1、原位雜交組織化學常用試劑及處理 一、雜交前準備 （一）DEPC水是經DEPC處理過的滅菌蒸餾水。 DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可滅活各種蛋白質，是RNA酶的強抑制劑。原位雜交在雜交及其以前的各步處理中，所有液體試劑都應經DEPC處理。方法是：取市售DEPC 1ml，加入1L待處理水（蒸餾水等）中，經猛烈振搖后，于室溫靜止數小時，然后高壓滅菌，以除去降解DEPC（DEPC分解為CO2和乙醇）。有些試劑可直接加入DEPC，終濃度一般為0.1%0.4%，原則上在雜交及其以前的步驟中，所有液體試劑均需用DEPC處理，或用DEPC水配制，包括乙醇的稀釋。此外，接觸

2、標本以及標本有關的空中的洗滌也需DEPC水洗滌。 注意：DEPC是一種潛在的致癌物質，在操作中應盡量在通風的條件下進行，并避免接觸皮膚。含有Tris緩沖液的溶液中，不能加入DEPC。 （二）載玻片的處理 組織原位雜交，常在載玻片上進行，故載玻片的洗滌至關重要，必須保持清潔，并且不能有任何核酸的污染。處理方法如下： （1）先經洗衣粉浸泡過夜，次日自來水沖洗后，泡酸數小時以上，取出后再用流水沖洗，雙蒸水沖洗23次，置160以上烤箱中燒烤4h以上，或經15磅高壓滅菌20min。經以上處理可清除載片上的核酸酶。 （2）HCl處理法 （三）硅化 【方法】（1）將一扎新的蓋玻片散開，在通風條件下于0.1m

3、ol/L的HCI中煮20min,等其冷卻后,倒掉鹽酸。 （2）用去離子水沉漂洗玻片，豎放在架子上自然干燥。 （3）硅化蓋玻片：通風條件下，將單塊的蓋玻片在二甲二氯硅浣（dimethyldichorsilane,DMDC）液中浸幾下，豎入在架子上干燥。 （4）收集干燥的蓋玻片于一可耐熱的petri氏盤（或培養皿）中，用去離子水漂洗數次，徹底清洗。 （5）用鋁箔將裝有蓋玻片的培養皿包好，于180烘烤4h過夜。取出待冷至室溫后，即可進行后續處理。 附：2%DMDC 配制：按比例兩者充分混勻，靜止待氣泡消失即可使用。 用途：硅化玻片（載片、蓋片均可）。 【方法2】將經過洗凈的玻璃蓋片分散開放在一金屬網

4、中，并將該網放入一接有真空泵的干燥器中。同時，在干燥器中放一盛有約1m二甲二氯硅浣（dimethyldiorosilane,DMDC）的小燒杯。蓋好干燥器（確保密閉），抽真空約5min，然后讓空氣沖入。取出盛有蓋片的金屬網架，用錫箔紙包埋，于250以上烘烤4h以上，最好過夜。冷卻后備用。 本法可用于玻璃及塑料器皿的硅化。塑料器皿只能于60燒干。 【方法3】APES（氨丙基三乙氧基硅浣）法 【方法4】 （1）49ml氯仿與1mg二甲二氯硅浣（DMDC）配液； （2）倒入每個擬硅化的試管或離心 管中，浸泡5min后用乙醇或重蒸水沖洗； （3）玻璃器皿使用前位于180以上烘烤2h以上，塑料器皿應于6

5、0烘烤過夜。 注意：DMDC有毒且高度揮發，應于通風環境操作并戴口罩、手套，避免接觸皮膚或吸入。 （四）載片的包被（粘貼） 沾附劑 （1）多聚賴氨酸(poly-L-Lycine,PLL 儲備液（05%） 按上述劑量充分混合，即為濃度為5mg/ml(0.5%的PLL液。常分裝成1ml的包裝，-20存放。該液為儲備液，可反復凍融，無明顯影響。用前充分混合。 工作液（0.01%）： 充分混合，靜止待氣泡消失。 （2）明膠液 配法：先稱取明膠溶于500800ml DEPC水中，加熱攪拌助溶，待明膠完全溶解以后，加入甲明礬溶解后即可使用。注意，包被玻片時，明膠液溫度最好保持在60左右，效果最佳。方法同P

