1、第四章 DNA的分離、合成與測序 一、填空題 1不同的宿主細胞其核酸酶的活性是不同的，如細菌中的HBl01菌株及JM系列的宿 主菌所含核酸酶的活性比DHl、LE392等菌株-。 2SDS是分離DNA時常用的一種陰離子除垢劑，它有四個作用： (1)-一； (2)-一； (3)-； (4)-一; 3酚是蛋白變性劑，用酚抽提細胞DNA時，具有兩方面的作用：(1)- 2)-一。 4用酚氯仿抽提DNA時，通常要在氯仿或酚氯仿中加少許異戊醇。這是因為：異戊醇-一。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機溶劑相維持穩定。 5同其他水解蛋白酶相比，蛋白水解酶K具有兩個顯

2、著的優點：(1)- (2)-。 6在分離DNA時要使用金屬離子螯合劑，如EDTA和檸檬酸鈉等，其目的是 7用乙醇沉淀DNA時，通常要在DNA溶液中加入單價的陽離子，如NaCl和NaAc，其目的是-。 8 濃縮DNA的方法有：(1)-(2)-(3)(4)-。 9通常可在三種溫度下保存DNA：45、-20、70，其中以最好。 10.用于分離質粒DNA的細菌培養濃度達到08X109細胞ml時，即可通過離心收集菌體。收集菌體使用定角轉子，離心的速度以-為宜。 11引物在基因工程中至少有4個方面的用途：(1)-(2)-3)-(4)-。 12Clark發現用Taq DNA聚合酶得到的PCR反應產物不是平末

3、端，而是有一個突出堿基末端的雙鏈DNA分子。根據這一發現設計了克隆PCR產物的-。 13在用SDS分離DNA時，要注意SDS的濃度，01和1的SDS的作用效果是不同的，前者-，后者-。 14堿解法和清亮裂解法是分離質粒的兩種常用的方法，二者的原理是不同的，前者是根據-，后者則是根據-。 15在DNA分離過程中，通常要進行透析，其目的是-。 16在分離質粒DNA的菌體培養過程中，加入氯霉素有兩個好處：(1)-(2)-。 17，在DNA分離過程中造成DNA分子斷裂的因素很多，主要有(1)- (2)-(3)-。 18在分離DNA時，常用-法、-法、法及-法等方法去除蛋白質。 19在DNA保存液中，常

4、加一滴氯仿，主要是起-作用。 20按照人們的意愿，改變基因中堿基的組成，以達到-的技術稱為-。 211955年，英國劍橋大學的第一個合成了具有3，5磷酸二酯鍵的TpT和pTpT為此獲得了-年的諾貝爾獎。 22可以用-除去DNA溶液中的氯化銫。 23在cDNA的合成中要用到S1核酸酶，其作用是切除在-. 24在簡并引物的設計中，常常要用到dI(次黃嘌呤)，原因是- 25在分離DNA時，要戴手套操作，原因是-。 26乙醇沉淀DNA的原理是-。 27簡并引物PCR主要是根據蛋白質的氨基酸序列設計引物來合成相應的基因。 28超離心法純化質粒DNA時， 選用CsCl作介質的優點是： (1)-一 (2)-

5、，從而使不同分子量的DNA分子得以分開。 29缺失突變的原理是缺失了-一 30用核酸酶Bal31作系列缺失突變，得到的產物是：-. 31SSC是由NaCl和檸檬酸鈉組成的試劑，其中NaCl的作用是使-，而檸檬酸鈉的作用是一-。 32在重蒸酚中加入01的8羥基喹啉及少量巰基乙醇，不僅可以防止酚的氧化還可以-的活性及-作用。 33對于HBl01及其衍生株不宜用煮沸法分離質粒DNA，其原因是-. 二、判斷題 1氯霉素擴增DNA時，加氯霉素的時間是重要的，因為加得太早，菌數不夠，加入時間過遲，菌齡過老，容易自溶。 2所謂引物就是同DNA互補的一小段RNA分子。 3脈沖凝膠電泳采用一個很強的電場來分離非

