1、文章編號100723949(200120520405204實驗研究抗人CD154單克隆抗體的構建及免疫學特性分析張春艷1,張志方2,寧波1,李樹濃3,朱兆玲1(中山醫科大學1.免疫學教研室,2.生理學教研室,3.病理生理學教研室,廣州510089主題詞人C D154;單克隆抗體;T 淋巴細胞;動脈粥樣硬化摘要為進一步研究人C D154單克隆抗體在抑制動脈粥樣硬化發生和發展中的作用,采用重組人C D154分子免疫BA LB c 小鼠,用雜交瘤技術制備抗人C D154單克隆抗體,并分析其免疫學特性。結果發現,(1有6c5、1b6、5d3共三株雜交瘤細胞株的培養上清與G ST 2hC D154融合蛋

2、白反應,與G ST 不反應。6c5、1b6和5d3培養上清效價分別為1128、1256和164。(2經Western 2bolt 鑒定,在分子質量為56kDa 處有一抗原抗體結合的條帶,而分子質量為26kDa 處無特異性條帶。證明三株雜交瘤細胞株所分泌的單克隆抗體可以結合G ST 2hC D154但不與G ST 反應,是特異性結合人C D154的單克隆抗體。(3流式細胞術發現,6c5細胞株分泌的單克隆抗體能與激活的人外周血T 細胞結合。說明已構建的單克隆抗體是特異性針對人C D154的,為下一步用人C D154單克隆抗體抑制動脈粥樣硬化的研究打下了基礎。中圖分類號R392.11文獻標識碼APr

3、eparation of Anti 2hCD 154Monoclonal Antibody and Analysis of its Immunological PropertiesZH ANG Chun 2Y an 1,ZH ANG Zhi 2Fang 2,NI NG Bo 1,LI Shu 2Nong 3,and ZH U Zhao 2Ling1(1.Department o f Immunology ,2.Department o f Physiology ,3.Department o f Pathophysiology ,Sun Yat 2sen University o f Medi

4、cal Sciences ,Guan 2gzhou 510089,China MeSH Human C D154;M onoclonal Antibody ;T Cell ;AtherosclerosisABSTRACT Aim T o Prepare anti 2hC D154m onoclonal antibody and analysis its immunological properties.Methods The G ST 2hC D154fusion protein was used as antigen to immunize BA LB c m ouse.B cell was

5、 fused with myeloma cell SP20to produce hybridoma cell line that can secrete anti 2hC D154antibody.The hybridoma cells were identified by using E LIS A ,Western 2blot and FACS method.R esults (1E LIS A result dem onstrated that culture supernatants of three hybridoma cells (6c5,1b6,and5c3can react w

6、ith G ST 2hC D154,but not react with G ST.(2Western 2blot show that three m onoclonal antibodies could bound to a protein band with m olecular weight of 56kDa (G ST 2hC D154,but could not bound to a protein band with m olecular weight of 26kDa (G ST .(3FACS show that McAb 6c5can bound to peripheral

7、blood T cell activated.Conclusion 6c5cell is a specific McAb against human C D154m olecules expressed on actived human T cells.Preparation of anti 2hC D154m onoclonal an 2tibody be used to study the inhibitory function of atherosclerosis progression.作者簡介張春艷,女,1966年5月出生,河南省平頂山市人,博士,講師。張志方,男,1964年10月出

8、生,河南省平頂山市人,博士,副教授,教研室副主任。李樹濃,男,1937年10月出生,廣東省惠陽市人,教授,博士研究生導師。C D154是一種主要存在于激活的T 淋巴細胞表面的II 型跨膜糖蛋白,由261個氨基酸組成,分子質量為3039kDa ,它是腫瘤壞死因子(tum or necrosis factor ,T NF 超家族成員,是C D40的配體。C D402C D154之間相互作用,是誘發體液免疫和細胞免疫的重要信號傳導途徑123,其表達異常與諸如動脈粥樣硬化等炎癥反應密切相關。文獻426報道,在鼠和人動脈粥樣硬化損傷部位聚集有大量的C D154+T 細胞,病灶部位的血管內皮細胞、平滑肌細