6、LL包被玻片。 2多聚賴氨酸包被玻片的制備方法（其它包被劑相同） （1）將事先準備好的經160以上烘烤，并冷卻至室溫的玻片（載片或蓋片），在0.05%（也有用0.1%）的PLL液中上下浸蘸幾下，分散開豎放在架子上，于空氣中自然干燥，4備用。注意：浸蘸時，務必使整個玻片完全浸于液體中，否則，包被不完全會產生標本脫落現象；干燥過程中注意避免塵埃污染；按上法處理的玻片通常可存放在一定時間（室溫1月以上，4更長），但仍建議盡早使用。 （2）多聚賴氨酸1mg溶于10ml滅菌的去離子水或1mmol/L的Tris-HCl緩沖液中（pH7.0），將其涂布于玻片上，待干燥后即可使用。該法包被的玻片可用于細胞涂片

7、和切片。 （3）將PLL工作液滴至蓋玻片上5l/片，用另一蓋玻片以推血涂片方法推片，或用另一蓋玻片緊貼于其上，相互磨擦以使兩蓋玻片相對的一面涂布上PLL。該法制備的玻片，只有一面是包被有PLL，故制備時，待其晾干后，應作好記號，然后保存后備用。 多聚賴氨酸可用于多種核酸雜交，方法簡單，結果可靠，有許多其它方法不可比擬的優點。配制好的液體可存放于4或室溫，但時間過長會解聚而失效，故建議使用時盡量新鮮配制。 （4）Vectabond粘附劑 該試劑是Vector公司新近推出的一種新型粘附劑。它與其它粘附劑的主要區別是：一般的粘附劑是通過物理性覆蓋在玻片表面，天長日久，可能由于包被不完全或局部脫落而致

8、切片等標本易于脫落。而Vectabond試劑是通過化學性作用，改變玻璃表面的分子結構，使標本貼附牢固，不易脫落，且保持時間長久，耗量小，價格便宜，一個包裝7ml可配成350ml工作液使用。操作程序： 標本（鋪片、切片等）丙酮（5min）Vectabond試劑工作液（5min）dH2O(2×5min干燥（溫箱，數小時過夜）用鋁 箔包好，室溫備用。 注意：制備和保存過程中避免污染。 經上述處理的載玻片一般可存放半年以上（4可更長）。 （五）硅魚精子DNA的制備 （1）在50ml滅菌聚乙烯管中加入1g鮭精DNA，加入15ml DEPC水使其浸泡5min至2h； （2）加入2.5ml 2mo

9、l/L HCl，室溫放置，DNA形成白色沉淀，充分振搖至沉淀物相互纏繞在一起，用吸頭尖端使之形成一球團狀（23min）； （3）加入5.0ml 2mol/L的NaOH。搖動小管使DNA懸浮、溶解，將小管置5015min助溶； （4）用DEPC水將混合物稀釋至175ml（總體積），充分混合，注意確保管內已無顆粒狀； （5）加入20ml/L 1mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH7.4）； （6）用2mol/L的HCl滴定至DNA溶解pH為7.07.5； （7）用無菌微孔濾膜過濾液體，去除顆粒。260nm測定溶液的OD值，方法是：取20l DNA液混合于980l水中，混勻后測定，吸收值乘以50

10、即為DNA濃度（g/ml）； （8）制備好的DNA液儲于-20備用，用前取出凍融后煮沸。 二、關于探針的標記 （一）cRNA探針的同位素標記 1標記液（轉錄標記） 2轉錄緩沖液 ：用地高辛或生物素標記時，用UTP替代。 3標記終止液 4標記探針水解液 先用dH2O懸浮探針，再加入后兩種試劑，輕輕振搖混合，于60條件下反應。 5探針水解時間 注：LO探針初始長度（kb） Lf探針的終長度（kb） K0.11kb/min 6探針水解終止液 每次加入充分混合，臨用前配。 7探針沉淀液 每次加入，充分混合，新鮮配制。 （二）寡聚核苷酸3端標記（cRNA探針） 1標記反應液 2終止液：0.2mol/L

11、EDTA 3.探針沉淀液 （三）cRNA探針非同位素標記（地高辛及生物素） 1標記液 ：生物素標記時為10mmol/L的生物素-11-UTP ：為檢測標記率而加。 2轉錄標記終止液 （1）0.2mol/L EDTA：用于地高辛標記法 （2）生物素標記終止液： （四）DNA探針標記常用試劑的配制 （1）10 ×缺口平移緩沖液：200mmol/L Tris-HCl,pH7.4含50mmol/L MgCl2;100mmol/L-巰基乙醇、1mg/ml BSA。 （2）缺口平移反應終止液：200mmol/L NaCl;10mmol/L Tris-HCl,pH7.4; 11mmol/L EDT

