1、.總RNA的提?。═rizol法提?。┰谑占缴锊牧现?，最好能即刻進行RNA制備工作。若需暫時儲存，則應以液氮將生物材料急速冷凍后，儲存于-80冷凍柜。在制備RNA時，將儲存于冷凍柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破細胞，不可以先行解凍，以避免RNase的作用。1. 提取組織RNA時，每50100mg組織用1ml Trizol試劑對組織進行裂解；提取細胞RNA時，先離心沉淀細胞，每5-10 106個細胞加1ml Trizol后，反復用槍吹打或劇烈振蕩以裂解細胞；2. 將上述組織或細胞的Trizol裂解液轉入EP管中,在室溫1530C下放置5分鐘；3. 在上述EP管中，按照每1ml T

2、RIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，蓋上EP管蓋子，在手中用力震蕩15秒，在室溫下（1530）放置23分鐘后，12000g（28）離心15分鐘；4. 取上層水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml異丙醇的量加入異丙醇，在室溫下（1530）放置10分鐘,12000g（28）離心10分鐘；5. 棄上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇進行洗滌，渦旋混合，7500g（28）離心5分鐘，棄上清；6. 讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥；7. 用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。 PCR實驗室常用DNA聚合酶有三種：TaKaRa TaqTM，TaKaRa

3、EXTaqTM和PyrobestTM DNA Polymerase。TaKaRa TaqTM是一般的DNA聚合酶，保真性較差，但價錢便宜，一般用于基因表達的檢測等。TaKaRa EXTaqTM是具有Proof reading活性的耐熱性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其擴增得到的PCR產物3端附有一個“A”堿基，如果希望直接將產物克隆到T-vector可以用此酶。PyrobestTM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐熱性DNA聚合酶，其特點是保真性極高，擴增得到的PCR產物為平滑末端。如果進行基因的擴增請使用此酶。1. 按下列組成在PCR反應管中調制反

4、應液：TaKaRa TaqTM或TaKaRa EXTaqTM的配方ReagentQuantity, for 50l of reaction mixture10X PCR buffer （Mg2+ free）5 lMgCl2（25mM）如TaKaRa TaqTM加3 l 如TaKaRa EXTaqTM加4 l2.5mM dNTP mix4 l 10M Primer 上游1 l10M Primer下游1 lTemplate DNA1 lTaq或EXTaqDNA Polymerase0.25 lSterile deionized waterUp to 50lTotal50 l /SamplePyro

5、bestTM DNA Polymerase的配方ReagentQuantity, for 50l of reaction mixture10X Pyrobest buffer 5l2.5mM dNTP mix4l 10M Primer上游1l10M Primer 下游1lTemplate DNA1lPyrobestTM DNA Polymerase0.25lSterile deionized waterUp to 50lTotal50l /Sample 反應總體積根據實際情況進行調控，可以做2050l以節約試劑； 將上表各成分加入到0.2ml或0.5ml滅菌的PCR薄壁管中； 如果不用PCR儀

6、的加熱蓋，在反應混合液的上層加30 50l 的礦物油防止樣品在PCR的過程中蒸發；2. 按以下程序進行PCR擴增。PCR反應條件視模板、引物等的結構條件不同而各異，在實際操作中需根據具體的情況以及PCR結果而進行優化。StepTemperature, C Time, minNumber of cyclesNote起始變性94951-3（5）1變性94950.5-225-35退火溫度比理論退火溫度大概低5C，再根據反應結果優化退火37-700.5-2延伸70-75根據擴增產物的大?。?.5）每分鐘延伸1000bp最終延伸70-75101保存4反應結束后，抽取擴增樣品5l，用瓊脂糖凝膠電泳分析擴增