9、胞、巨噬細胞和T 細胞均能表達C D40和C D154。而且,患有偶發性心絞痛的病人血漿中C D154水平高于正常人;在喂食高膽固醇飼料的實驗性低密度脂蛋白LD L 受體基因缺陷模型鼠中,用抗C D154單克隆抗體阻斷C D402C D154信號傳導途徑,可使動脈粥樣硬化病灶縮小,巨噬細胞和T 淋巴細胞數量減少,粘附分子的表達受到抑制729。為此,本文研制抗人C D154單克隆抗體,并分析其免疫學特性,為下一步抗人C D154單克隆抗體抑制動脈粥樣硬化的發生發展的實驗研究奠定基礎。1材料與方法1.1動物及細胞系昆明鼠,雌性,68周齡,購自中山醫科大學實驗動物中心;BA LBc純系鼠,雌性,67

10、周齡,購自中山醫科大學實驗動物中心;鼠骨髓瘤細胞SP20,購自中國科學院上海細胞生物研究所。1.2主要試劑RPMI21640細胞培養基、完全福氏佐劑和不完全福氏佐劑購自GI BC O公司;熒光(FITC標記的兔抗鼠IgG購自DAK O公司;PM A、I onomycin、H AT、HT、PEG、辣根過氧化物酶(HRP標記的羊抗鼠IgG 等購自Sigma公司;其它常規化學試劑,購自Sigma 公司或國產分析純試劑。1.3免疫動物將G ST2hC D154融合蛋白0.5m L(2gL作為抗原與等量的完全福氏佐劑混合乳化,直到成為油包水的狀態,取5只67周齡的雌性健康BA LBc小鼠同時用G ST2

11、hC D154融合蛋白進行免疫,第一次基礎免疫,每只小鼠自后足墊注射,雙后足墊共注射抗原100g,基礎免疫10天后,觸摸小鼠的腹股溝淋巴結,發現此處淋巴結腫大,再按上述方法用等量的抗原與不完全福氏佐劑進行加強免疫,共加強免疫3次后,采集免疫鼠尾巴血,用E LIS A檢測免疫鼠血清中產生抗體的效價,選擇產生抗體效價達到1. 024×105的BA LBc鼠作為細胞融合用的淋巴細胞的供者。細胞融合前3天,將G ST2hC D154融合蛋白100L,自腫大的腹股溝淋巴結直接注射進行加強沖擊免疫。1.4細胞融合取免疫鼠淋巴細胞和SP20細胞懸液(淋巴細胞SP20=31于50m L離心管中,按常

12、規方法進行細胞融合后,加入含H AT的RPMI21640完全培養基,分配入鋪有飼養層細胞的24孔細胞培養板,0.5 m L孔,在5%C O2、37條件下培養。1.5雜交瘤細胞的選擇性培養融合當天用H AT選擇性培養基培養,融合后每天觀察細胞生長情況,在融合后的第4天,倒置顯微鏡下可見有小的雜交瘤細胞克隆出現,以后日漸克隆長大。在融合后第7天,換用HT培養基培養,融合后的第10天,雜交瘤克隆生長至孔底15時,檢測培養上清的特異性抗體。1.6陽性克隆的篩選及克隆化用間接E LIS A法篩選陽性克隆。選擇與G ST2 hC D154融合蛋白呈陽性反應,而與G ST呈陰性反應的雜交瘤細胞作為陽性細胞克

