1、來氟米特對膠原性關節炎大鼠CD4+CD25+調節性T細胞的影響    作者：王婷玉 李俊 金芝貴 吳飛華       2011-11-23 9:56:41   來源：畢業論文網    摘 要 目的：探討來氟米特對膠原性關節炎中免疫抑制性CD4+CD25+調節性T細胞的作用。方法：II型膠原誘導Wistar大鼠，建立膠原性關節炎模型；檢測關節炎大鼠多發性關節炎評分，每周2次；流式細胞儀檢測脾淋巴細胞中CD4+CD25+調節性T細

2、胞的比例；RT-PCR檢測脾淋巴細胞中Foxp3 mRNA的表達。結果：與模型組比較，來氟米特（2 mg/kg，灌胃給藥15 d）明顯降低CIA大鼠多發性關節炎評分。與關節炎模型組比較，藥物干預組CD4+CD25+調節性T細胞的比例升高，轉錄因子Foxp3 mRNA的表達增高。結論：來氟米特具有抑制關節炎大鼠關節腫脹的作用，該作用可能和促進CD4+CD25+Treg產生和增加Foxp3的表達有關。關鍵詞關節炎 來氟米特 CD25中圖分類號：R392.5 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533(2011)11-0548-03Effect of leflunomide on CD4+CD25

3、+ regulatory T cells in collagen-induced arthritis rats*WANG Ting-yu1，LI Jun2，JIN Zhi-gui1，WU Fei-hua1，JIN Jian1，TANG Ting-ting3，4（1. Department of Pharmacy，Shanghai Ninth People s Hospital，School of Medicine at Shanghai Jiao Tong University，Shanghai，200011；2. School of Pharmacy，Anhui Medical Univer

4、sity，Hefei，230032；3. Shanghai Key Laboratory of Orthopaedic Implant，Shanghai，200011；4. Department of Orthopaedic Surgery，Shanghai Ninth People s Hospital，School of Medicine at Shanghai Jiao Tong University，Shanghai，200011）ABSTRACTObjective: To investigate the effect of leflunomide on the immunosuppr

5、essive CD4+CD25+ regulatory T cells (CD4+CD25+ Tregs) in collagen-induced arthritis (CIA). Methods: CIA was induced by collagen type II in Wistar rats. Polyarthritis indexes were checked twice a week. Immunofluorescence flow cytometry and RT-PCR were used to determine the proportion of CD4+CD25+ Tre

6、gs and the expression of Foxp3 mRNA in the splenocytes of CIA rats，respectively. Results: Leflunomide (2 mg/kg，ig×15 days，day 10-24) could significantly decrease the polyarthritis indexes in CIA rats. Compared with model CIA rats，administration of leflunomide could significantly increase the nu

7、mber ofCD4+CD25+ Tregs and the expression of Foxp3 mRNA in spleen lymphocytes of CIA rats. Conclusions: The results demonstrated that the inhibition of arthritis by leflunomide was related to changes in CD4+CD25+ Tregs.KEY WORDSarthritis；leflunomide；CD25類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis, RA）存在著持續性滑膜炎癥及進展

8、性軟骨和骨破壞，是一種炎性、自身免疫性疾病。來氟米特是一種疾病調修藥物，廣泛應用于RA的治療1。動物實驗研究表明，來氟米特能抑制足趾腫脹和關節破壞2。臨床研究發現，來氟米特能夠延緩RA疾病進展、改善患者的癥狀、提高患者的生活質量1。CD4+CD25+調節性T細胞(CD4+CD25+ regulatory T cells, CD4+CD25+Tregs)是一種免疫抑制性T細胞，其表面高表達CD25（IL -2R），占外周血CD4+ T細胞的5%103。大量動物實驗結果證實，CD4+CD25+Tregs在維持自身免疫耐受和預防自身免疫性疾病中起著關鍵作用4。轉錄因子Foxp3特異性表達于CD4+C

9、D25+ Tregs5，使之區別于活化的CD4+ T細胞。Foxp3的表達對于CD4+CD25+Tregs的產生和功能維持是必要的，是CD4+CD25+Tregs的特異性標志物之一。鑒于來氟米特的免疫抑制性和CD4+CD25+Tregs的重要作用，本文將研究來氟米特對膠原性關節炎大鼠CD4+CD25+Tregs的影響，探討來氟米特是否通過上調CIA大鼠體內的CD4+CD25+Tregs、從而抑制大鼠體內過度增殖的T淋巴細胞并最終抑制關節炎癥的。1材料和方法來氟米特由美國欣凱公司上海代表處提供；II型膠原（CII）、弗氏不完全佐劑（IFA）購于Sigma公司；小鼠抗大鼠FITC-CD4抗體、小鼠

10、抗大鼠PE-CD25抗體及同型對照購于Caltag公司；Trizol reagent購于Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒購于Promega公司。Wistar大鼠30只，體重(110±20) g，隨機分成正常組、CIA模型組和來氟米特用藥組。將CII溶入0.1 mol/L的乙酸中配成2 g/L，4 攪拌過夜，與等體積IFA混合，充分乳化。將乳劑0.5 ml分多點注射至大鼠背部皮內，1周后同法繼續注射。正常組大鼠注射等量生理鹽水。第1024天，用藥組灌胃給予2 mg/kg來氟米特，正常組和模型組給予等體積生理鹽水。采用多發性關節炎指數評價來氟米特對CIA大鼠的治療作用。1.4CD4