7、結果，用DNA marker判斷擴增片段的大小或冷凍保存，以備以后分析使用。RT-PCRProtocol: TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV)1. 按下列組成在PCR反應管中調制反應液ReagentQuantity, for 50lof reaction mixture10One Step RNA PCR Buffer5l25 mM MgCl210l10 mM dNTP mix5lRNase Inhibitor (40 U/l)1lAMV-Optimized Taq1lAMV RTase XL (5 U/l)1l上游特異Primer (20 M)1l下游特異Pr

8、imer (20 M)1l實驗樣品RNA（1 g Total RNA）1lRNase Free dH2O24lTotal50l /Sample1. 反應總體積根據實際情況進行調控，可以做2050l以節約試劑；2. 將上表各成分加入到0.2ml或0.5ml滅菌的PCR薄壁管中；3. 如果不用PCR儀的加熱蓋，在反應混合液的上層加30 50l 的礦物油防止樣品在PCR的過程中蒸發；2 按以下條件進行反應StepTemperature, CTime, minNumber of cyclesNote逆轉錄50301逆轉錄酶失活9421變性940.525-35退火37-650.5退火溫度比理論退火溫度大

9、概低5C，再根據反應結果優化延伸72根據擴增產物的大小Taq酶每分鐘延伸1000bp最終延伸72101反應結束后，抽取擴增樣品5l，用瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結果，用DNA marker判斷擴增片段的大小或冷凍保存，以備以后分析使用。瓊脂糖核酸電泳1. 用蒸餾水將制膠模具和梳子沖洗干凈，放在制膠平板上，封閉模具邊緣，架好梳子；2. 根據欲分離DNA片段大小用凝膠緩沖液配制適宜濃度的瓊脂糖凝膠：準確稱量瓊脂糖干粉，加入到配膠用（專物專用）的三角燒瓶內，定量加入電泳緩沖液（一般2030 ml）；3. （稱重）放入到微波爐內加熱熔化（補水至原重）。冷卻片刻（瓊脂糖凝膠凝點為56左右），加入一滴熒光染料

10、，輕輕旋轉以充分混勻凝膠溶液，倒入電泳槽中，待其凝固；4. 室溫下3045分鐘后凝膠完全凝結，小心拔出梳子，將凝膠安放在電泳槽內；5. 向電泳槽中倒入電泳緩沖液，其量以沒過膠面1mm為宜，如樣品孔內有氣泡，應設法除去；6. 在DNA樣品中加入10體積的載樣緩沖液（loading buffer），混勻后（反復吹打，移液槍槍頭始終保持在液面下），用槍將樣品混合液緩慢加入被浸沒的凝膠加樣孔內（可用手扶住槍頭 ）；7. 接通電源，紅色為正極，黑色為負極，切記DNA樣品由負極往正極泳動 (靠近加樣孔的一端為負)。一般60100V電壓，電泳2040min即可；8. 根據指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳（

11、對于以分離獲取大基因片段如質粒，MARKER可適宜跑出膠外）；9. 電泳完畢，關上電源，在凝膠成像儀上觀察電泳帶及其位置，并與核酸分子量標準Marker比較被擴增產物的大小。 瓊脂糖凝膠濃度與線形DNA的最佳分辨X圍瓊脂糖凝膠濃度線形DNA的最佳分辨X圍（bp）0.5%1,00030,0000.7%80012,0001.0%50010,0001.2%4007,0001.5%2003,0002.0%502,000膠回收純化DNA（1、膠回收后跑電泳沒有條帶，最可能的原因：起始上樣量不足（我們一般至少要100ulPCR產物）；膠回收試劑盒存在質量問題，等等。2、膠回收沒有條帶，可能產物濃度較低，這

12、種情況下進行連接轉化，是可以得到陽性菌落的。但是，你要自己能保證前期試驗沒有任何問題。3、TAKARA有個核酸共沉劑，如果PCR只有單一條帶，可以用它進行純化，回收率很高。）1. 瓊脂糖電泳，將特異電泳帶用刀切下放入到EP管中，稱瓊脂糖帶的重量；2. 按照每100mg加400l的量加入binding buffer，放入到EP管振蕩器中，4555溫育振蕩，直到所有的瓊脂糖都溶解（大概要5分鐘）；3. 取出純化柱，將上述溶解液轉移至柱中，室溫下放置2分鐘，8,000rpm 離心1分鐘，棄EP管中的液體，將純化柱放回EP管中；4. 加500l的wash buffer至柱中，8,000rpm 離心1分