12、A; 0.5% SDS。 （3）DNase:干粉狀DNase(20003000u/mg溶于20mmol/L Tris-HCl, pH7.5中（1mg/ml）,10l分裝，-20保存一年。 （4）10×DNA聚合酶（Klenow片段）緩沖液：500mmol/L Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L MgCl2;10mmol/L DTT;0.5mg BSA。 （5）10×激酶緩沖液：500mmol/L Tris-HCl,pH7.4,50mmol/L MgCl2; 20mmol/L DTT; 1.0mmol/L亞精胺。 （6）10×隨機引物標記緩沖液；500

13、mmol/L Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L MgCl2;10mmol/L -巰基乙醇；500g/ml BSA。 （7）1×加尾緩沖液：100mmol/L二甲胂化鉀，pH7.0,1mmol/L CoCl2 0.2mmol/L DTT。 （ 8）1mol/L MgCl2:MgCl2 47.60g溶于500ml水中，100ml分裝，高壓滅菌，室溫保存。 （9）0.25mol/L EDTA(Ph8.0:EDTA 52.02g溶于400ml水中，調pH至8.0，加水至500ml，100ml分裝，高壓滅菌，室溫保存。 （10）4mol/L醋酸鈉：取無水醋酸鈉82g溶于200m

14、l水中，用醋酸調pH至6.5，加水至250ml，高壓滅菌，或0.45m膜過濾，室溫保存。 （11）10% SDS：10g SDS（十二烷基硫酸鈉）溶于50ml水中，加水至100ml，分裝后室溫保存。 （12）20×SSC：取NaCl 175.3g;檸檬酸鈉88.2g;加水至1000ml，用10mol/L NaOH調pH至7.0；高壓滅菌，室溫保存。 （13）無菌水：100ml去離子水或雙蒸水，分裝，高壓滅菌，室溫保存，開瓶后僅限一周使用。 （14）10×激酶緩沖液：500mmol/L Tris-HCl,pH7.4;100mmol/L MgCl2;50mmol/L DTT;1

15、0mmol/L亞精胺（非必需）。 （15）T4多聚核苷酸激酶：10u/l，保存在甘油中，-20。 （16）TE緩沖液（Tris/EDTA）：Tris,10mmol/L pH7.4(0.5ml 2mol/L貯存液，1.0mmol/L EDTA,pH8.0(20l 0.5mol/L貯存液，加水至100ml，室溫保存。 （17）2mol/L Tris-HCl pH7.4:Tris242.2g溶于850ml，加濃HCl 75ml ,邊加邊緩慢攪動，至pH7.4,于加水至1000ml。 （18）1mol/L DTT(二硫蘇糖醇：3.0g DTT溶于20ml水中，分裝，于-20貯存。 （19）0.5mol

16、/L EDTA（乙二胺四乙酸二鈉鹽）：在燒杯中先加入300ml水，加入93.5g EDTANa2?2H2O,充分混勻，加10mol/L NaOH調pH至8.0,加水至500 ml。 （20）10mol/L NaOH：200g NaOH溶于450ml水中，混勻，再加水至500ml。 （21）5mol/L NaCl：292.25g NaCl,加水至1000ml。 （22）1mol/L HCl：加86.2ml濃鹽酸至913.8ml水中。 （23）1mol/L CaCl2：147g CaCl2：2H2O,溶于1000ml水中,高壓滅菌,室溫保存。 三、固定劑 進行原位雜交的組織或細胞標本常需經固定處理

17、。盡管許多化學物質對組織/細胞有固定作用，但核酸原位雜交的理想固定液應具備如下特點：能很好地保持組織細胞的狀態；對核酸無抽提、修飾及降解作用；不改變被檢核酸分子在組織細胞內的定位；對核酸及探針的雜交過程無阻礙作用；固定液本身對雜交信號無遮蔽、掩蓋作用，如不使本底增加等；理化性質穩定、價格低廉。 14%多聚甲醛（Paraformaldehyde,PFA） 配法：稱取40g PFA溶于裝有500ml DEPC水的玻璃容器（燒杯或燒瓶）中，持續加熱磁力攪拌至6065，使成乳白色懸液。用1.0mol/L的NaOH值至7.0，使呈清亮狀（滴加），再加入約500ml 2×PBS，充分混勻（在冰浴