13、隆。采用顯微操作進行克隆化培養。1.7免疫學特性分析1.7.1抗體效價的測定將雜交瘤細胞培養上清用10mm olL P BS倍比稀釋,用間接E LIS A測定其效價,同時設立陰性對照(P BS和陽性對照(免疫鼠的眼球血。1.7.2抗體特異性的鑒定采用常規間接E LIS A方法和常規免疫印跡方法。1.7.3流式細胞儀技術單標檢測單克隆抗體與激活淋巴細胞的結合從人外周血分離單個核細胞,用PM A和ionomycin激活后,用預冷的P BS洗一次,加入雜交瘤細胞培養上清100L,同時設立陰性對照(分泌無關抗體的雜交瘤細胞培養上清,4作用1h,用預冷的P BS洗3次,加入100L FIT

14、C標記的兔抗鼠IgG(11000,4作用1h,用預冷的P BS洗3次,用1%多聚甲醛固定細胞,用流式細胞儀檢測。雙標檢測單克隆抗體與激活的人T細胞的結合從人外周血分離單個核細胞,用PM A和ionomycin激活后,用預冷的P BS洗一次,加入6c5雜交瘤細胞培養上清100L,同時設立陰性對照(分泌無關抗體的雜交瘤細胞培養上清,4作用1h,用預冷的P BS洗3次,同時加入100L FITC標記的兔抗鼠IgG(11000、Cychrome T M2C D3單克隆抗體和PE2C D8單克隆抗體,4作用1h,用預冷的P BS洗3次,用1%多聚甲醛固定細胞。2結果2.1抗人C D154單

15、克隆抗體的制備雜交瘤細胞陽性克隆結果,采用顯微操作將陽性克隆連續克隆3次,得到3株分泌抗人C D154單克隆抗體的雜交瘤細胞株,分別命名為6c5、1b6和5d3。2.2雜交瘤細胞培養上清的抗體效價測定采用間接E LIS A對三株細胞分泌的抗體效價進行測定,6c5、1b6和5d3培養上清效價分別為1128、1256和164。2.3抗人C D154單克隆抗體的鑒定三株雜交瘤細胞株的培養上清均與G ST2 hC D154融合蛋白反應,與G ST不反應。分別用G ST2 hC D154融合蛋白和G ST作抗原。經Western2bolt鑒定,在分子質量為56kDa處有一抗原抗體結合的條帶,而分子質量為

16、26kDa處無特異性條帶(圖1, Figure1。證明三株雜交瘤細胞株所分泌的單克隆抗體可以結合G ST2hC D154但不與G ST反應,是特異性結合人C D154的單克隆抗體。單標檢測結果發現,6c5所分泌的單克隆抗體與激活的外周血淋巴細胞的結合率為9.7%,而對照組的結合率為1.2%,說明6c5所分泌的單克隆抗體能與激活的人外周血淋巴細胞結合(圖2,Figure2。雙標檢測發現,6c5所分泌的單克隆抗體與C D3+T淋巴細胞的結合率為4.9%,對照組的結合率為0.8%,說明6c5所分泌的單克隆抗體能與激活的T淋巴細胞結合。還發現,其與C D8+T淋巴細胞的結合率為0.8%,而對照組的結合

17、率為0.3%,說明6c5所分泌的單克隆抗體只與少量激活的C D8+T淋巴細胞結合(圖3,Figure3。圖1.抗體特異性的Western2blot分析Figure1.Western2blot analysis of the antibody specificity.M:protein marker;1lane:26kDa G ST expression products;223lane:56kDa G ST2hCD154expression products;4lane:incusion bodies. 圖2.抗人C D154單克隆抗體(6c5結合被激活的外周血單核細胞的流式細胞儀鑒定結果Fi

18、gure2.Identification of anti2hCD154monoclonal antibody(6c5binding to hum an peripheral blood mononuclear cell activated with PMA plus ionomycin by flow cytometry. 圖3.抗人CD154單克隆抗體(6c5結合被激活的CD8+T淋巴細胞的流式細胞儀鑒定結果Figure3.Identification of anti2hCD154monoclonal antibody(6c5binding to hum an CD8+T lymphocyt