13、鐘。棄管中的溶液；5. 重復操作4步的操作1次，最后將純化柱放入EP管中10,000rpm離心30秒，除去痕量的wash buffer；6. 將純化柱放入一個新的EP管。加3040l H2O或者elution buffer至純化柱膜的中央，在37或50下放置2分鐘，10,000rpm離心1分鐘洗脫DNA，將EP管中的DNA溶液放在-20保存。7. 注：若想要不電泳而直接純化DNA溶液，只需要在第2步中按100l液量加400l的binding buffer,其余的步驟不變。大腸桿菌質粒DNA的提?。▔A裂解法）此方法適用于小量質粒DNA的提?。ㄔ谔崛⊥寥乐形⑸锘蚪M時，考慮到大片段，采用蛋白酶K

14、與20%SDS裂解菌體）提取的質粒DNA可直接用于酶切PCR擴增。1. 取1.5ml細菌培養物于EP管中，4000rpm離心1分鐘，棄上清液，使細菌沉淀盡量干燥（再次離心，完全去除培養基上清）；2. 將細菌沉淀重懸于用冰預冷的100 l溶液I (50 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA pH 8.0，25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0) 中，劇烈振蕩（這一步至關重要，確保菌體重懸）；3. 加入200 l新配制的溶液II(0.2 mol/L NaOH，1SDS（m/v）)，蓋緊EP管口，快速顛倒離心管5次，以混合混合物，確保離心管的整個內表面與溶液II接觸，不要渦旋

15、（強調柔和，靜置2min為佳），置于冰浴中；4. 加入150 l預冷溶液III(每100 ml 的溶液III中含60 ml 5 mol/L 乙酸鉀，11.5 ml冰乙酸，28.5 ml H2O)，蓋緊EP管口，反復顛倒數次（時間短，不劇烈震蕩，當基因組片段大小斷裂為50100bp時，無法PDS共沉淀），使溶液III在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上35分鐘；5. 在最大轉速（12000g）下離心5min，取上清液（轉移時懸空滴加可以有效防止槍頭上的雜質進入）于另一新EP管（勿貪多，取到白色絮狀雜質沉淀）；6. 用兩倍體積的乙醇室溫沉淀雙鏈DNA，振蕩混合（就不怕斷鏈.）于室溫放置2

16、分鐘，最大轉速（12000g）離心5分鐘（本實驗分兩次）；7. 小心吸去上清液，將離心管倒置于濾紙上，以使所有液體都流出，在將附于管壁的液滴除盡；8. 加1ml 70乙醇洗滌沉淀，振蕩混合，用12,000g離心2分鐘，棄上清，將開口的EP管置于室溫使乙醇揮發，直至EP管中內沒有可見的液體存在（510分鐘），用適量的ddH2O溶解；9. 用0.5l的RNase 37溫育510分鐘（30min）；10. 電泳鑒定。（1. A260/A2801.8表示DNA/RNA的純度高。若數值18-20kDa 18-20kDa動物 抗原量 最佳抗原量 抗原量 最佳抗原量兔子 20-200 100 50-400

17、200小鼠 2-40 15 4-60 40大鼠 10-50 30 20-150 50綿羊 100-1000 200 200-1000 400母雞 20-200 100 50-400 200單位：微克4、免疫方案（以免疫兔子為例）：天數 0 14 28 38 56 66 87注射 x x x x采血 2ml 2ml 2+20ml 2+50-70ml5、注意： 第一次免疫用完全佐劑與免疫原混合，以后加強免疫用不完全佐劑與免疫原混合，采取多點，時間間隔式免疫法。 如果用細胞免疫兔子，那么每次免疫所需細胞量為2-3 x 107 cells。 在連續免疫完三次后，需要少量取血進行ELISA檢測，檢測所免