18、或冷水浴中），可再檢測一下pH，過濾后定容至1000ml，室溫或4保存備用。 注意：配制時應在通風條件下操作，并避免接觸皮膚和吸入（戴手套及口罩），因PFA有較強的固定作用及毒性，對粘膜及皮膚有固定及毒性，刺激作用；加熱時，溫度不宜 過高，常為6065，否則，PFA降解失效；配制好的PFA雖可存放一定時間，但過久的液體，固定效果下降，建議盡早使用。 附：固定液用PBS的配制： 配法：按上述比例稱取試劑，溶于DEPC水（也可用蒸餾水加DEPC）500800ml中，過濾后，加水定容至1000ml，高壓滅菌。通常配制成10×PBS的儲備液，2×PBS和1×PBS可用DE

19、PC水稀釋獲得。 除用DEPC水配制PFA外，也有用滅菌蒸餾水或經DEPC處理的0.010.1mol/L的PBS配制的，方法及注意事項同上。 4% PFA是目前原位雜交組織化學技術中最常用的固定液，它能較好地保持組織及細胞內的RNA，同時對形態保持也較好。通常組織塊固定412h，載片固定時間在1015min以內，RNA含量較為恒定。過度延長固定時間會引起細胞內生物大分子的過度交聯， 影響探針的穿透力，降低雜交效率。 2甲醛 10%甲醛（Formaldehyde, FA） 量取二者充分混合而可。較適于檢測RNA的組織及細胞固定，也可用于新鮮冰片切片后固定。 10%福爾馬林試劑： 較適于固定細胞。

20、 10%中性福爾馬林 市售甲醛100ml Na2HPO4 4g NaH2PO4 6.5g DEPC水1000ml 常用于石蠟樣品切片的固定。 10%的甲醛由于有促進DNA雙鏈分子交聯的作用，干擾DNA變性，故不適于DNA雜交。在組織或細胞原位雜交中，可通過使用含50%甲酰胺的雜交液使DNA變性解鏈而解決。這類固定液在DNA/RNA雜交中有較好的效果。 34%戊二醛效果較40%差。 40.1%戊二醛常用于固定組織，適于新鮮組織冰凍切片及石蠟切片的后固定，常用于檢測DNA的原位組織雜交方法。 5乙醇/醋酸（或冰醋酸）將乙醇與醋酸按3：1的體積比充分混合即可。該液較適于固定細胞的原位雜交，尤其檢測D

21、NA時。 乙醇/醋酸雖廣泛應用于原位雜交中，但RNA保留較差，可本底很低，即背景染色淡。 6甲醇/醋酸（3：1）用前按體積比3：1比例充分混合即可。 7甲醇/丙酮（1：1）適于培養細胞的原位雜交技術。 84%多聚甲醇-0.5% 1%戊二醛溶液在pH7.4磷酸緩沖液中，用于免疫電鏡樣品固定。 四、LB培養基 （一）液體LB培養基（Luria-Bertani培養基） 配制：取一1000ml的燒杯，將事先稱取好的試劑加入杯內，加H2O約500800ml攪拌使其溶解完全。用5N的NaOH調pH至7.0,加入H2O定容至1000ml。15磅高壓滅20min。 （二）瓊脂糖平板培養基 細菌培養用瓊脂（或瓊

22、脂糖）15g 液體培養基（如LB）1000ml 按濃度比例，將瓊脂加入液體培養基（如LB）中，稍加攪拌，用紗布或紙封好瓶口，15磅高 壓滅菌20min。 五、小量質粒提取主要液體 1溶液 2溶液 3溶液（3mol/L醋酸鈉） 加熱溶解后，再用冰醋酸（約40ml）調pH至4.8，補足H2O至200ml。 六、雜交前處理 1蛋白酶（Proteinawe K, Pro.K） 蛋白酶K主要用于雜交前標本處理，其作用是使組織達到一定消化，利于檢測分子的穿透，從而提高檢測方法的敏感性，但各種組織在不同條件下消化程度不一，因此，具體應用時，應根據組織種類、溫度確定反應時間及酶的濃度。過度消化可使組織形態結構

