因編碼蛋白質基因編碼蛋白質的的“KKACSDSSA”KKACSDSSA”中的中的C C（CysCys）定點突變為）定點突變為A A（ArgArg）。）。 5端或端或3端區產生突變端區產生突變直接直接PCR 中心區突變中心區突變重疊延伸（重疊延伸（overlap extension） 新概念新概念：Gene SOEing:即通過重疊延伸進行剪接即通過重疊延伸進行剪接

2、（splicing by overlap extension）,也就是說通過重組延也就是說通過重組延伸方法將不同的基因進行剪接和組合在一起伸方法將不同的基因進行剪接和組合在一起。DNADNA片片段段的的剪剪切切n1990年年Saccharomydes cerevisiae發現在腺苷三磷酸核發現在腺苷三磷酸核苷酸酶中蛋白質會發生自我剪苷酸酶中蛋白質會發生自我剪接（接（protein splicing），從而），從而首次發現第一個蛋白質內含首次發現第一個蛋白質內含子子Sce VMA n蛋白質內含子蛋白質內含子(intein)是蛋白是蛋白質中的一段多肽鏈質中的一段多肽鏈, 它靠自我剪它靠自我剪切的方

3、式從前體蛋白中分離出切的方式從前體蛋白中分離出來來, 而兩端的外顯子以肽鍵的方而兩端的外顯子以肽鍵的方式相連式相連 RNARNA聚合酶結合位點聚合酶結合位點RNARNA聚合酶識別位點聚合酶識別位點 減少不必需的轉錄通減少不必需的轉錄通過復制起始位點，其作用過復制起始位點，其作用可以幫助穩定可以幫助穩定mRNA，增，增加加mRNA的半衰期的半衰期 保證目保證目標基因完標基因完全被轉錄全被轉錄mRNAmRNA轉錄速率越高轉錄速率越高mRNAmRNA降解速率越低降解速率越低高高核糖體結合位點（核糖體結合位點（SDSD序列）序列）SDSD序列與起始密碼之間的距離序列與起始密碼之間的距離起始密碼上游區的序列起始密碼上游區的序列SDSD序列與可翻譯序列序列與可翻譯序列55端形成的二級結端形成的二級結構構遺傳密碼的使用（高頻或低遺傳密碼的使用（高頻或低頻）等頻）等多加入終止密碼子（串聯終多加入終止密碼子（串聯終止子）止子）錯誤氨基酸的攙入錯誤氨基酸的攙入 M13 M13噬菌體是一種單鏈噬菌體是一種單鏈DNADNA噬菌體，但它在感染宿主（大噬菌體，但它在感染宿主（大腸桿菌）后，在菌體細胞內復腸桿菌）后，在菌體細胞內復制成為雙鏈并

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