19、e activated with PMA plus ionomycin by flow cytometry.3討論本實驗采用G ST2hC D154融合蛋白作為抗原,即增加了抗原的免疫原性,又給篩選工作帶來方便,選擇與G ST2hC D154融合蛋白反應而與G ST不反應的特異性雜交瘤細胞株,最后用激活的人外周血T淋巴細胞鑒定,得到了特異性抗人C D154分子的單克隆抗體,十分方便。目前,采用此方法研制人C D154單克隆抗體,國內外均未見報道。由于免疫效果的好壞是能否得到特異性單克隆抗體的關鍵,所以免疫方法的選擇至關重要,常用的免疫方法有腹腔注射、皮下注射、尾靜脈注射和脾內直接注射免疫等,本

20、實驗采用小鼠后足墊作為基礎免疫和加強免疫的注射部位,融合前3天采用淋巴結直接注射進行加強沖擊免疫。與常規的免疫方法相比,有以下優點:操作簡單,避免了脾內直接免疫所造成的免疫小鼠的感染和死亡;在免疫期間,可隨時通過觸摸小鼠腹股溝淋巴結腫大情況了解免疫效果,從而確定再次免疫的時間、抗原劑量和免疫次數;融合時,摘取淋巴結作為B淋巴細胞的來源,極少有紅細胞污染,無需溶解紅細胞;提高免疫鼠對抗原的反應性,從而提高了融合率和細胞克隆的陽性率。我們采用間接E LIS A法,對所獲得的3株雜交瘤細胞株進行特異性鑒定,結果發現3株細胞的培養上清液都只與G ST2hC D154融合蛋白反應,而與G ST無交叉反應

21、,說明3株細胞所分泌的抗體是特異性針對hC D154分子。為了進一步證實抗體的特異性,我們采用Western2Blot,結果發現在56kDa部位有單一抗原抗體反應條帶,而在26kDa的G ST的位置無反應條帶出現,再一次證明了抗體的特異性。為了研究所得到的抗體能否與人C D154結合,我們采用流式細胞技術,結果發現,6c5細胞分泌的單克隆抗體能與激活的T細胞上的C D154分子結合,并且大多數分布于C D3+C D82的T細胞,少部分分布于C D3+C D8+的T細胞,結果與國外報道的C D154在激活的淋巴細胞的分布特征是相符的10,證明所得到的單克隆抗體是針對人C D154特異的單克隆抗體

22、。C D154在動脈粥樣硬化的發生發展中發揮重要作用。研究表明,在人和鼠動脈粥樣硬化損傷部位的血管平滑肌細胞、血管內皮細胞、巨噬細胞和T淋巴細胞均表達C D154,在體外激活C D1542C D40信號途徑,可導致趨化因子、細胞因子、細胞間粘附因子、血管細胞間粘附因子、E2選擇素的表達,這些物質與動脈粥樣硬化損傷部位巨噬細胞的聚集、脂質團的形成有關。動脈粥樣硬化模型鼠體內實驗顯示,采用抗鼠C D154單克隆抗體阻斷C D1542C D40信號傳導途徑,可使模型鼠動脈粥樣硬化的損傷部位明顯縮小,并且可以減少動脈粥樣硬化斑塊中巨噬細胞和脂質的量,增加平滑肌細胞和膠原成分,從而增加了斑塊的穩定性,預

23、防斑塊脫落引發心肌梗塞、腦血管意外等動脈粥樣硬化并發癥11,12。本實驗構建的抗人C D154單克隆抗體,是我們系列研究的階段性結果,為下一步抗動脈粥樣硬化的免疫學治療研究打下了基礎。參考文獻1Clark LB,F oy T M,N oelle RS,et al.CD40and its ligandJ.Adv Immunol,1996,63:432782S tout R,Suttles J.The many roles of CD40CD40L interactions incell mediated in flammatory responsesJ.Immunol Today,1996, 1

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