18、疫動物的抗體滴度，一般滴度能達到1:10,000-50,000。在處死所免疫的動物前一周應加強一次免疫。 如果用小鼠免疫，可以尾靜脈小量采血（大約50l），最后取眼球大量采血（大約500-1000l）；如果用兔子免疫，可以耳緣靜脈小量取血(大約2mL)，最后心臟大量取血(50-100mL) 按血清制備的標準方法將血清分離，并且分裝成小份，儲藏在-80oC。血清制備1. 取血后，37oC下，讓血液凝固1到2小時（不加抗凝劑）；2. 4oC冰箱過夜（讓血塊固縮）；3. 當血清自然析出后， 4oC，3000轉/分，離心10分鐘，分離血清，棄去不溶物；4. 將血清移至一干凈試管，并分裝成小份，儲藏在-

19、80oC。ELISA一、包被抗原1. 用50mM的碳酸鹽包被緩沖液（pH9.6）溶解抗原，使抗原濃度為10-20 g/ml，加100 l/孔到96孔酶標板，4 oC放置過夜。2. 第二天棄去包被液后，用PBST洗滌3次，每孔加入150 l 1 BSA 37 oC封閉1小時。3. PBST洗滌3次后，每孔加入100 l不同倍比稀釋度的血清，并加入對照樣品，37 oC孵育2小時。4. PBST洗滌5次后，加入100l稀釋后的HRP標記的二抗，37 oC孵育1小時。5. PBST洗滌5次后，顯色劑顯色20 min后，酶標儀上讀取A405吸收值。二、包被細胞1. 在96孔培養板上接種細胞數為1 x 1

20、04 cells/well，37過夜培養。2. 第二天用PBS洗滌培養板2-3次。3. 加入125 l/well 10% Formalin（1:10稀釋）, 室溫下固定15 min。4. 用ddH2O洗滌培養板3次，并晾干，儲藏在2-8oC備用。5. 用PBST洗滌3次，每孔加入150 l 1 BSA 37 oC封閉1小時。6. PBST洗滌3次后，每孔加入100 l不同倍比稀釋度的血清，并加入對照樣品，37 oC孵育2小時。7. PBST洗滌5次后，加入100 l稀釋后的HRP標記的二抗,37 oC孵育1小時。8. PBST洗滌5次后，顯色劑顯色20 min后，酶標儀上讀取A405吸收值。l

21、 50mM的碳酸鹽包被緩沖液：0.05mol/L pH9.6碳酸緩沖液,4，保存,Na2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克,蒸餾水稀釋至100 ml。l ABTS作為底物進行顯色反應(10ml)： 0.2M Na2HPO4 2.4ml 0.1M 檸檬酸2.6ml ddH2O 5ml ABTS 5mg H2O2(30%) 4 ul（用前加入）注 意： 一般做倍比稀釋進行檢測，需要有相應的對照血清。 不同的顯色系統對應不同的光吸收值。血清學篩選克隆新抗原/新基因一、E.coli/ phage 裂解液預吸附血清1. 將E.coli/phage lysate以1:10-20稀釋在TBST

22、溶液中。2. 將4X82mm的nitrocellulose membranes（NC）浸入稀釋后的E.coli/ phage lysate中，室溫下水平搖動30分鐘，取出NC并使膜瀝干。3. 用50ml TBST溶液洗膜3次，每次10分鐘。4. 用濾紙輕輕吸去膜上的液體。5. 將膜放入50ml封閉液中，室溫下水平搖動最少30分鐘。6. 將膜從封閉液中取出，用50ml TBST溶液洗膜3次，每次10分鐘。7. 將血清按1:5稀釋在TBST溶液中，將一X膜放入溶液中，37下輕輕水平搖動10分鐘。8. 從血清稀釋液中取出膜并丟棄,加入另外一X新膜,37下輕水平搖10分鐘.9. 重復步驟8，直至所有4