11、+CD25+ T細胞的檢測致炎后第35天，股動脈放血處死大鼠，無菌制備大鼠脾淋巴細胞懸液（1×106/ml），加入FITC-CD4和PE-CD25抗體，4 避光孵育30 min，PBS洗滌后上流式細胞儀檢測，計算CD4+CD25+ T細胞占CD4+ T細胞的比例。1.5Foxp3 mRNA的檢測采用Trizol 法提取脾淋巴細胞總RNA，AMV 逆轉錄酶逆轉錄得到cDNA。PCR引物委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成。Foxp3上游：5 - TAATATGCGGCCCCCTTTCACCTA -3；Foxp3下游：5 - GGCCCCCGTCCATGTTTTCTTG -3。-ac

12、tin上游：5 - GATATCGCTGCGCTCGTCGTC -3；-actin下游：5 - GTCCCGGCCAGCCAGGTCCAG -3。PCR擴增35個循環，PCR 產物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳。計量資料數據以x±SEM表示，組間比較采用SPSS 13.0統計軟件中One-Way ANOVA分析。P0.05為有統計學差異。2結果與正常組比較，CIA模型組大鼠造模10 d后大鼠關節腫脹度顯著增加，肢體持續紅腫，逐漸出現關節畸形。來氟米特（2 mg/kg）可明顯抑制CIA大鼠多發性關節炎指數（表1）。2.2來氟米特對CIA大鼠脾淋巴細胞中CD4+CD25+ T細胞的影響結果如

13、圖1所示，與正常組相比，CIA組CD4+CD25+ T細胞的比例明顯降低。來氟米特能明顯提高CIA大鼠CD4+CD25+ T細胞的比例。2.3來氟米特對CIA大鼠脾淋巴細胞中Foxp3 mRNA表達的影響與正常組相比，CIA大鼠脾淋巴細胞中Foxp3 mRNA的表達明顯降低，來氟米特可明顯提高CIA大鼠脾淋巴細胞中Foxp3 mRNA的表達（圖2）。3討論疾病調修藥來氟米特在臨床上被廣泛用于類風濕性關節炎的治療，其作用機制可能與抑制淋巴細胞的活性有關6，但是具體機制未明。本文選取多發性關節炎指數進行評估，結果表明來氟米特能明顯減少CIA大鼠的多發性關節炎評分，說明來氟米特對CIA大鼠的多發性關

14、節炎具有治療作用。近年來研究發現，CD4+CD25+Tregs對自身反應性T細胞的抑制作用在維持自身免疫耐受中起著關鍵作用。Gonzalez-Rey 等7發現，血管活性腸肽治療CIA與其促進CD4+CD25+Tregs的產生有關，清除小鼠體內的CD4+CD25+Tregs有利于關節炎的形成8。抗TNF-抗體通過抑制炎癥上調功能性CD4+CD25+Tregs9。本文中，我們發現CIA大鼠體內CD4+CD25+Tregs數量降低。CD4+CD25+Tregs數量不足，引起CD4+CD25+Tregs的免疫抑制功能不足，導致CIA大鼠體內Th1細胞所致的免疫反應作用增強，最終致使CIA大鼠體內免疫功

15、能失調，關節炎癥持續存在。來氟米特灌胃給予CIA大鼠后能明顯提高CIA大鼠脾淋巴細胞中CD4+CD25+ T細胞的比例。來氟米特治療CIA可能與其提高CIA大鼠CD4+CD25+Tregs的數量有關。Foxp3基因最初是在Scurfy小鼠中發現的，小鼠Foxp3基因位于染色體XA1.1，全長30 858 bp，編碼蛋白含431個氨基酸。人Foxp3基因位于染色體Xp11.23，有11個外顯子，編碼一個48 kD的蛋白Scurfin。轉錄因子Foxp3選擇性表達于CD4+CD25+Tregs，是CD4+CD25+Tregs的高度特異性標記，直接參與CD4+CD25+Tregs的發育和功能維持。在

16、CD4+CD25- T細胞中異位表達Foxp3能使其具有CD4+CD25+Tregs的表型和功能10。Valencia等11研究發現，給予RA患者抗TNF-抗體治療后，患者CD4+CD25+Tregs中Foxp3 mRNA和蛋白的表達水平均提高，同時伴隨著CD4+CD25+Tregs抑制功能的提高。更重要的是，CD4+ T細胞活化后并不能誘導Foxp3的表達。因此，檢測Foxp3的水平能較真實地反映CD4+CD25+Tregs的水平和功能，是目前公認的反映CD4+CD25+Tregs的“金標準”。我們用RT-PCR法檢測脾淋巴細胞中Foxp3 mRNA的表達水平。結果表明，CIA大鼠脾淋巴細胞

17、中Foxp3 mRNA的表達明顯低于正常大鼠脾淋巴細胞中Foxp3 mRNA的表達。這與前面流式細胞術分析的脾淋巴細胞中CD4+CD25+ T細胞的比例結果是一致的，說明CIA大鼠體內CD4+CD25+Tregs的數量和功能均較正常大鼠降低。重要的是，給予CIA大鼠來氟米特治療后，其脾淋巴細胞中Foxp3 mRNA的表達顯著升高，同時伴隨著CD4+CD25+Tregs的數量提高。提示來氟米特能明顯提高CIA大鼠體內CD4+CD25+Tregs的數量和功能，這可能是來氟米特治療CIA的新的作用機制。參考文獻1 Sharp JT，Strand V，Leung H，et al. Treatment

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