6、常長的DNA分子，其原理在于迫使DNA分子根據長度的不同而具有不同的速度，并按大小順序通過凝膠. 4. Agarose-EB電泳法分離純化CCC DNA原理是根據EB可以較多地插入到CCC DNA中，因而遷移速度較快。 5如果PCR的每一次循環都把上一次循環中合成的DNA都加了一倍，那么，10個循環就擴增了1000倍，20個循環就擴增了100萬倍，30個循環就擴增了10億倍. 6PCR既能用于擴增任何天然存在的核苷酸序列，又能重新設計任何天然核苷酸序列的兩個末端。 因此，任意兩個天然存在的DNA序列都能快速有效的擴增，并拼接在一起。 7最有效的制備純RNA的方法是讓其在細胞中超表達，然后提純。

7、 8大量制備已被克隆基因編碼蛋白產物的常用方法是體外轉錄和翻譯。 9通過報告基因與來自于目的基因上游和下游各種DNA片段的結合，研究基因的調控序列. 10溫度敏感突變型是非常有用的，在這些突變型中，可以通過對溫度的改變控制這些突變體中異常表型的出現。 11用人工合成的含有所需堿基變化的寡聚核苷酸，可以將特殊突變引入克隆的基因。 12蛋白質的氨基酸序列中各種重要信號都可以通過短氨基酸序列同報告蛋白的融合進行研究. 13簡并引物是根據已知DNA序列設計的引物群. 14在DNA貯存液中加一滴三氯甲烷，可防止真菌的污染。 15密碼的偏愛性是指不同種屬的生物對簡并密碼具有不同的使用頻率。 16插入到質粒

8、DNA中的EB可以用正丁醇抽提除去。 17堿法和煮沸法分離質粒DNA的原理是不相同的。 18酚法和堿法分離質粒DNA都要用溶菌酶破壁，但堿法用的溶菌酶的濃度要高。 三、選擇題(單選或多選) 1從細胞或組織中分離DNA時，常用蔗糖溶液，目的是：( ) (a)抑制核酸酶的活性 (b)保護DNA，防止斷裂 (c)加速蛋白質變性 (d)有利于細胞破碎 2不是所有松弛型質粒都需要進行擴增的，如pBS、pUC載體系統就不必進行氯霉素擴增，這是因為這些質粒的拷貝數很高，達到( ) (a)3050 (b)100200 (c)300400 (d)500700 3在亞磷酰胺化學法合成DNA中，影響產量的最關鍵步驟

9、是：( ) (a)脫三苯甲基反應 (b)偶聯反應 (c)氧化反應 (d)封端反應 4有兩種確定核酸中核苷酸序列的方法：化學序列分析法(Maxam-Gtbert)和酶學序列分析法(Sanger)。酶學測序法的基本原理優點是：( ) (a)堿基與特殊染料間不同的相互作用 (b)一個合成引物的延伸和DNA修復合成的可靠終止 (c)限制性位點與DNA末端標記的相關性 (d)可同時對DNA雙螺旋的兩條鏈進行測序 (e)反應是DNA特異的，RNA不會帶來干擾。這樣既減少純化步驟，也節約了開支 5CsCl-EB密度梯度離心法純化質粒DNA的原理是：( ) (a)氯化銫可以較多地插入到線狀DNA中去 (b)氯

10、化銫可以較多地插入到SCDNA中去 (c)EB可以較多地插入到線狀DNA中去 (d)EB可以較多地插入到SCDNA中去 6關于cDNA的最正確的提法是：( ) (a)同mRNA互補的單鏈DNA (b)同mRNA互補的雙鏈DNA (c)以mRNA為模板合成的雙鏈DNA (d)以上都正確 7在分離mRNA的溶液中，Mg2+離子的濃度不能低于05mmolL，因為低了，( ) (a)mRNA會降解 (b)mRNA會沉淀 (c)核糖體解體 (d)mRNA會變性 8用堿法分離質粒DNA時，染色體DNA之所以可以被除去，是因為：( ) (a)染色體DNA斷成了碎片 (b)染色體DNA分子量大，而不能釋放 (

