1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上細胞免疫熒光實驗步驟細胞免疫熒光實驗步驟 簡單實驗步驟如下:1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小時.2.-20度甲醇固定20分鐘后,自然、干燥 10分鐘3.PBS洗凈:3min34.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS5.PBS洗凈:25min6.羊血清封閉：度，分鐘.一抗，度過夜，一般要大于小時或者度小時.度PBS洗凈，min次.二抗度小于一小時.度PBS洗凈，min涼干封片（封閉液.） 活細胞免疫熒光技術(shù)流式細胞儀標本的制備（一）制備活性高的細胞懸液(培養(yǎng)細胞系、外周血單個核細胞、胸腺細胞、脾細胞等均可

2、用于本法)用10FCSRPMI1640調(diào)整細胞濃度為5×10×10ml取40l細胞懸液加入預先有特異性McAb(550l)的小玻璃管或塑料離心管，再加50l 120(用DPBS稀釋)滅活正常兔血清4 30min用洗滌液洗滌2次，每次加洗滌液2ml左右1000rpm×5min棄上清，加入50l工作濃度的羊抗鼠(或兔抗鼠)熒光標記物，充分振搖4 30min用洗滌液洗滌2次，每次加液2ml左右1000rpm×5min加適量固定液(如為FCM制備標本，一般加入1ml固定液，如制片后在熒光顯微鏡下觀察，視細胞濃度加入100500l固定液)FCM檢測或制片后熒光顯微

3、鏡下觀察(標本在試管中可保存57天)（二）試劑和器材1.各種特異性單克隆抗體。2.熒光標記的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗體，滅活正常兔血清。3.10 FCS RPMI1640, DPBS、洗滌液、固定液(見附錄)。4.玻璃管、塑料管、離心機、熒光顯微鏡等。（三）注意事項1.整個操作在4下進行，洗滌液中加有比常規(guī)防腐劑量高10倍的NaN，上述實驗條件是防止一抗結(jié)合細胞膜抗原后發(fā)生交聯(lián)、脫落。2.洗滌要充分，以避免游離抗體封閉二抗與細胞膜上一抗相結(jié)合，出現(xiàn)假陰性。3.加適量正常兔血清可封閉某些細胞表面免疫球蛋白Fc受體，降低和防止非特異性染色。4.細胞活性要好，否則易發(fā)生非特異性熒光染色。附:1. DPB

4、S (×10, 貯存液)NaCl 80gKCl 2g 蒸餾水加至1000mlNaHPO 11.5g 臨用時用蒸餾水110稀釋KHPO 2g2.洗滌液DPBS900mlFCS 50ml (終濃度5)4NaN?50ml (終濃度0.2)3.固定液DPBS1000ml葡萄糖20g (終濃度2)甲醛10mlNaN0.2g (終濃度0.02)4.玻璃管、塑料管、離心機、熒光顯微鏡等。（三）注意事項1.整個操作在4下進行，洗滌液中加有比常規(guī)防腐劑量高10倍的NaN，上述實驗條件是防止一抗結(jié)合細胞膜抗原后發(fā)生交聯(lián)、脫落。2.洗滌要充分，以避免游離抗體封閉二抗與細胞膜上一抗相結(jié)合，出現(xiàn)假陰性。3.加

5、適量正常兔血清可封閉某些細胞表面免疫球蛋白Fc受體，降低和防止非特異性染色。4.細胞活性要好，否則易發(fā)生非特異性熒光染色。附:1. DPBS (×10, 貯存液)NaCl 80gKCl 2g 蒸餾水加至1000mlNaHPO 11.5g 臨用時用蒸餾水110稀釋KHPO 2g2.洗滌液DPBS900mlFCS 50ml (終濃度5)4NaN?50ml (終濃度0.2)3.固定液DPBS1000ml葡萄糖20g (終濃度2)甲醛10mlNaN0.2g (終濃度0.02) 嚴重同意樓上的講解。我是做流式細胞分析的間接熒光，圖簡單加一抗后只洗滌一次，二抗后沒有洗滌，就直接加另外一個抗體，結(jié)

6、果做了好多次就是呈陰性反應！排除了好久才多洗滌了兩次，結(jié)果很是令人滿意。我想請問樓上：NaN哪里有賣？謝謝！我找過，發(fā)現(xiàn)它是一種化學工業(yè)產(chǎn)品，成桶成桶的賣，而且有劇毒啊！是不是不是同一種東東？ 我做的是zo-1的免疫熒光，步驟如下：1、細胞在蓋片上生長融合到95100時，從孵箱中取出。2、用預溫的1×PBS洗3次，每次10分鐘3、4的甲醛室溫固定2030分鐘4、1×PBS洗3次，每次10分鐘5、0.2Triton X100透化25分鐘6、1×PBS洗3次，每次10分鐘7、5%BSA室溫封閉30分鐘8、加一抗（用1BSA稀釋）放在濕盒里，4度過夜9、1×P

7、BS洗3次，每次10分鐘10、加二抗（用1BSA稀釋）30分鐘，閉光！11、1×PBS洗3次，每次10分鐘12、95甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀釋 從大鼠分離的T細胞能否直接做細胞免疫熒光 我做的大部分細胞爬片的免疫熒光步驟基本一致：1.取出細胞爬片放到35mm或60mm用過的細胞培養(yǎng)皿里，PBS洗三遍。注意：有的時候作的細胞爬片可能比較小，因此夾取的時候要小心，注意 反正面，放在皿里洗比較方便，避免了來回夾取，另外洗的時候加PBS不要太沖，不要細胞沖下來。洗的時候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，沒有等5分鐘或10分鐘。2. 4冷

8、的多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗三遍。3. 0.2Triton X100通透10分鐘，PBS洗三遍。4. 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，PBS洗三遍。5. 一抗4度濕盒內(nèi)過夜，也可37度2小時，感覺前者效果好，PBS洗三遍。6.二抗室溫2小時（避光），或者37度1半小時，PBS洗三遍。7.最好用DAPI染核，然后直接照熒光片。8.蒸餾水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因為甘油不象樹脂那樣會干，所以不用指甲油封的話會弄的一塌糊涂。建議：1.還是染完之后沒有封片前直接照一些，因為有的時候可能封片會出現(xiàn)問題，再想照反而沒有了，另外不要拖太長時間，熒光會崔滅的。2.熒光的片子一定要避光保

9、存，保存的好的話，過一段時間仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定離心，不然有的時候有那種沉淀，在片子上就是一個很大的非特異性熒光光點，非常難看。 我要做的是occludin，可是效果不是很好，可以用甲醇固定嗎，和甲醛比那個合適 各位同仁:我現(xiàn)在急于做人乳腺癌細胞MCF-7的免疫熒光實驗，目的是測凋亡時，基因bax、bcl-2的蛋白表達變化。不知道怎么選一抗和二抗試劑盒。請高手指教。萬分感謝！能發(fā)一個郵件更好，再一次感謝！我的E-mail：hudaxj2005 抗淬滅劑可拿來直接封片,20微升即可.之后片子可保留更長時間 bu不是原創(chuàng) 我是做懸浮細胞THP-1的，是人單核細胞系，主要問題是懸浮細胞在洗滌以及孵育次數(shù)多了會越洗越少，請問各位怎么洗法細胞不會變少。（離心轉(zhuǎn)速比較重要，還有有人說離心后上清不用移液器吸，直接倒比較好，我也試過，可還是越來越少） 頂一下 我也遇到