23、X膜都處理完。10. 除去最后一X膜，收集血清（primary antibody），分裝成小份儲存于-80冰箱中待用。注意： 該步處理過程是為了去除血清中能與細菌和噬菌體裂解蛋白進行免疫反應的抗體，這樣可以減少假陽性率； 一抗不能反復凍融，化凍后不要再次冰凍，可放于4作短暫保存； 可以是病人血清，也可以是免疫血清，如果是病人血清，則需要至少10個病人血清進行混合；二、噬菌體篩選1. 準備NZY agar plates（至少用前24小時倒好），用前在37培養箱中烘烤1-2小時以去除水滴。2. 將過夜培養的XL1-blue MRF細菌2000轉/分，離心10分鐘，將細菌溶解在10mM MgSO4中

24、，調整細菌濃度為OD600=0.5。3. 融化NZY top，并將NZY top放在50水浴中。4. 將適量的XL1-blue MRF細菌溶液與一定稀釋度的phage文庫混合，37下共同作用15分鐘。 直徑90mm平板：200l XL1-blue 細菌+適量的phage文庫 直徑150mm平板：600l XL1-blue 細菌+適量的phag文庫（噬菌斑數量一般保持在3000pfu/90mm; 12000pfu/150mm）5. 將步驟4中的混合液與NZY top溶液混合（200l混合液+3-4mlNZY top溶液；600l混合液+8-10 mlNZY top溶液），倒入到NZY agar

25、plates中，室溫下放10分鐘左右，然后倒置放于37下培養。6. 當噬菌斑剛好可看到時（大約5-8小時），從培養箱中拿出平板。7. 將NC放入10mM IPTG溶液中完全浸濕，在空中使膜瀝干，并做好3個不對稱的標記。8. 將IPTG處理好的NC貼在平板上，不留氣泡，然后倒置放于37下培養。9. 過夜培養后，第二天早上取出平板，用鑷子將膜輕輕掀起，注意不要將培養基粘在膜上。10. 將膜放于50ml TBST溶液中，水平脫色搖床上震蕩洗膜3次，每次10分鐘。11. 將膜放入50ml封閉液中，水平搖動，封閉4-6小時。12. 在封閉液中加入適當滴度的一抗，水平搖動處理過夜。13. 將膜放于50ml

26、 TBST溶液中，洗膜3次，每次10分鐘。14. 在封閉液中加入適當滴度的二抗（各個公司的二抗使用滴度不同），室溫水平搖動1-2小時。15. 將膜放于50ml TBST溶液中，洗膜3次，每次10分鐘，最后用50ml TBS溶液洗膜15-20分鐘，取出膜空氣中瀝干。16. 將膜放入BCIP-NBT顯色液中避光顯色，水平搖動直到陽性斑點可見為止。17. 從顯色液中取出膜放在TBS溶液中，空氣中使膜干燥。18. 根據所做的標記,將膜與平板對齊,將平板上對應的陽性克隆區域的培養基挖出放入500l SM buffer中,并加入25 ml chloroform,4貯存（最多可貯6月）。19. 第一輪篩選得

27、到陽性克隆需要進行第二輪篩選以去除假陽性并獲得陽性單克隆噬菌體。過程如第一輪篩選，只不過用直徑90mm平板；具體過程見步驟4，這時所加入的噬菌體溶液是第一輪篩選得到的噬菌體上清（見步驟18），在用前要滴定好噬菌體的滴度，噬菌斑的數量以可區分出單個克隆，同時密度不能太稀為標準（一般100-200 pfu/90mm）。20. 按第一輪相似的過程進行實驗，最后顯色，確定真正的陽性克隆，并將陽性單克隆所在的培養基挖出放入500l SM buffer中，并加入25 ml chloroform，4貯存（最多可貯存6月）。注意： 封閉液一般可用：5%的脫脂牛奶或1%的BSA溶解在TBST溶液中。 第一輪篩選