11、c)染色體變性后來不及復性 (d)染色體未同蛋白質分開而沉淀 9下面哪一種特性不是密碼所具有的? ( ) (a)偏愛性 (b)簡并性 (c)重疊性 (d)連續性 10用SDS-酚來抽提DNA時，SDS的濃度是十分重要的，當SDS的濃度為01時，( ) (a)只能將DNA抽提到水相 (b)只能將RNA抽提到水相 (c)可將DNA、RNA一起抽提到水相 (d)DNA和RNA都不能進入水相 11關于堿解法分離質粒DNA，下面哪一種說法不正確?( ) (a)溶液工的作用是懸浮菌體 (b)溶液的作用是使DNA變性 (c)溶液的作用是使DNA復性 (d)質粒DNA分子小，所以沒有變性，染色體變性后不能復性

12、 12異戊醇的作用是：( ) (a)使蛋白質脫水 (b)使DNA進入水相 (c)幫助DNA進入水相 (d)減少氣泡，促進分相 13松弛型質粒： ( ) (a)在寄主細胞中拷貝數較多 (b)可用氯霉素擴增 (c)一般沒有選擇標記 (d)只有(a)和(b)是正確的 14關于PCR擴增停滯的原因有很多種，但下列各項中，( )項不是主要原因。 (a)底物(模板)過剩 (b)dNTP的大量消耗 (c)產物的聚集 (d)非特異性產物的競爭性抑制 15Clark做了一個有趣的實驗，發現Taq DNA聚合酶可以不需要模板，在雙鏈DNA的 末端加一個堿基，主要是加( ) (a)dGTP (b) dATP (c)

13、dCTP (d)dTTP 16在簡并引物的3端盡量使用具有簡并密碼的氨基酸，這是因為( ) (a)Taq酶具有一定的不精確性 (b)便于排除錯誤堿基的摻人 (c)易于退火 (d)易于重組連接 17變色的酚中含有氧化物，這種酚不能用于DNA分離，原因主要是：( ) (a)氧化物可使DNA的磷酸二酯鍵斷裂 (b)氧化物會改變pH值 (c)氧化物同DNA形成復合物 (d)氧化物在DNA分離后不易除去 四、簡答題 1PCR反應包括引物與DNA模板鏈間的解鏈與復性。討論循環溫度范圍對引物-DNA 雙螺旋穩定性的影響及對PCR產率的影響。 2Sanger的雙脫氧法測序的原理。 3分離DNA時，為什么要在緩

14、沖液中加入一定濃度的EDTA和蔗糖? 4PCR的基本原理是什么?用PCR擴增某一基因，必須預先得到什么樣的信息? 5說明合成接頭在基因工程中的主要作用。 6從細菌中分離總DNA，應采取哪些措施獲得高分·子量的DNA? 7用酚抽提蛋白質時，離心后，為什么蛋白質總是會停留在水相和酚相之間? 8分離pBR322 DNA可考慮用氯霉素擴增，分離pUCl8質粒DNA則不必用氯霉素擴增，為什么? 9溶菌酶是破碎細菌細胞的有效方法。但有些細菌的孢子對溶菌酶不敏感，應該如何處理? 10假定你從黏質沙雷氏菌中克隆了一個基因，并推測可能是依賴于鋅的金屬蛋白酶，因為它含有兩個組氨酸和一個谷氨酸與鋅形成鋅指

15、結構，請你設計個方案，改變其中一個組氨酸看看是否改變蛋白酶的活性？ 11你打算擴增下圖所示的兩段序列之間的DNA，請從所列出的引物中選出合適的一對。 5-GACCTGTGGAAGCCATACGGGATTG-3 3-CTGGACACCTTCGGTATGCCCTAAC-5 引物1 引物2 5'-GACCTGTGGAAGC 5-CATACGGGATTG 5-CTGGACACCTTCG 5-GTATGCCCTAAC 5'-CGAAGGTGTCCAG 5-GTTAGGGCATAC 5'-GCTTCCACAGGTC 5-CAATCCCGTATG 五、問答題1   用于克隆的DNA在質量上有什么要求?2   為什么從細胞中分離DNA時往往會斷裂？3   為什么苯酚要重蒸飽和后才能用于DNA的分離？4   為什么氧化變色的酚不能直接用于DNA的分離？5   在DNA的分離過程中，酚通常與氯仿聯合使用，即使不聯合使用也要在苯酚抽提后用氯仿再抽