23、遭到明顯破壞，核酸分子也會受到影響。通常是將其配成儲備液（1mg/ml），臨用前，再配成工作液（約0.025mg/ml）。配制方法： 精心稱藥，將二者充分混合后，分裝成小份，-20存放，用時再取出凍融，余者棄去。 （2）工作液（臨用前配）： 取儲備液（1mg/ml）按1：40稀釋，充分混合，即得約含Pro.K為25mg/ml的工作液。 （3）關于P-K緩沖液的配制： 稱取上述試劑，充分混合即可。 1mol/L 的Tris-HCl(pH8.0： 先將Tris于800ml ddH2O中溶解，用HCl將pH調至8.0,ddH2O定溶于1000ml，高壓滅菌，室溫備用即可。 0.5mol/L的EDTA

24、： 稱取EDTA溶于約600ml ddH2O中，常需60持續攪拌以助溶，滴加NaOH至pH接近8.0時，EDTA才開始溶解。待完全溶解后，冷卻至室溫，NaOH調pH至8.0,ddH2O定溶至1000ml，高壓滅菌，室溫備用。 2甘氨酸 （1）1mol/L甘氨酸： 稱取甘氨酸75g溶于ddH2O或DEPC水中，最后補足ddH2O定容至1000ml，高壓滅菌備用。該液為儲備液，-20儲存。 （2）甘氨酸工作液（0.1mol/L）： 將二者按1：10比例稀釋，即得甘氨酸工作液。一般要求臨用前新鮮配制。 甘氨酸有終止蛋白酶K作用的作用，以防過度消化。 30.25%醋酸-0.25%醋酸酐 配制：按上述配

25、方，先以少許DEPC水溶解NaCl，然后加入三乙醇胺及濃HCl。DEPC水定容至約1000ml(997.5ml，臨用前，一邊搖動溶液一邊加入醋酸酐，充分混合。注意操作時避免濃HCl 濺出，最好在通風條件下進行。 生物體內有些組織，如神經組織中的蛋白質，對帶負電荷的核酸探針較易吸附。經該液乙酰化處理后，可使切片標本表現帶上負電荷，有排斥帶負電的核酸探針，減少非特異吸附，降低反應背景的作用。 4RNA酶溶液 取RNA酶A溶解于100ml DEPC水中，分裝成小份（1ml, 10mg/ml），-20儲存。 臨用前，取RNA酶A儲備液，用2×SSC溶解配成工作液（0.01mg/ml）. 5.

26、0.2% 取2ml Triton X-100加入998ml PBS中，充分振蕩使其充分混合。 七、雜交用液 1SSC（Standard Saline Citrate, SSC） 通常配成10×，20×，50×的儲備液，如下： 配制：先稱取上述兩種試劑，溶于約800ml ddH2O中， 滴加10N的NaOH，將pH值調至7.0，補足 ddH2O至1000ml，加入終濃度為0.1%0.2%的DEPC，分裝后高壓滅菌，可室溫保存。 該液主要用于配制予雜交液及雜交后的各種洗脫液，以保持一定的離子強度。此外，在用于雜交的濕盒內也常用5×的SSC以保持一定濕度。 2

27、Denhardts液 通常配成10×，50×或100×的儲備液 配制：稱取上述試劑，溶于800ml左右滅菌ddH2O中，定容至1000ml后，過濾后于-20保存備用。 該液用于配制雜交液及予雜交液等。 3雜交液及予雜交液 ：臨用前加；予雜交液不加 配制：先以去離子甲酰胺與SSC于室溫混合，加入硫酸葡聚糖于50促溶，依次加入其它成份。硫酸葡聚糖在室溫常需數小時才能完全溶解。有時需旋渦振蕩。定容后充分混合。根據使用方便可分裝（最好用鋁箔將瓶子包好）存于4，可達數月。注意，雜交緩沖液在使用前切忌污染。 變性被打斷的無關DNA（常為鮭精DNA或鯡精DNA）可在予雜交及雜交前加入。此外，有許多物質如肝素、多聚腺甘酸、醋酸鈉等多種成份，可根據需要加入雜交液中，上述配方所列只是不可缺少的基本成份。 配制好的雜交液不宜反復凍融，否則易產生硫酸葡聚糖沉淀現象。使用前最好加熱至50，使其充分溶解后再加入探針分子。至于探針的濃度視實驗目的、探針類型及標記方法而異。通常RNA探針分子濃度為0.52g/ml，DNA探針濃度為1g/ml,此外，如使用35S標記的探針，還需加入終濃度為100mmol/L的二硫蘇糖醇（Dithiothreitol,DTT