28、用150mm的平板；第二輪篩選用 90mm的平板，一般需要篩選至少1 x 106 pfu。 認真做好三個不對稱的標記，特別在第二輪挑選陽性克隆時要仔細將膜與平板吻合好，不能挑錯。三、單克隆剪切1. 取第二輪篩選得到的陽性克隆貯存液上清。2. 將過夜培養的XL1-blue MRF細菌2000轉/分離心10分鐘，將細菌溶解在10mM MgSO4中，調整細菌溶度到OD600=1.0。3. 在一個EP管中加入：200l XL1-blue MRF細菌+250ul phage stock（步驟1）+1 ul ExAssist helper phage。4. 將以上三種樣品混合，37下共同保溫15分鐘。5.

29、 將樣品混合物加入到3 ml LB培養基中，37震蕩培養3-4小時。6. 將試管放于65-70水浴20分鐘，3000轉/分，離心15分鐘。7. 將上清轉入新的離心管中，已發生剪切的phage particles在上清中（上清可在4下儲存1-2月）。8. 將100ul phage 上清+200ul SOLR cells（OD600=1.0）混合，37保溫15分鐘。9. 取步驟8中溶液5-10 ul涂于LB-amp agar plates（amp=50ug/ml），過夜培養。10. 第二天細菌長出，隨機挑取單克隆接種到LB-amp培養基中培養過夜。11. 過夜培養細菌分為三部分：（1）提取質粒做雙

30、酶切，鑒定外源基因的大小；（2）送樣品進行DNA測序（3）加入30-40%的甘油進行保種，分裝成小份儲存于-80備用。附錄：1、SM buffer (1L):(5.8 g NaCl+2.0 g magnesium sulfate+50 ml 1M Tris (pH=7,5)+0.1 g gelatin)2、AP-buffer:(100 mM Tris HCI (pH 9.5); 100 mM NaCl; 5 mM MgCl2)3、10xTBS（1L）：（0.1 M Tris-HCl (pH 8.0)；1.5 M NaCl）4、LB Broth（1L）：（10 g NaCl+10 g of tr

31、yptone+5 g of yeast extract）ELISPOT1. PBS溶解抗原為30g/ml，加100 l/孔于PVDF膜鋪底的96孔滅菌板過夜；2. 第二天吸去包被液后，加5FCS的PRMI 1640培養基100 l封閉1小時，37 oC；3. 準備脾細胞懸液（用氯化銨去除紅細胞，制備成單個脾淋巴細胞懸液）；4. 從1 106/孔開始，按1:3的稀釋度開始逐孔稀釋做不同濃度梯度，并做3個復孔，37 oC靜置培養5小時；5. PBS洗35次，生物素化的抗鼠IgG二抗孵育30 min；6. PBS洗35次，鏈親和素標記的堿性磷酸酶孵育30 min；7. PBS洗35次，用底物BCIP/NBT顯色，顯微鏡下觀察顯色反應，顯色后及時終止反應；8. 計數每孔中的斑點數目，計算每106個脾細胞中抗體分泌細胞數量。藻酸鹽包裹實驗1. 將藻酸鈉溶于無菌生理鹽水，終濃度為1.5%；2. 收集培養的腫瘤細胞，用無血清的培養基洗滌1次，將細胞沉淀重懸于1.5%藻酸鈉溶液中；3. 將上述腫瘤細胞懸浮液用1 ml加樣槍緩慢滴入磁力攪拌的250 mM CaCl2溶液中，形成乳白色的藻酸鹽小珠。繼續靜置于250 mM CaCl2中30 min即可使用。以上操作步驟均在無菌條件下進行；4. 將第4次免疫后7天的小鼠用苯巴比妥鈉0.1ml (按100 m